Name: 生殖系化学毒性的利用线虫综合评估秀丽隐杆线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习利用秀丽隐杆线虫进行生殖系化学毒性高通量评估的方法。该方案通过荧光报告基因监测非整倍体胚胎，为毒理学研究提供可靠的体内筛选工具。

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作者感谢以下资助来源：NIH ES020353 以及高露洁棕榄替代研究资助奖，这些支持使本工作得以完成。

1. 喂养细菌的制备
注意：本部分介绍喂养细菌（E. coli 菌株 OP50）的制备方法。
<ol>
	<li>从溶菌肉汤（LB）琼脂平板上分离一株大肠杆菌（E. coli）OP50 单菌落，并无菌接种至 300 ml 经高压灭菌的 LB 液体培养基中。</li>
	<li>将接种后的培养物置于摇床中，在 200 rpm、37 °C 条件下培养过夜，直至达到饱和生长。</li>
	<li>将 OP50 菌液转移至 6 个无菌且预先称重的 50 ml 锥形管中，于 6,000 rpm（5,000 × g）离心 5 分钟，使细菌沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，用 50 ml 无菌 M9 缓冲液重悬菌体并洗涤，重复两次。</li>
	<li>第二次洗涤后，彻底去除残留的 M9 缓冲液，确保管内无任何 M9 残留。</li>
	<li>通过称量含有细菌沉淀的离心管重量，减去 50 ml 锥形管的皮重，计算出菌体沉淀的重量。</li>
	<li>用 M9 缓冲液将菌体沉淀重悬至浓度为 100 mg/ml。</li>
	<li>将 OP50 菌悬液于 4 °C 保存，待用于线虫培养时使用。</li>
</ol>
2. 线虫生长培养基（NGM）培养皿的制备
注意：本部分介绍NGM培养皿的制备方法，该培养皿用于在实验室中常规培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）。
<ol>
	<li>将NGM琼脂培养基进行高压灭菌。</li>
	<li>采用无菌操作，使用蠕动泵将17 ml NGM琼脂溶液分装至6 cm的培养皿中。 
	注意：培养皿中琼脂量保持恒定，可减少在更换培养皿时重新调焦显微镜的需要。</li>
	<li>将培养皿在室温下放置2–3天后再使用，以使琼脂充分凝固，并让多余水分蒸发。</li>
	<li>采用无菌技术在NGM培养皿上接种。加入1–2滴OP50液体培养物，并用玻璃棒涂布均匀。注意不要将细菌菌苔涂至培养皿边缘。</li>
	<li>将接种后的OP50菌苔在室温下培养1–2天，然后用于培养线虫。</li>
</ol>
3. 同步线虫群体的制备
注意：C. elegans 的生命周期包括胚胎期、四个幼虫期（L1-L4）和成虫期。本部分描述了制备年龄同步化线虫群体的方法。经漂白处理后，所有与 C. elegans 接触的材料必须保持无菌。
<ol>
	<li>第1天 – 准备产卵成虫线虫群体
	<ol>
		<li>使用线虫群体主要为饥饿状态L1幼虫的NGM平板。</li>
		<li>用无菌线虫挑取器收集L1幼虫，并将其转移至接种了OP50的新鲜6 cm NGM平板上。在20 °C下培养约65小时，直至大多数线虫发育为产卵成虫。为避免平板过度拥挤并确保线虫生长过程中不会耗尽细菌，每个新鲜NGM平板上转移的L1幼虫簇不宜超过一至两个。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天 – 建立同步化的L1幼虫群体
	<ol>
		<li>用1–2 ml M9缓冲液冲洗NGM平板以收集产卵成虫，并将其转移至一个15 ml锥形离心管中。</li>
		<li>让产卵成虫在15 ml锥形离心管底部沉降约5–10分钟。小心移除上清液，避免扰动线虫沉淀。</li>
		<li>将线虫沉淀转移至2–4个微量离心管中，加入1 ml次氯酸钠/氢氧化钠溶液。室温孵育2–3分钟。在体视显微镜下监测反应进程，确认所有成虫均已死亡。漂白时间不得超过5分钟，否则可能导致胚胎死亡。</li>
		<li>以3,000 rpm（900 × g）离心1分钟收集线虫。弃去上清液，加入1 ml无菌M9缓冲液以中和反应。</li>
		<li>用M9缓冲液洗涤线虫两次，每次以3,000 rpm（900 × g）离心1分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入M9缓冲液至终体积100–200 µl。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管，取一滴线虫/M9混合液滴加至洁净的NGM平板上，在20 °C下至少孵育24小时，使胚胎孵化。 
		注意：在无食物条件下，幼虫的生长将在L1阶段停滞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天 – 建立同步化的L4幼虫群体
	<ol>
		<li>用1–2 ml M9缓冲液冲洗洁净的NGM平板，收集L1幼虫，并将其转移至一个15 ml锥形离心管中。</li>
		<li>让死亡的成虫在15 ml锥形离心管底部沉降约5分钟。</li>
		<li>将含有L1幼虫的上清液转移至新的15 ml锥形离心管中，以2,600 rpm（1,000 × g）离心2分钟沉淀线虫。</li>
		<li>弃去上清液，残留约500 µl液体。</li>
		<li>使用体视显微镜，通过计数10 µl液滴中的线虫数量来确定M9溶液中线虫的浓度。至少计数5个液滴。</li>
		<li>将线虫浓度调整为20–25条线虫/µl，取50 µl线虫/M9混合液接种至接种了OP50的NGM平板上。</li>
		<li>在15 °C下孵育65小时（可跨周末孵育），使同步化的L1群体发育至L4阶段。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在96孔板中对线虫进行化学物质处理
注意：本部分描述了使用含有 Pxol1::gfp 转录报告基因的 C. elegans 菌株来筛选非整倍体诱导的方法。
<ol>
	<li>用 1–2 ml M9 液体从干净的 NGM 平板上收集 L4 期幼虫，并将其转移至一个 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>让 L4 期线虫在 15 ml 锥形管底部沉降约 5–10 分钟。小心移除上清液，避免扰动线虫沉淀。</li>
	<li>加入 3–5 ml M9 液体，使用体视显微镜通过计数 10 µl 液滴中的线虫数量来确定 M9 溶液中的线虫浓度。每个样品至少计数 5 个液滴。</li>
	<li>将线虫重悬于 M9 液体中，调整浓度至 1,000 条线虫/ml。</li>
	<li>用 M9 液体将第 1 节中的 OP50 菌液稀释 10 倍。确保重悬的菌液恢复至室温，因为较低温度会影响线虫发育。</li>
	<li>使用多通道移液器，先向 2 ml 深孔圆底 96 孔板的每个孔中加入 100 µl 线虫/M9 混悬液（来自步骤 4.4），然后加入 400 µl 稀释后的 OP50 菌液（来自 步骤 4.5）。最终每孔体积为 500 µl，含 100 条线虫。</li>
	<li>向目标孔中加入 0.5 µl 待测化合物或相应的对照物，使终浓度建议为 100 µM，该浓度在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的化学筛选中常用12。乙醇或 DMSO 溶剂对照的终浓度设为 0.1%。 
	注意：我们建议使用诺考达唑（nocodazole，100 µM）作为阳性对照。</li>
	<li>使用粘性封板膜密封板子。确保密封严密，防止孔间交叉污染。</li>
	<li>用铝箔纸包裹板子。</li>
	<li>将板子置于适当温度的摇床中（170–180 rpm），振荡培养适当时间（24 或 65 小时）。环境温度会影响线虫生长，应维持温度在约 20 °C。</li>
</ol>
5. 在384孔板中对怀卵线虫进行图像采集
注意：本节描述了使用高内涵显微镜对暴露的 Pxol1::gfp 蠕虫进行成像，以观察成年雌雄同体子宫内胚胎中GFP的表达情况。每块待筛选的384孔板，需使用来自4块96孔板的蠕虫。
<ol>
	<li>在摇床中进行化学暴露后，将96孔板静置10-15分钟，使成虫沉降到孔板底部。</li>
	<li>使用多通道移液器小心移除350 µl M9溶液，注意不要扰动孔板底部的线虫。</li>
	<li>用1 ml M9溶液清洗线虫，并重复步骤5.1。</li>
	<li>使用多通道移液器小心移除1 ml M9溶液，注意不要扰动孔板底部的线虫。</li>
	<li>使用多通道移液器将残余M9中的线虫重新悬浮，从96孔板中吸取100 µl线虫/M9混合液，加入黑色孔壁/透明孔底的384孔板的孔中。重复此操作，使用来自4块96孔板的线虫，直至填满384孔板的所有孔。 
	注意：为提高图像采集过程中自动对焦的效率和速度，所有孔中的液体体积必须保持一致。每个孔应含有80至100条线虫。</li>
	<li>向每个孔中加入1 µl左旋咪唑（100 µM），让线虫孵育约30分钟。 
	注意：左旋咪唑作为乙酰胆碱受体激动剂，可使线虫 immobilize（固定不动）。</li>
	<li>将孔板转移至具备自动成像功能的宽场高内涵显微镜。</li>
	<li>进行图像采集时，根据制造商的指南使用高内涵图像采集与分析软件。选择4X物镜，每孔采集1张图像。</li>
	<li>开始图像采集前，将GFP成像参数调整为曝光时间45毫秒，图像分辨率为2,160 x 2,160。</li>
	<li>数据以每孔中GFP阳性线虫数占该孔线虫总数的比例进行收集，后者在各孔之间相对一致。</li>
</ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+in+humans%3A+incidence%2C+origin+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li>
<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方法是首次用于鉴定生殖系毒性物质的大规模策略。该方法需要使用一种携带GFP转基因Pxol-1::GFP的线虫品系，该品系能够准确报告早期胚胎非整倍体的诱导情况，从而作为生殖系功能障碍的替代指标。该方法包括对秀丽隐杆线虫（C. elegans）种群进行精确同步化处理，随后在96孔板中暴露于化学物质，最后通过自动化的高内涵显微成像技术对表达GFP的线虫进行成像分析。
本方案中有多个步骤对结果的一致性至关重要。首先，线虫群体应具有高度同步性，以最大限度地获得正确发育阶段的L4幼虫用于暴露处理。为此，本文所述方法包含了两个同步化步骤：首先通过次氯酸钠漂白法处理线虫群体，随后进行L1幼虫期的饥饿同步。该方法的第二个重要参数是暴露时间的长短。通常将线虫暴露于24小时或65小时。由于减数分裂在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中是一个连续过程，这两个暴露时间段分别可用于捕获减数分裂晚期事件的异常（24小时），或同时捕获减数分裂早期和晚期事件的异常（65小时）。但需注意的是，较长时间的暴露似乎更能预测哺乳动物的生殖毒性10<...

美国注册用于商业的化学品大约有 87,000 种，但其中仅有少数经过潜在健康效应的测试1。在已测试的化学品中，仅有一部分评估了其对生殖健康的影响，部分原因在于难以确定哺乳动物早期生殖事件的改变，尤其是在雌性生殖细胞发育与分化过程中。事实上，雌性哺乳动物的第一次减数分裂事件发生在胚胎发育的早期阶段，因此难以获取并收集到足够数量的样本用于筛选研究。
生殖系在世代之间提供了至关重要的联系，其正常功能依赖于一种复杂的细胞和染色体分裂程序——减数分裂——的精确执行。减数分裂过程的失调可能导致生育力下降，并产生染色体数目异常的配子和胚胎，这种情况称为非整倍体。减数分裂中染色体分离错误与人类健康密切相关。染色体异常较为常见，发生频率约为每150例活产婴儿中就有1例，其中以21三体、18三体、13三体以及X和Y染色体异常最为普遍2,3。此外，先天性畸形（包括染色体来源的畸形）是美国婴儿死亡的首要原因4。环境因素可能影响染色体分离和行为这一观点并非新近提出5，但目前仍知之甚少。因此，深入研究当前释放到环境中的哪些化学物质正在干扰人类生育能力、早期发育及整体生殖健康，具有重要意义。
鉴于哺乳动物模型的这些局限性，我们开发了一种高通量筛选方法，用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测生殖毒性。我们充分利用了这一常用遗传模型系统的多个重要特性，例如体型小、成本低、繁殖周期短、生殖细胞比例高以及操作简便6。线虫可在96孔板中或大量液体培养物中培养，且由于其身体透明，可直接在培养板上进行成像，以检测荧光报告基因的表达。下述实验方法正是利用了这些特性，并采用携带荧光报告基因Pxol-1::GFP的线虫品系，以检测生殖系功能紊乱及胚胎非整倍体的诱导情况。
使用该报告基因菌株的依据在于，在主要为雌雄同体的线虫群体中，雄性个体的出现通常极为罕见。这些雄性个体（&#60;0.2%）自然源于X染色体分离错误7然而，由于生殖系破坏常导致常染色体和异染色体分离错误，因而与雄性表型发生率升高（X染色体分离错误）以及胚胎致死（常染色体分离错误）相关。为了在规避胚胎致死问题的同时便捷地检测雄性个体的诱导情况，可采用一种雄性特异性启动子（xol-1用于在仍位于线虫子宫内的早期胚胎中驱动GFP的表达。因此，GFP表达胚胎的出现被用作非整倍体胚胎存在的替代指标。该方法此前已被用于鉴定与生殖系维持和减数分裂相关的基因。8,9该品系适用于化学筛选，可用于中高通量筛选。重要的是，该品系能够真实反映化学物质的致非整倍性，因此与哺乳动物生殖终点相关10该检测方法对制药和化工行业中的毒理学家尤为有用，可快速评估化学品对生殖终点的毒性。此外，该检测方法完全符合政府在《21世纪毒性评估》中强调的优先事项。st 世纪报告11.

<table><tbody><tr><td>60 mm 有孔，锐边培养皿</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>顶点</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96孔透明圆底2 ml聚丙烯深孔板</td><td>康宁</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>顶点</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-胰蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; OP50</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; 目标=&quot;_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>乙醇 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS 系统</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸镁（MgSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress 高内涵成像采集 &amp;分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>用于生物培养的人造丝薄膜</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ 745</td><td>该显微镜的总放大倍数范围为3.35X至300X。任何具有类似特性的显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>TY2441 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;Pxol-1::GFP&lt;/em&gt; 报告菌株</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; 目标=&quot;_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

利用线虫 caenorhabditis elegans 对生殖系化学毒性进行综合评估

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

确定环境中数千种化学物质的生殖毒性一直是环境健康领域最具挑战性的难题之一。这部分是由于缺乏能够（1）准确重现生殖过程关键特征，并且（2）以中高通量方式进行、同时无需使用大量脊椎动物的模型系统。
本文描述了一种在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行的检测方法，可通过监测非整倍体胚胎的产生来快速鉴定生殖系毒性物质。利用一种GFP报告基因品系，由生殖系功能紊乱导致的染色体分离错误可通过自动化荧光显微镜轻松观察和定量。因此，针对特定化合物库的毒性筛选可在96至384孔板体系中于数日内完成。对初筛阳性结果可进一步开展次级分析，以确定染色体异常是源于减数分裂过程的紊乱，还是早期胚胎染色体分离错误所致。总体而言，该检测方法为化学物质暴露后生殖系功能障碍的快速评估提供了一种高效的初筛策略。

暴露于 Pxol-1::GFP 报告菌株对化学试剂（如微管毒物诺考达唑）的反应图1)与DMSO对照相比，可导致暴露的成年雌雄同体线虫子宫内出现高比例的GFP表达胚胎。GFP阳性胚胎的荧光强度明显强于其他胚胎中的微弱背景荧光以及动物肠道中观察到的自发荧光。将暴露后的线虫直接在384孔板上进行成像，统计每孔中至少含有一个GFP阳性胚胎的线虫数量，并以该孔中线虫总数进行归一化处理。化学筛选中的阳性结果定义为：该化合物诱导线虫群体中GFP阳性胚胎的比例达到DMSO对照组的1.7倍以上。10. 经过阈值优化后，进行高内涵图像分析（参见 材料 文件）可实现对阳性物体数量的自动计算（即， 胚胎数占孔中线虫总数的比例，是该检测方法大规模应用时的首选方案。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>从饥饿状态的线虫群体开始，以获...

我们描述了在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中用于评估生殖系毒性的高通量化学检测方法的详细步骤。在该检测中，通过使用特异性识别非整倍体胚胎的荧光报告系统，监测化学物质暴露后生殖系功能的异常变化。

利用线虫 Caenorhabditis elegans 对生殖系化学毒性进行综合评估

识别我们环境中存在的数千种化学物质的生殖毒性一直是……中最引人关注的挑战之一

本实验的总体目标是利用线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）全面评估生殖系化学毒性。首先，通过向混合发育阶段的C. elegans PX481 GFP品系线虫群体中加入稀释的漂白液，使线虫同步化。此步骤可产生大量由卵壳保护而免受漂白液影响的胚胎。第二步是通过让胚胎在无食物的液体中孵化，以获得同步化的L1幼虫群体。接着，线虫生长至第四幼虫期（L4），此时将其在液体中暴露于目标化学物质，持续65小时。最后一步是通过荧光显微镜观察线虫子宫内胚胎中GFP报告基因的表达情况。最终，与DMSO对照组相比，GFP阳性胚胎所占的比例反映了被测化合物的抗原性。该技术相较于现有方法（如Rodin模型或细胞培养检测）的主要优势在于，我们能够在完整的动物模型中评估化学物质的致基因性及生殖系毒性，同时进行高通量检测操作。今天的主讲人为博士后研究员Dr. Daniella Perotti。该实验所用的线虫此前已按照配套的实验方案文本所述方法准备完毕。用一到两毫升M9缓冲液冲洗线虫生长培养基（NGM）平板上的GR线虫，并将其收集至15毫升锥形管中。让GR线虫在15毫升锥形管底部静置沉降约5到10分钟。随后，在不扰动线虫沉淀物的情况下，移除上清液。将线虫沉淀转移至两到四个微量离心管中，每管加入一毫升稀释的次氯酸钠溶液。室温孵育两到三分钟。在体视显微镜下监测反应进程，以确认所有线虫均已死亡。漂白时间不得超过五分钟，否则胚胎可能死亡。在3000 RPM条件下，离心一分钟收集线虫。移除上清液，并加入一毫升无菌 M9 液体以中和反应。确保经过漂白处理后的线虫所接触的所有材料均为无菌。用 M9 培养基将线虫清洗两次。去除上清液，加入 100 至 200 微升 M9 液体。使用玻璃巴氏吸管，将一滴线虫 M9 混合液加到干净的 NGM 平板上，于 20 摄氏度培养至少 24 小时，使胚胎在无食物条件下孵化。幼虫的生长将在 L1 阶段停止，完成两个同步化步骤。采用漂白和 L 型饥饿处理是因为必须获得高度同步的幼虫群体，以最大化可用于暴露实验的 L4 期幼虫数量。在成功建立同步化的 L1 期幼虫群体后一天，从透明的 NGM 平板上收集 L1 期幼虫。用一到两毫升 M9 缓冲液冲洗平板，并将 L1 期幼虫转移至 15 毫升锥形管中。让死亡的成虫在15毫升锥形管底部沉淀约五分钟。收集含有L1幼虫的上清液至新的15毫升锥形管中。在2,600 RPM条件下离心两分钟，使虫体沉淀。弃去上清液，保留约500微升。通过计数10微升液滴中的线虫数量，确定M9溶液中线虫的浓度。使用体视显微镜至少计数五个液滴。用M9缓冲液将线虫浓度调整为每微升20至25条，然后取50微升线虫M9混合液加入已铺有OP50大肠杆菌的NGM平板中。在15摄氏度下培养65小时，使同步化的L1期群体发育至L4期。该筛选实验采用一种CL对抗菌株，该菌株含有荧光转录报告系统，用于检测生殖系紊乱及胚胎非整倍体的诱导情况。用一到两毫升的M9缓冲液冲洗干净的NGM平板，收集L4期幼虫，并转移至15毫升的锥形离心管中。让L4期线虫在15毫升锥形离心管底部静置沉淀约5到10分钟。随后小心移除上清液，避免扰动虫体沉淀物。加入三到五毫升 M 九溶液，通过计数 10 微升液滴中的线虫数量来确定 M 九溶液中线虫的浓度。使用体视显微镜对每个样本至少计数五个液滴。将线虫重悬于 M 九溶液中，浓度为每毫升一虫。将先前制备的OP 50菌液用M9培养基稀释十倍。确保重悬的菌液达到室温，因为较低温度会影响线虫发育。使用多通道移液器，首先向96孔深孔圆底板的每个孔中加入100微升线虫M9混合液。最后，向每个孔中加入400微升稀释后的OP 50菌液。每个孔中加入100条线虫，总体积为500微升。向目标孔中加入0.5微升待测化合物，使终浓度达到100微摩尔。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的化学筛选中，常用0.1%的乙醇或DMSO溶剂作为对照，以该终浓度作为阳性对照。使用 100 微摩尔浓度的无共溶剂溶液。使用封板膜密封板孔。务必密封良好，以防止孔与孔之间的交叉污染。用铝箔包裹培养板。将培养板转移至适当温度的摇床中，振荡适当时间。在化学物质暴露结束后，线虫的生长受温度影响，因此需将室温维持在约20摄氏度。使用多通道移液器将96孔板静置10至15分钟，使成虫沉降到孔板底部。小心移除每孔中的350微升M9溶液，注意不要扰动孔底的线虫。用1毫升M9溶液洗涤线虫，然后再次将孔板静置10至15分钟，使成虫沉降到孔底。从每个孔中移除一毫升M九培养基，操作时需非常小心，避免扰动平板底部的线虫。将剩余M九培养基中的线虫重新悬浮。从96孔板中收集100微升线虫与M九培养基的混合液，加入到黑色壁透明底的384孔板的孔中。使用4个96孔板中的线虫重复此过程，直至384孔板的所有孔均完成加样。为确保图像采集过程中自动对焦的效率和速度，所有孔中的液体体积必须保持一致。接下来，向每个孔中加入1微升lale，让线虫孵育约30分钟。Lale 作为一种乙酰胆碱受体激动剂，可使蠕虫麻痹。将培养板转移至具备自动成像功能的宽视野高内涵显微镜。根据制造商的指南，使用高内涵图像采集与分析软件。选择 4 倍物镜，每个样本采集一张图像。将GFP成像参数调整为曝光时间45毫秒，图像分辨率为2160 × 2160。开始图像采集，将暴露的线虫直接在384孔板上进行成像。对每个孔中至少含有一个GFP阳性胚胎的线虫数量进行计数，并除以该孔中线虫的总数，进行归一化处理，如下所示。暴露于微管毒物 no-code AOL 等化学试剂后，与 DMSO 对照组相比，表达 GFP 的胚胎比例显著升高。GFP 阳性胚胎的荧光强度明显强于其他胚胎中观察到的微弱背景荧光，以及动物肠道中观察到的自发荧光。红色箭头指示在经 no-code AOL 处理的线虫子宫内清晰可见的 GFP 阳性胚胎。完成此操作后，可进一步进行其他方法，例如对线虫进行DNA染色，以更详细地观察化学品对生殖系的影响。该技术可使毒理学领域的研究人员快速评估化学品的生殖毒性和生殖系毒性。

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