比较非洲化蜜蜂与欧洲蜜蜂所产蜂粮中的营养成分及其对血淋巴蛋白浓度影响的方法

以下实验的总体目标是定量分析两种蜜蜂亚种所采集的花粉及蜂粮中的营养成分，并测定其蛋白质摄食量。该目标通过在封闭区域内向欧洲蜜蜂和非洲蜜蜂提供相同的花粉源，使其将花粉储存在蜂群中转化为蜂粮来实现。随后，将这些蜂粮饲喂给在笼中饲养的 newly emerged 欧洲蜜蜂和非洲蜜蜂。

随后，在饲喂 4 天、7 天和 11 天后对蜂笼中的蜜蜂进行取样，并测量每个蜂笼中剩余蜂粮的量以估算其消耗情况。最后，测定并比较欧洲蜜蜂和非洲化蜜蜂所采集的花粉及所酿蜂粮中营养物质（包括蛋白质和氨基酸）的浓度。结果显示，蜂粮在蛋白质含量、某些氨基酸浓度以及血淋巴蛋白滴度方面均不同于原始花粉。

该方法有助于解答蜜蜂营养研究中的关键问题，例如花粉来源对蜂粮中营养成分的影响，以及不同亚种和基因型的蜜蜂如何获取这些营养物质。本技术由本实验室的学生技术员艾米丽·沃特金斯·德·扬（Emily Watkins de Young）进行示范。首先，在蜂群上安装花粉采集器后收集花粉，并使用咖啡研磨机将花粉研磨成细粉。建立五个蜂群，分别为非洲化蜜蜂（A HB）和欧洲蜜蜂（EHB），置于封闭飞行区（EFA）内，以确保蜜蜂仅采集所提供的花粉，防止工蜂在EHB和A HB蜂群之间发生迁移。将EFA划分为相互隔离的若干区域，使蜜蜂无法在各区域间穿梭。在EFA的每个区域中放置一个独立的EHB或A HB蜂群，每群包含3,500至4,000只工蜂、蜂蜡巢脾、花蜜、蜂蜜、未成熟蜂蛹以及空巢脾。通过在EFA每个区域中放置托盘，并在托盘上铺撒约60克研磨花粉，向蜂群提供花粉饲料。

通过这种方式，采集蜂可以将花粉作为团状物收集，并将其储存在蜂群中作为蜂粮，用于喂养笼中的蜜蜂。将来自意蜂（HB）和东非蜂（EHB）蜂群的封盖工蜂房框分别放入环境室内的独立羽化笼中，环境室温度设置为32至24摄氏度，相对湿度为40%。当工蜂羽化后约24小时，建立12个有机玻璃生物测定笼，每个笼中放入100只新羽化的EHB或HB工蜂，并在每个笼中放置一段蜂巢，其中含有已知数量的欧洲蜂蜂粮（European bbr 或 EBB）或非洲化蜂蜂粮（Africanized B bread 或 A B, B）巢房，以形成以下处理条件。

将HB喂食A-B-B-E-H-B，HB喂食A B，BAHB喂食EBB，以及EHB进行喂食。EBB向每个笼子中添加水和按体积配制的30%蔗糖溶液的小瓶。在为期11天的研究期间，每天更换糖浆和水的小瓶。

在将蜜蜂放入蜂笼之前，采集10只新羽化的EHB以及A型HB工蜂的样本，将其记为第0天的B型蜂，并用作血淋巴蛋白浓度的基线参照。在蜜蜂分别取食EBB或A型B、B型蜂4天、7天和11天后，从每个蜂笼中各取出10只蜜蜂。

将活蜜蜂分别放入 Falcon 管中，并置于冰袋上。在第 11 天取样后，选取四个蜜蜂的亚样本用于血淋巴蛋白浓度分析，统计每个蜂群中仍含有蜂粮的巢房数量。将每个蜂箱中剩余的蜂粮从巢房中取出，按蜂箱分别存入不同的微量离心管中。

将BBR样品在负80摄氏度下保存，直至进行pH可溶性蛋白质浓度和氨基酸含量分析。进行蛋白质分析时，从每个蜂箱中取六份花粉样品以及一份EBB和一份ABB样品。取20毫克花粉或BBR样品与1毫升0.1摩尔PBS混合，涡旋振荡10秒，然后在571.2 × g下离心1分钟。

取25 µL S上清液样品，加入96孔平底E-I-A-R-I-A聚苯乙烯板的一个孔中。每个样品重复加样三个孔。加热20 µL毛细管的一端，并拉伸加热区域，直至形成针状尖端。

然后用毛细管插入每个蜂笼中采集的蜜蜂胸部右侧靠近翅基部的位置，吸取血淋巴。若需要，可将同一根毛细管插入腹部体节间的膜质区域，收集额外的淋巴液。将1微升血淋巴加入9微升0.1摩尔的磷酸盐缓冲液（PBS）中。

使用 Bradford 蛋白质测定试剂盒，并按照制造商说明书操作以测定总可溶性蛋白质。根据文中所述方案进行氨基酸分析，如这些图所示，bbr 中的 pH 值和蛋白质浓度均低于花粉。如本处所示，EHB 和 A HB 消耗的 A BB 均多于 EBB。

无论消耗何种类型的花粉，A型蜂（A HB）血淋巴中的可溶性蛋白水平均显著高于欧洲蜂（EHB）。尽管EHB与A型蜂对各类花粉的摄食量相似，但其血淋巴蛋白水平仍存在上述差异。在蜜蜂所需的10种必需氨基酸中，除组胺外，其余均在花粉中被检测到。

在大多数情况下，蜂粮中测得的氨基酸浓度高于花粉中的浓度。例如，与花粉相比，蜂粮中亮氨酸和苏氨酸的浓度高出约60%，缬氨酸浓度高出约25%。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺的含量在蜂粮中也高于花粉。

除苯丙氨酸和胱氨酸外，A B、B 和 EBB 之间的氨基酸浓度差异不大。A BB 中的苯丙氨酸水平约为 EBB 或花粉的两倍。EBB 中的胱氨酸浓度低于 A、B、B 或花粉。

观看本视频后，您应能充分了解如何测定蜂粮、花粉及蜜蜂血淋巴中的蛋白质浓度。通过这些技术，您可以确定食物储存与摄取以及血淋巴蛋白质浓度是否受到遗传或环境因素的影响。