利用腺相关病毒作为工具研究疾病中的视网膜屏障

本实验的总体目标是研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性。首先将含有GFP转基因的AAV颗粒注射到玻璃体或血液中，随后在注射后的不同时间点采集血液样本，以此实现上述目标。

血液采样辅以每周一次的活体眼底成像。最后一步是对视网膜平铺片和视网膜冷冻切片进行免疫组织化学染色。最终通过共聚焦显微镜和PCR检测ILM完整性的转导模式指示剂，并检测血液中的AAV颗粒，从而证明血-视网膜屏障的通透性。

该技术相较于现有方法的主要优势在于，AAV灌注法能够提供其他细胞无法给出的血-视网膜屏障通透性信息。该技术的应用意义延伸至AAV介导的基因治疗领域，因为它有助于确认AAV颗粒对血-视网膜屏障的通透性，从而避免潜在的不良副作用。该方法还可用于研究糖尿病大鼠等其他视网膜疾病动物模型中内界膜的完整性。

当我们观察到DP 71基因敲除小鼠模型的视网膜出现血-视网膜屏障破坏，并且其转导效率高于野生型视网膜时，我们首次提出了该方法的设想。

首先麻醉C-57黑六J小鼠。检查三种反射是否消失：翻正反射、回缩反射和尾部夹捏反应。

这些反射的消失可确认麻醉成功。接下来，用滴管将5%新福林（neosynephrine）和0.5%散瞳剂（mydriaticum）滴加到角膜上，以扩大瞳孔。然后使用兽用眼膏润滑眼睛，防止过度干燥。现在，用超细30号一次性针头吸取含有1至4×10¹¹个AAV-GFP颗粒的储备液。

通常，初学者在操作此方法时会遇到困难，因为他们必须在不接触晶状体或视网膜的前提下完成最安全的玻璃体内注射。随后，将一根超细的一次性30号针头经赤道部并靠近角膜缘处穿入玻璃体腔。将针头插入眼内后，在观察针头位于玻璃体腔中心位置的同时，注入一微升溶液。

在内界膜实验中，使用一只眼作为对照，而在血-视网膜屏障实验中则需对双眼均进行注射。注射后，对每只注射眼局部应用抗炎和抗菌治疗。一周后，使用新福林（neosynephrine）和散瞳剂（mydriaticum）散大瞳孔，并使用眼底相机进行眼底检查。

在注射后一周、两周、一个月和两个月时，通过观察追踪GFP表达。从安乐死后的注射动物中取出眼睛，解剖以去除晶状体和角膜。随后将解剖后的眼睛在4%多聚甲醛中浸泡固定1小时。1小时后，在室温下用10%蔗糖对眼睛进行 cryo-保护处理1小时。然后在室温下用20%蔗糖浸泡眼睛20分钟。

最后，将眼球置于 30% 蔗糖溶液中，4°C 条件下过夜。次日，使用包埋介质（如冷冻包埋剂）对眼球组织进行包埋并冷冻。随后使用冷冻切片机切出 10 µm 的切片，并将其贴附于已预处理的冷冻组织载玻片上。

现在用去垢剂对载玻片上的切片进行透化处理，持续5分钟。随后用PBS短暂洗涤两次。然后在室温下封闭眼球1小时。

为了便于制备视网膜平铺标本，将摘除的眼球在4%多聚甲醛中固定15至30分钟，以利于解剖。此步固定以及解剖后的固定必须充分进行，因为这对保存GFP荧光至关重要。固定15至30分钟后，解剖眼球，去除角膜和晶状体。

通过在锯齿缘和视神经周围进行切割，将视网膜与视网膜色素上皮层及巩膜分离。解剖完成后，将视网膜浸入4%多聚甲醛中固定30分钟，以固定组织及转导视网膜细胞中的荧光蛋白。固定后，用pH 7.4的无菌PBS洗涤标本5分钟。

然后将 PBS 更换为封闭缓冲液，在室温下孵育视网膜 4 小时，或在 4 摄氏度下过夜孵育。开始标记步骤时，将样品与一抗在封闭缓冲液中孵育，孵育条件为室温 4 小时或 4 摄氏度过夜。应用一抗后，用 PBS 洗涤组织 3 次，然后将组织在封闭缓冲液中与 Alexa Fluor 标记的二抗按 1:500 稀释比例孵育。

冰冻切片孵育1小时，平铺样本孵育2小时，于室温下进行，并避光。二抗孵育完成后，如前所述用PBS洗涤三次以去除未结合的二抗。

现在，对视网膜进行减张切口，以便将其平铺在载玻片上，使感光细胞或视网膜神经节细胞朝上。加入水性封片剂并加盖盖玻片。载玻片可在共聚焦显微镜成像前于4°C保存。

首先制备用于检测循环AAV颗粒的阳性对照。在注射AAV之前，先采集10至20微升的血液样本。然后，在麻醉后将100微升的病毒储存液注入血液中。

将物质注入血液的较简便途径是阴茎静脉。在本视频片段中，我们注射蓝色染料以作为注射操作的可视化对照。接下来三天内定期采集少量血样，随后处死小鼠。从组织样本中使用商业试剂盒提取基因组DNA，并以所提取的DNA为模板，采用一对GFP特异性引物进行PCR扩增。运行30个循环，每个循环的延伸时间为45秒，退火温度为55摄氏度。预期SHH 10载体在DP 71基因敲除小鼠中的转导模式会增强。若动物模型显示内界膜结构存在异常，则表明DP 71基因敲除小鼠的视网膜屏障功能受损，因此在DP 71基因敲除小鼠中进行玻璃体内注射SHH 10可更有效地靶向米勒胶质细胞，具有重要的比较研究价值。

这表明与野生型对照组相比，该转基因小鼠品系的内界膜发生了去稳定化。注射AAV5-GFP也显示了内界膜具有通透性。AAV5通过玻璃体内注射在野生型小鼠中无效，但在视网膜屏障受损的小鼠（如DP71基因敲除小鼠）中，其向光感受器细胞的基因递送能力显著增强。

通过PCR分析发现，DP71基因敲除小鼠的血-视网膜屏障对AAV颗粒仍具有选择性，因为在玻璃体内注射后，其血液样本中未检测到AAV的存在。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用腺相关病毒，通过分析视网膜的转导模式或血液中AAV颗粒的存在情况，来检测内界膜的完整性或血-视网膜屏障的通透性。