Name: 使用腺相关病毒作为一种工具来研究疾病中的视网膜障碍 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 了解如何利用腺相关病毒评估视网膜疾病动物模型中的血-视网膜屏障通透性和内界膜完整性。该方法通过GFP报告基因标记视网膜神经元和胶质细胞，结合共聚焦显微镜与PCR检测，为基因治疗策略提供重要依据。

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我们感谢巴黎视觉研究所成像平台的支持。感谢法国肌肉萎缩症协会（AFM）为O.V.提供博士奖学金，以及艾尔建公司（Allergan INC.）的支持。本工作在LIFESENSES卓越实验室（LABEX）[项目编号ANR-10-LABX-65]框架内进行，获得了由法国国家科研署（ANR）管理的法国国家资金支持。我们感谢Peggy Barbe和Mélissa Desrosiers在AAV制备方面的技术协助。我们衷心感谢Stéphane Fouquet在共聚焦显微镜技术上的出色支持，以及在结果解读方面提供的专业指导。

本研究中使用的所有动物均按照眼科与视觉研究动物使用ARVO声明的规定进行饲养和处理。
1. 通过瞬时转染 HEK-293 细胞生产重组腺相关病毒（rAAV）17,18
注：参见 McClure C, JoVE (2011)19。
<ol>
	<li>纯化大量质粒制备物（至少 1 mg/ml）的 AAV 载体质粒。使用 3 种质粒：携带复制和衣壳基因但不含 AAV 反向末端重复序列 ITR 的 AAV 辅助质粒，携带 AAV ITR&#160;的转基因表达盒（称为转移质粒），以及提供腺病毒辅助基因 E2、E4 和 VA RNA 基因的质粒（称为 pHELPER）。</li>
	<li>使用聚乙烯亚胺（或其它转染试剂）将上述 3 种质粒共转染至 293 细胞中。转染效率需高于 80%，以获得良好的病毒产量。</li>
	<li>通过碘克沙醇梯度从 293 细胞裂解液中纯化重组 AAV。使用 15%、25%、40% 和 60% 的碘克沙醇形成梯度。收集含有 AAV 颗粒的 40% 碘克沙醇组分，在 500,000 × g 条件下超速离心 1 小时后浓缩，并用含 0.001% Pluronic 的 PBS（磷酸盐缓冲盐水）&#160;进行缓冲液置换。</li>
	<li>为测定病毒基因组滴度20，进行 DNA 酶和蛋白酶 K 消化处理，随后进行定量 PCR（QPCR）。上下游引物扩增位于 AAV2 ITR 中的 62 bp 区域。质粒标准品使用 FAM 标记的探针，并配有黑孔淬灭剂（BHQ）。</li>
	<li>在最终体积为 25 μl 的体系中进行 qPCR（定量聚合酶链式反应），体系包含 340 nM 反向 ITR 引物、100 nM 正向 ITR 引物、100 nM AAV2 ITR 探针、0.4 mM dNTPs、2 mM MgCl₂、1× Platinum Taq 缓冲液、1 U Platinum Taq 酶以及 5 μl 模板（标准品、样品和无模板对照）。</li>
	<li>对于标准品，使用用于转染的质粒进行 7 次 10 倍系列稀释（每份 5 µl，浓度从 2 × 109 至 2 × 103 拷贝/ml，最终浓度为 1010 至 104 拷贝/ml）。</li>
	<li>程序起始为 95 °C 下 15 分钟的初始变性，随后进行 40 个循环：95 °C 变性 1 分钟，60 °C 退火/延伸 1 分钟。短期储存可置于 4 °C，长期储存则应置于 -20 °C。</li>
</ol>
2. AAV 的玻璃体内注射
<ol>
	<li>使用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对C57BL6J小鼠进行麻醉，并验证翻正反射、屈肌反射和尾夹反应的消失，以确认麻醉效果充分。通过角膜滴用5%新福林和0.5%散瞳灵眼药水使瞳孔散大。在麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。</li>
	<li>将一次性超细30 G针头穿过赤道部并紧邻角膜缘插入玻璃体腔（参见Chiu K, JoVE (2007)21）。在直接观察下将针头置于玻璃体腔中央，注射1 µl含有1至4 × 1011 vp的ShH10-GFP或AAV5-GFP的储存液（图1）。在ILM实验中，使用单眼作为对照。在BRB实验中，则双侧眼球均需注射。对注射后的眼睛局部使用抗炎和抗菌治疗。</li>
	<li>使用新福林和散瞳灵眼药水散大瞳孔以便成像。使用眼底相机进行眼底检查，分别在玻璃体内注射后1周、2周、1个月和2个月时观察GFP（绿色荧光蛋白）&#160;的表达情况（图1）。注射后1至2个月，通过吸入CO2处死小鼠。</li>
</ol>
3. 免疫组织化学
<ol>
	<li>对于视网膜冷冻切片（图1），解剖摘除的眼球以去除晶状体和角膜，并在4%多聚甲醛中浸没固定1小时。
	<ol>
		<li>将先前固定的眼球在室温下用10%蔗糖溶液 cryoprotect 1小时，再用20%蔗糖溶液在室温下继续 cryoprotect 1小时。随后在30%蔗糖溶液中于4 °C过夜 cryoprotect。冷冻后将眼杯包埋于Cryo-matrix等包埋介质中。制备厚度为10 µm的冷冻切片，并将其贴附于专用于冷冻组织切片、可增强染色过程中组织粘附性的载玻片上。</li>
		<li>用含0.1% Triton X-100的PBS（pH 7.4）&#160;对切片进行通透处理，持续5分钟。用PBS洗涤两次，随后在含1% BSA和0.1% Tween 20的PBS中室温封闭1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于视网膜平铺标本（图1），将摘除的眼球在4%多聚甲醛中固定15分钟，以利于后续解剖操作。
	<ol>
		<li>在15至30分钟内解剖眼球，去除角膜和晶状体。通过在锯齿缘和视神经周围进行切割，将视网膜从视网膜色素上皮（RPE）和巩膜上分离。随后将其浸入4%多聚甲醛中再固定30分钟，以固定视网膜及转导后视网膜细胞中的荧光蛋白（总固定时间不得超过24小时）。用无菌PBS（pH 7.4）洗涤5分钟。</li>
		<li>将PBS更换为封闭缓冲液（含1% BSA、2%正常山羊或驴血清、0.5% Triton X-100的PBS），并在封闭缓冲液中于室温孵育4小时，或于4 °C过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织在封闭缓冲液中与一抗孵育，孵育条件为室温4小时或4 °C过夜。用PBS洗涤3次。 
	注意：所使用的一抗如下：抗层粘连蛋白抗体（1/1,000），用于标记内界膜（ILM）；抗视紫红质单克隆抗体4D2（1/500），用于标记视杆细胞；抗谷氨酰胺合成酶单克隆抗体GS-6（1/1,500），用于标记Müller细胞；PNA凝集素（1/40），用于标记视锥细胞。</li>
	<li>将组织在封闭缓冲液中与Alexa Fluor标记的二抗按1:500稀释比例孵育，冷冻切片在室温避光孵育1小时，平铺标本则孵育2小时。用PBS洗涤3次。</li>
	<li>在视网膜上做减张切口，将其平铺于载玻片上，光感受器层或视网膜神经节细胞（RGC）层朝上。加入水溶性封片介质，加盖盖玻片后于4 °C保存。</li>
	<li>在激光扫描共聚焦显微镜上进行共聚焦成像。采用逐线顺序扫描方式采集图像，以减少激发光与发射光之间的串扰。根据奈奎斯特-香农采样定理设定步进尺寸。选择曝光参数以最大限度减少最终图像中过饱和像素的数量。使用FIJI软件处理12位图像，通过Z-投影功能中的最大强度投影将Z轴切片投影至单一平面，最后转换为8位RGB彩色模式。</li>
</ol>
4. 小鼠血液样本的 PCR 分析
<ol>
	<li>使用带有超细6 mm针头的胰岛素注射器，向麻醉的C57BL6J小鼠阴茎静脉注射100 µl含有1至4 × 1011个AAV-GFP颗粒的储备液（在密闭舱内用5%异氟烷诱导麻醉，手术期间通过鼻罩维持2.5%异氟烷）。该动物将作为循环AAV颗粒的阳性对照。</li>
	<li>在ShH10玻璃体内注射或阴茎内注射前以及注射后3小时、24小时、2天和3天，从小鼠尾部采集血液样本（图1）。每次采集约10–20 µl，收集于肝素管中。操作完成后，通过CO2吸入法处死小鼠。</li>
	<li>使用您选择的提取试剂盒从血液样本中提取基因组DNA。</li>
	<li>对基因组DNA进行PCR扩增。本方案使用以下引物对：GFP，正向引物5’-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3’，反向引物5’-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3’。PCR程序如下：95 °C 2分钟（1个循环）；95 °C 45秒、55 °C 1分钟、72 °C 45秒（30个循环）；72 °C 5分钟（1个循环）；4 °C保存。</li>
</ol>
5. 可选的伊文思蓝法
注意：使用伊文思蓝法通过测量白蛋白从血管渗漏到视网膜的程度来定量血管通透性10。
<ol>
	<li>通过将伊文思蓝染料溶解于生理盐水溶液（6 mg/ml）中，超声处理5分钟（使用超声清洗机），再经5 µm滤膜过滤，制备伊文思蓝染料溶液。</li>
	<li>以异氟烷吸入法麻醉C57BL6J小鼠（参见步骤4.1），检查翻正反射、撤足反射及尾部夹捏反应的消失，以确认麻醉效果充分，随后经阴茎静脉注射伊文思蓝（45 mg/kg）（图1）。注射伊文思蓝后，观察小鼠足垫、口鼻部及耳朵明显变蓝，以确认染料已被吸收并分布。</li>
	<li>在染料注射3小时后，使用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对C57BL6J小鼠进行麻醉，并通过翻正反射消失确认麻醉充分。经心脏穿刺采集约500 µl血液至肝素抗凝管中，随后经左心室以预热至37 °C的柠檬酸盐缓冲液（0.05 M，pH 3.5；将7.8 g柠檬酸和3.8 g柠檬酸钠溶于1 L蒸馏水中）灌流2分钟，以防止血管收缩。灌流过程致死小鼠。</li>
	<li>灌流结束后，在手术显微镜下摘除双眼并小心分离以获取视网膜组织（参见第3.2节）。将视网膜置于离心浓缩仪中过夜干燥，称重后加入100 μl甲酰胺，于65 °C振荡孵育18小时（100 × g）以提取伊文思蓝染料。将视网膜样品置于30K omega滤膜管中，于4 °C、20,798.5 × g离心2小时；血液样品则于4 °C、20,798.5 × g离心15分钟。</li>
	<li>取上清液用于测定吸光度。通过计算伊文思蓝在620 nm处的最大吸光度与740 nm处的最小吸光度之差，确定各样品的吸光度值。根据甲酰胺中伊文思蓝的标准曲线，计算血浆和视网膜中的染料浓度。以每小时每克干视网膜组织中渗出的伊文思蓝血浆体积（µl plasma/g retinal dry wt/hr）表示血-视网膜屏障（BRB）通透性。</li>
</ol>
6. 可选的荧光素血管造影
注意：可通过腹腔注射荧光素钠来观察小鼠视网膜血管的渗漏情况。
<ol>
	<li>使用异氟烷吸入法麻醉 C57BL6J 小鼠（参见步骤 4.1），并用眼药水（新福林和散瞳剂）散大瞳孔。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。</li>
	<li>按每只小鼠腹腔注射 0.1 ml 无菌生理盐水中含 0.01–0.02 ml 10% 荧光素钠溶液，用于荧光素血管造影。</li>
	<li>注射后使用眼底照相机采集双眼图像。操作完成后通过吸入 CO2 处死小鼠。 
	注意：荧光素血管造影中视网膜血管约需 20 秒方可显影。图像采集应在注射荧光素钠后 3 至 10 分钟内完成。渗漏点（若存在）通常在 2.5 分钟后可见。随着时间延长，荧光素钠会扩散至玻璃体，导致图像质量下降，因此仅采用注射后短时间内获取的图像进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

血-视网膜屏障（BRB）调控血液与视网膜之间的分子交换。BRB的破坏与多种疾病相关，例如糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性（AMD）。我们近期研究表明，在一种表现出BRB通透性的抗萎缩蛋白（dystrophin）基因敲除小鼠模型中，视网膜对腺相关病毒载体（AAV）介导的基因递送更为敏感。然而，尽管BRB具有通透性，在该模型中经眼内注射的AAV颗粒仍局限于眼部腔室。我们的结果表明，针对存在BRB通透性疾病的基因治疗并不会带来额外的全身性副作用风险。此外，这些结果支持了在视网膜疾病过程中其他屏障（如内界膜ILM）也会受损，从而使得病毒颗粒更易进入的观点。我们的发现提示，编码报告基因的AAV是研究视网膜疾病动物模型中BRB通透性和ILM完整性的优良工具。特别是AAV变体ShH10，因其可特异性标记Müller胶质细胞，可作为标记视网膜胶质细胞并报告视网膜在疾病响应下状态的工具。ShH10可在健康和病变的视网膜中选择性地标记Müller胶质细胞。然而，ShH10及其他AAV在屏障受损的视网膜中均能实现更高效的基因递送。
应用上述方案时的一些关键步骤包括：（1）培养熟练的手动操作技巧以完成...

Müller细胞是视网膜主要的胶质成分。形态学上，它们以放射状贯穿整个视网膜，其末端足突与玻璃体接触，朝向内界膜（ILM），并分泌后者的部分成分。ILM是一种基底膜，由约十种不同的细胞外基质蛋白组成（包括层粘连蛋白、agrin、perlecan、nidogen、胶原蛋白以及多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）。在发育过程中，ILM的存在对视网膜组织发生、视神经轴突的导向以及&#160;神经节细胞的存活至关重要1-3。然而，在成年视网膜中ILM并非必需，可在某些病理情况下通过手术切除而不引起视网膜损伤4。在基因治疗中，该膜会成为通过玻璃体内注射腺相关病毒（AAV）实现视网膜高效转导的物理屏障5。
通过其突起的广泛分支，穆勒细胞为视网膜神经元和血管细胞提供营养和调节支持。穆勒细胞还参与视网膜稳态的调节以及血-视网膜屏障（BRB）的形成与维持6。视网膜毛细血管内皮细胞、穆勒细胞、星形胶质细胞和周细胞之间的紧密连接构成BRB。BRB可阻止某些物质进入视网膜。在糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞及呼吸系统疾病等多种疾病中，视网膜缺氧会导致BRB发生渗漏7-9。这种屏障破裂与血管通透性增加相关，进而引起血管源性水肿、视网膜脱离和视网膜损伤。
Müller细胞与血管和基底膜紧密相连，在血-视网膜屏障（BRB）和内界膜（ILM）的完整性中发挥重要作用。因此，标记Müller胶质细胞对于研究这些视网膜屏障的物理状态具有重要意义。
传统上，血-视网膜屏障（BRB）通透性通过伊文思蓝染料法测定，该方法包括系统性注射伊文思蓝染料，该染料可非共价结合血浆白蛋白。该检测方法用于测量白蛋白（中等大小蛋白质，约66 kDa）从血管渗漏至视网膜的情况（参见实验方案第5节）10。另一种方法是通过荧光素眼底血管造影观察血管渗漏，以评估荧光素（小分子，约359 Da）的渗出情况（参见实验方案第6节）11。然而，这两种方法均可用于评估BRB对小分子和蛋白质的通透性，但无法提供有关内界膜（ILM）完整性的信息。
因此，为了研究血-视网膜屏障（BRB）的通透性，我们采用了一种基于腺相关病毒（AAV）的方法，该方法可提供关于BRB对较大分子通透性的信息例如， AAV 颗粒，直径 25 nm）。事实上，我们的方法能够检测血液中 AAV 转基因的存在，这表明直径约 25 nm 的颗粒能够渗入血液循环。该方法还可提供关于病理性条件下内界膜（ILM）及细胞外基质蛋白结构的信息。有两种 AAV 亚型适用于此类研究：AAV5 和 ShH10。其中，AAV5 经视网膜下注射后，天然趋向于光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞12 但在ILM完整的野生型视网膜中，将其注入玻璃体腔时无法穿透至外层视网膜5,13ShH10 是一种经过基因工程改造的腺相关病毒变体，可特异性靶向胶质细胞而非神经元14,15ShH10 可选择性地标记健康和病变视网膜中的 Müller 细胞，在屏障功能受损的视网膜中标记效率更高16这些病毒工具结合免疫组织化学和血液DNA分析，可提供有关视网膜屏障状态及其在疾病中作用的信息（图1).

<table><tbody><tr><td>C57BL6J 小鼠品系</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>小鼠</td></tr><tr><td>氯胺酮 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>赛拉嗪 Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>新福林 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>扩瞳剂</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5%</td><td>Thea</td><td></td><td>扩瞳剂</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>抗炎药</td></tr><tr><td>Cryomatrix 包埋树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 黏附载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>载玻片</td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗视紫红质克隆 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗谷氨酰胺合成酶克隆 GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗胶质纤维酸性蛋白抗体</td><td>Dako</td><td>334</td><td>抗体</td></tr><tr><td>PNA 凝集素</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>探针</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 标记的二抗</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>抗体</td></tr><tr><td>Fluorsave 封片试剂</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>QIAmp DNA 微量提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>伊文思蓝染料</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>染料</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>光谱纯甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>染料</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>基于三芯片彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微成像系统，可实现小鼠视网膜成像</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l Hamilton 注射器</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>RN G33 针头，25 mm，PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>玻璃体内注射</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>多功能注射器，使用微量注射器递送皮升级体积</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3)（单通道）配 SYS-Micro4 控制器</td><td>UMP3-1</td><td>数字控制器</td><td></td></tr><tr><td>双目放大镜 SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>0.66–5× 变倍，带LED照明立式支架，透射与反射光照明，用于视网膜解剖</td></tr><tr><td>直型弹簧剪刀 - 8.5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>视网膜解剖</td></tr><tr><td>弯型 Vanna 剪刀</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5 号镊子</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 孔梯度 PCR 仪</td><td>Life technologies</td><td>4375786</td><td>PCR 仪</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Laboratory Supplies</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k omega 离心管</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>TECAN</td><td>infinite M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

利用腺相关病毒作为工具研究疾病中的视网膜屏障

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Müller 细胞是视网膜的主要胶质细胞。它们的终足在视网膜的外限界膜和内限界膜（ILM）处构成视网膜的边界，并与星形胶质细胞、周细胞和内皮细胞共同形成血-视网膜屏障（BRB）。BRB 限制了血液与视网膜之间的物质转运，而 ILM 作为基底膜，在组织学上定义了视网膜与玻璃体腔之间的分界。标记 Müller 细胞对于研究视网膜屏障的物理状态尤为重要，因为这些细胞是 BRB 和 ILM 的组成部分。BRB 和 ILM 在视网膜疾病中常发生改变，并导致疾病的症状。
目前已有多种成熟的方法用于研究血-视网膜屏障（BRB）的完整性，例如伊文思蓝检测法或荧光素眼底血管造影。然而，这些方法无法提供关于BRB对纳米尺度较大分子通透程度的信息。此外，它们也无法反映其他视网膜屏障（如内界膜，ILM）的状态。为了同时研究BRB通透性及视网膜ILM的情况，我们采用了一种基于腺相关病毒（AAV）的方法，该方法不仅可提供BRB对较大分子通透性的信息，还能指示疾病状态下ILM及细胞外基质蛋白的状态。其中，AAV5和ShH10两种AAV血清型适用于此类研究。AAV5&#160;对光感受器具有天然趋向性，但当内界膜（ILM）完整时，玻璃体腔注射无法使其穿透到达外层视网膜（即， 在野生型视网膜中）。ShH10 对胶质细胞具有强趋向性，可在健康和病变的视网膜中选择性地标记穆勒胶质细胞。在内界膜（ILM）受损的视网膜中，ShH10 可实现更高效的基因递送。这些病毒工具结合免疫组织化学与血液-DNA 分析，有助于揭示疾病状态下视网膜屏障的改变情况。

如果动物模型显示内界膜（ILM）结构发生改变，我们预期通过使用ShH10可增强对视网膜 Müller 胶质细胞的转导（图 2A–B）。例如，我们已证明，在缺乏Dp71的情况下，通过玻璃体内注射，ShH10能够更特异且更高效地靶向 Müller 胶质细胞，表明与野生型小鼠相比，该小鼠品系的内界膜通透性增加16（图 2C–F）。
AAV5 还可用作内界膜（ILM）通透性的指示剂。在野生型小鼠中，经玻璃体内注射的 AAV5 无法有效转导光感受器细胞；但在视网膜屏障受损的小鼠（如 Dp71 缺失小鼠16）或其他视网膜变性模型22中，AAV5 对光感受器的基因递送效果显著增强（图 2G-H）。这进一步证实了视网膜神经元周围细胞外基质中内界膜的结构紊乱及其通透性可能增加。
...

为了研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性，我们使用了多种腺相关病毒（AAV）变体作为标记视网膜神经元和胶质细胞的工具。随后利用病毒介导的报告基因表达作为视网膜屏障通透性的指标。

穆勒细胞是视网膜的主要胶质细胞，其终足分别在视网膜的外界膜和内界膜处构成视网膜的外、内边界……

本实验的总体目标是研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性。首先将含有GFP转基因的AAV颗粒注射到玻璃体或血液中，随后在注射后的不同时间点采集血液样本，以此实现上述目标。血液采样辅以每周一次的活体眼底成像。最后一步是对视网膜平铺片和视网膜冷冻切片进行免疫组织化学染色。最终通过共聚焦显微镜和PCR检测ILM完整性的转导模式指示剂，并检测血液中的AAV颗粒，从而证明血-视网膜屏障的通透性。该技术相较于现有方法的主要优势在于，AAV灌注法能够提供其他细胞无法给出的血-视网膜屏障通透性信息。该技术的应用意义延伸至AAV介导的基因治疗领域，因为它有助于确认AAV颗粒对血-视网膜屏障的通透性，从而避免潜在的不良副作用。该方法还可用于研究糖尿病大鼠等其他视网膜疾病动物模型中内界膜的完整性。当我们观察到DP 71基因敲除小鼠模型的视网膜出现血-视网膜屏障破坏，并且其转导效率高于野生型视网膜时，我们首次提出了该方法的设想。首先麻醉C-57黑六J小鼠。检查三种反射是否消失：翻正反射、回缩反射和尾部夹捏反应。这些反射的消失可确认麻醉成功。接下来，用滴管将5%新福林（neosynephrine）和0.5%散瞳剂（mydriaticum）滴加到角膜上，以扩大瞳孔。然后使用兽用眼膏润滑眼睛，防止过度干燥。现在，用超细30号一次性针头吸取含有1至4×10¹¹个AAV-GFP颗粒的储备液。通常，初学者在操作此方法时会遇到困难，因为他们必须在不接触晶状体或视网膜的前提下完成最安全的玻璃体内注射。随后，将一根超细的一次性30号针头经赤道部并靠近角膜缘处穿入玻璃体腔。将针头插入眼内后，在观察针头位于玻璃体腔中心位置的同时，注入一微升溶液。在内界膜实验中，使用一只眼作为对照，而在血-视网膜屏障实验中则需对双眼均进行注射。注射后，对每只注射眼局部应用抗炎和抗菌治疗。一周后，使用新福林（neosynephrine）和散瞳剂（mydriaticum）散大瞳孔，并使用眼底相机进行眼底检查。在注射后一周、两周、一个月和两个月时，通过观察追踪GFP表达。从安乐死后的注射动物中取出眼睛，解剖以去除晶状体和角膜。随后将解剖后的眼睛在4%多聚甲醛中浸泡固定1小时。1小时后，在室温下用10%蔗糖对眼睛进行 cryo-保护处理1小时。然后在室温下用20%蔗糖浸泡眼睛20分钟。最后，将眼球置于 30% 蔗糖溶液中，4°C 条件下过夜。次日，使用包埋介质（如冷冻包埋剂）对眼球组织进行包埋并冷冻。随后使用冷冻切片机切出 10 µm 的切片，并将其贴附于已预处理的冷冻组织载玻片上。现在用去垢剂对载玻片上的切片进行透化处理，持续5分钟。随后用PBS短暂洗涤两次。然后在室温下封闭眼球1小时。为了便于制备视网膜平铺标本，将摘除的眼球在4%多聚甲醛中固定15至30分钟，以利于解剖。此步固定以及解剖后的固定必须充分进行，因为这对保存GFP荧光至关重要。固定15至30分钟后，解剖眼球，去除角膜和晶状体。通过在锯齿缘和视神经周围进行切割，将视网膜与视网膜色素上皮层及巩膜分离。解剖完成后，将视网膜浸入4%多聚甲醛中固定30分钟，以固定组织及转导视网膜细胞中的荧光蛋白。固定后，用pH 7.4的无菌PBS洗涤标本5分钟。然后将 PBS 更换为封闭缓冲液，在室温下孵育视网膜 4 小时，或在 4 摄氏度下过夜孵育。开始标记步骤时，将样品与一抗在封闭缓冲液中孵育，孵育条件为室温 4 小时或 4 摄氏度过夜。应用一抗后，用 PBS 洗涤组织 3 次，然后将组织在封闭缓冲液中与 Alexa Fluor 标记的二抗按 1:500 稀释比例孵育。冰冻切片孵育1小时，平铺样本孵育2小时，于室温下进行，并避光。二抗孵育完成后，如前所述用PBS洗涤三次以去除未结合的二抗。 现在，对视网膜进行减张切口，以便将其平铺在载玻片上，使感光细胞或视网膜神经节细胞朝上。加入水性封片剂并加盖盖玻片。载玻片可在共聚焦显微镜成像前于4°C保存。首先制备用于检测循环AAV颗粒的阳性对照。在注射AAV之前，先采集10至20微升的血液样本。然后，在麻醉后将100微升的病毒储存液注入血液中。将物质注入血液的较简便途径是阴茎静脉。在本视频片段中，我们注射蓝色染料以作为注射操作的可视化对照。接下来三天内定期采集少量血样，随后处死小鼠。从组织样本中使用商业试剂盒提取基因组DNA，并以所提取的DNA为模板，采用一对GFP特异性引物进行PCR扩增。运行30个循环，每个循环的延伸时间为45秒，退火温度为55摄氏度。预期SHH 10载体在DP 71基因敲除小鼠中的转导模式会增强。若动物模型显示内界膜结构存在异常，则表明DP 71基因敲除小鼠的视网膜屏障功能受损，因此在DP 71基因敲除小鼠中进行玻璃体内注射SHH 10可更有效地靶向米勒胶质细胞，具有重要的比较研究价值。这表明与野生型对照组相比，该转基因小鼠品系的内界膜发生了去稳定化。注射AAV5-GFP也显示了内界膜具有通透性。AAV5通过玻璃体内注射在野生型小鼠中无效，但在视网膜屏障受损的小鼠（如DP71基因敲除小鼠）中，其向光感受器细胞的基因递送能力显著增强。通过PCR分析发现，DP71基因敲除小鼠的血-视网膜屏障对AAV颗粒仍具有选择性，因为在玻璃体内注射后，其血液样本中未检测到AAV的存在。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用腺相关病毒，通过分析视网膜的转导模式或血液中AAV颗粒的存在情况，来检测内界膜的完整性或血-视网膜屏障的通透性。

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