遗传条形码与荧光蛋白的复用的应用程序
April 14th, 2015
自从发现绿色荧光蛋白基因以来，荧光蛋白已经影响了分子细胞生物学。该方案描述了如何通过基因工程表达不同的荧光蛋白来对单个细胞进行条形码编码。该程序能够追踪细胞混合物中的不同群体，是多重应用的理想选择。
以下实验的总体目标是对哺乳动物细胞进行荧光条形码编码，以增强依赖于不同荧光读数的多重高通量生物检测。为此，使用逆转录病毒颗粒在哺乳动物细胞中稳定表达荧光蛋白，从而对它们进行条形码编码。接下来进行荧光激活细胞分选以获得克隆条形码群体。
然后通过流式细胞术扩增、合并和分析克隆群，以确认它们可以彼此区分，因此可以同时使用。最后，用标记测定法转导条形码细胞系。使用不同于条形码通道的荧光通道监测蛋白质和生物活性。
结果表明，哺乳动物细胞的荧光棒包被在高通量环境中进行多重应用的效用。与需要仔细校准抗体或染料的现有方法相比，该技术的主要优点是，一旦建立了基因条形码细胞系，它们就不需要进一步作，并且由于目标蛋白质表达时间长，因此它们被进一步用于生物适应。将荧光基因条形码细胞系与表面测定相结合，使我们能够以水通量形式独立研究生物学功能或效应。
在我们的示例中，我们使用荧光遗传棒包被来监测不同病毒底物的多路复用切割。该测定法可进一步用于研究参与切割的机制和高通量药物发现。转染前一天，将 2.5 x 10 的 10 cm 平板接种到含 10% FBS 的 DMEM 中的第六个 Phoenix GP 细胞中。
该包装细胞系稳定表达 gag 和 pole 蛋白，用于在恍惚状态下形成逆转录病毒颗粒。转染当天，使用明场显微镜检查细胞。细胞必须健康并粘附在单层板中，才能用于转染。
接下来，将 DNA 转染混合物制备成 125 μL 无血清。DMEM 的。加入 3 μg 水泡性口炎病毒包膜糖蛋白载体 P-C-I-V-S-V-G 和 3 μg 携带目标荧光蛋白基因的转移载体，加入 15 μL 聚醚胺转染试剂并混合，得到携带不同荧光蛋白标志物的病毒颗粒。使用所选的标记物独立进行每次转染。
孵育转染后，将混合物添加到细胞中，将每种混合物在室温下孵育 15 分钟。然后在 37 摄氏度下滴加孵育板。（可选）24 小时后，用 7 毫升新鲜培养基替换培养基。
虽然这可能会改善细胞健康，但可能会降低上清液中的病毒载量。转染后 48 小时，使用移液器将含有病毒颗粒的上清液转移到 10 毫升注射器中。配有 0.20 微摩尔聚四氟乙烯过滤器，用于压入柱塞，将滤液分配到两个 ml 微量离心管中。
留出 2 毫升的等分试样立即使用。将剩余的病毒 snat 和等分试样放在冰上，并将它们转移到负 80 摄氏度，直到它们在转导前 24 小时在六孔板种子的每个孔中 2.0 至 3.0 乘以 10 到第五个贴壁细胞，这里使用 2、9、3 T 细胞第二天。要转导贴壁细胞，请从板中取出现有培养基。
将每毫升 poly brain 的 5 微克添加到先前收集的 2 毫升病毒正弦中，然后小心地将混合物添加到细胞中。用香水密封板。然后将盘子放入悬挂的桶中。
离心 在 32 摄氏度下以 1500 倍 G 离心 120 分钟。旋转后，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。24 小时后，至少 72 小时更换细胞培养基。
转导后。准备通过流式细胞术分析转导的细胞，以量化转导的百分比。首先，使用可比较的非特转导细胞系作为阴性对照，确保在正确的通道中正确设置门。
设置参数通道电压，使负群体在每个感兴趣的荧光轴上低于 10 到第三个值。接下来，将阳性荧光的门设置为超出阴性对照的事件。然后使用转导的细胞，确定特定荧光通道的阳性百分比。
将细胞分选到含有 1 毫升 100% FBS 的 15 毫升锥形管中。然后在悬挂的桶中旋转排序的群体。转子在 32 °C 下以 524 倍 G 离心 5 分钟。
离心后，将细胞重悬于 1 毫升新鲜培养基中，然后在 6 厘米板上将 2 次 10 倍接种到 6 个细胞中 2 乘以 10 的 2 毫升 DMEM。在此浓度下，汇合度低于 60%，将允许生长和分裂至少两天。将细胞置于 37 摄氏度的培养箱中数天，以便有时间进行扩增。
克隆细胞群可以从原始转导的细胞或分选的细胞中产生。在此阶段，根据所选的荧光而不是单个克隆对紧密群体进行分选，可确保为将来的选择提供备用群体。如果需要，根据感兴趣的细胞群设置分选门，确保门至少相隔一个对数刻度 要使用自动细胞沉积装置获得可区分的细胞群，请将单个细胞分选到 96 孔板中，请注意，每个孔平均有一个细胞。
有些孔可能没有任何细胞，而其他孔可能有多个 Following。分选，将细胞在 37 摄氏度下孵育至少两周以扩增单个克隆。定期在显微镜下检查细胞，以确保不断增长的细胞群来自单个细胞，而不是来自多个细胞。
还要确保细胞在两周后不会过度生长。通过流式细胞术筛选推定的克隆群体，并将它们与阴性对照群体进行比较。真正的克隆群体应该具有非常紧密的荧光模式。
根据总体的平均强度和紧密度选择最明显的分离总体。根据需要扩增它们，或将原液储存在含有 10% DMSO 的冷冻培养基中，在零下 80 摄氏度下短时间储存，或将液氮储存更长时间。接下来，测试克隆群体是否可以成功用于多重高通量筛选系统。
选择一组具有不同吸收、发射光谱和/或不同强度的克隆，并将它们组合到单个管种子中。50， 000 个组合细胞在 96 孔板的每个孔中补充的 DMEM 中，分别放在单独的试管中。准备负色和单色对照，用于在流式细胞仪上设置参数和补偿值。
设置补偿值。然后分析样品以确保可以区分每个独立建立的荧光细胞系。为了使条形码细胞系适应生物学应用，首先选择经过工程改造的检测元件，以便它们作为融合或通过内部核糖体进入位点与标签或荧光蛋白偶联。
Ires，可通过 western blotting 流式细胞术或显微镜进行直接检测。这里使用的系统包括一种生物测定，其中 HIV 包膜蛋白在细胞表面表达，暴露其 HA 和标志标签。该检测蛋白在表达 TD 番茄的条形码细胞中表达。
可以通过用 FSE 标记的 Anti-Flag 抗体染色来监测蛋白质的切割。当蛋白质未被切割时，可以看到染色，但当蛋白质被切割时，绿色荧光标记不再明显。为了在条形码细胞中建立生物检测，用含有所选检测元件的病毒颗粒转导它们。
将病毒 SUP natin 添加到所选细胞中，并通过离心离心旋转。接下来，将细胞与荧光标记的抗 HA 抗体一起孵育。然后对带条形码的细胞进行分类，以分离出那些含有 ha 阳性的测定元件的细胞。
最后，结合不同的条形码细胞系。每种都包含带有不同底物的测定。将细胞混合物与 Anti-Flag 和 ZI 偶联抗体一起孵育，并通过流式细胞术对其进行分析，以确定是否发生了蛋白质切割，以追溯测定、分析或解码适当通道中的群体，从而可以在此处区分不同的遗传条形码细胞系。
然后，TD 番茄的 PE 通道通过在 fite 通道中分析来解码底物的性质，以揭示阳性群体，以检测分泌途径中表面表达蛋白的切割。用于荧光条形码表达 TD 番茄的 Sub T one 细胞，并以不同强度分选为三个群体。然后用不同的逆转录病毒转导每个群体，以诱导野生型 HIV 包膜蛋白、突变型 HIV 包膜蛋白或登革热病毒的表达。
PRM 边界蛋白，每个边界蛋白的两侧都有 flag 和 HA 标签。将转导的细胞与抗 HA 和抗 Flag 抗体一起孵育。进行抗 HA 染色以确认工程化检测蛋白的存在，同时进行抗 Flag 染色以确定其是否被切割。
当通过流式细胞术分析未染色的联合群体时，克隆群体可以根据 TD 番茄条形码进行区分，但无法区分 fite 通道。相反，当相同的群体用 flag fite 抗体染色时，一个群体的 flagg 阳性。根据条形码，该群体可以很容易地识别为携带突变 HIV 包膜底物的群体。
现在，您应该对如何将逆向阀技术与流式细胞术结合使用有了很好的了解。为了建立荧光遗传条形码细胞系，多重形式的四种生物学应用，将荧光基因条形码细胞与多重形式的基于细胞的分析偶联的能力显着增强了高通量能力。生成细胞系后，将它们冷冻起来很重要。
然后定期解冻它们，重新分析 em，然后将它们放回去。虽然生成荧光基因条形码细胞系一开始可能很耗时，但一旦建立，它们就会显著提高未来应用的可重复性和稳定性。
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概述
本协议描述了一种用于增强多重高通量生物测定的哺乳动物细胞荧光条形码的方法。通过使用逆转录病毒颗粒来稳定表达不同的荧光蛋白，研究人员可以在混合物中追踪单个细胞群体。
关键研究组成部分
科学领域
- 分子细胞生物学
- 细胞测定
- 荧光成像
背景
- 荧光蛋白自发现以来革新了分子生物学。
- 条形码允许追踪不同的细胞群体。
- 这种技术在多重应用中特别有用。
- 流式细胞术用于分析和确认不同的群体。
研究目的
- 为增强测定能力对哺乳动物细胞进行荧光条形码。
- 为实现多个细胞群体的同时分析提供能力。
- 使用不同的荧光通道监测生物活性。
所用方法
- 通过逆转录病毒颗粒稳定表达荧光蛋白。
- 荧光活化细胞分选以分离克隆群体。
- 克隆群体的扩增和组合。
- 流式细胞术用于分析条形码细胞系。
主要结果
- 克隆条形码群体可以彼此区分。
- 条形码细胞系可以同时用于测定。
- 不同的荧光读数增强了生物活性的分析。
- 成功地用标记的测定进行条形码细胞系的转导。
结论
- 荧光条形码有效用于追踪哺乳动物细胞。
- 这种方法增强了高通量测定的能力。
- 不同的荧光通道允许对生物过程进行全面监测。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescent genetic barcoding enables multiplexed high-throughput screening by creating stably labeled cell populations that require no further manipulation after establishment. This approach enhances assay power through concurrent analysis of distinct biological functions using flow cytometry-resolvable fluorescent channels. The method supports target de-risking and predictive confidence in early discovery by allowing parallel evaluation of multiple substrates or promoters within a unified experimental system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous tracking of multiple viral substrate cleavage events in barcoded populations.
- Operational Value: Provides stable, long-term fluorescent labeling that eliminates need for repeated dye calibration or antibody titration in multiplex formats.
- Predictive Value: Supports lead identification by allowing direct comparison of assay outcomes across distinct barcoded lines under identical conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates clonal cell lines with tight fluorescence patterns suitable for standardized assay development and reagent titration.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems compatible with cell-based assays and surface protein monitoring via distinct fluorescent readouts.
- Scalability: Supports amplification and cryopreservation of barcoded stocks for reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates monitoring of biological activity in secretory pathways using tag-coupled assays transduced into barcoded cells.
- Mechanistic De-risking: Allows dissection of cleavage machinery involvement (e.g., HIV envelope, dengue virus) through parallel substrate testing in multiplex format.
- Predictive Confidence: Enables decoding of assay results by linking fluorescent barcodes to specific biological outputs via flow cytometry gating strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reusable platform for hypothesis testing, assay standardization, and quantitative phenotypic screening prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation through multiplexed monitoring of protein cleavage and translocation events.
- Screening: Delivers assay-ready clonal populations with distinguishable fluorescence for high-throughput compound or substrate screening.
- Analytics: Provides multiplex-capable readouts via flow cytometry that enable statistical comparison of biological activity across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase barcoding to preclinical continuity through stable expression of assay-coupled reporters in mammalian cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a frozen, thaw-and-use resource that enhances reproducibility and reduces technical variability across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct comparison of multiple biological functions in a single experimental system.
- Operational Value: Increases throughput and reagent efficiency through multiplexing, reducing per-assay cost and hands-on time.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by generating concordant multi-parametric data from isogenic barcoded lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, reproducible outputs across diverse target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retroviral transduction, fluorescent protein selection, and flow cytometry gating for multiplex analysis.
- Dependent on access to biosafety-level equipment for viral production and FACS sorting of clonal populations.
- Necessitates standardization of fluorescence compensation and channel separation to ensure distinguishable barcodes across experiments.
- Involves validation of clonal purity and fluorescence stability over extended culture periods to maintain barcode integrity.
- Limited by spectral overlap constraints; requires careful selection of fluorescent proteins with non-overlapping excitation/emission profiles for multiplex clarity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
Preparation of Mammalian Cells, Viral Production and Transduction for Genetic Barcoding
4:59
Selection and Amplification of Genetically Barcoded Cells
6:28
Obtaining Clonal Populations of Genetically Barcoded Cells at Different Intensities
8:51
Adapt Genetically Barcoded Cell Lines to the Biolgical Application of Choice
10:52
Results: A Multiplex Analysis of Cleavage of the HIV Envelope and Dengue Virus pr-M Boundary Proteins
12:14
Conclusion
