使用荧光蛋白进行多重应用的遗传条形码技术

本实验的总体目标是通过荧光条形码标记哺乳动物细胞，以增强依赖不同荧光读数的多重高通量生物学检测。为此，使用逆转录病毒颗粒在哺乳动物细胞中稳定表达荧光蛋白，从而实现细胞的条形码标记。随后进行荧光激活细胞分选，以获得克隆性的条形码标记细胞群体。

随后通过扩增、合并克隆群体，并采用流式细胞术进行分析，以确认各群体之间可被明确区分，因而能够同时使用。最后，将带有条形码的细胞系用带有标签的检测方法进行转导。利用与条形码通道不同的荧光通道监测蛋白质和生物学活性。

结果表明，荧光条形码标记哺乳动物细胞在高通量环境中具有多重应用价值。该技术相较于现有方法的主要优势在于，无需对抗体或染料进行精细校准；一旦建立基因条形码细胞系，便无需进一步操作，且由于目标蛋白可长期表达，这些细胞系可进一步用于生物学适应性研究。将荧光基因条形码细胞系与表面检测技术相结合，可使我们在高通量模式下独立地研究生物学功能或效应。

在本示例中，我们采用荧光遗传条形码涂层技术，以多重监测不同病毒底物的切割情况。该检测方法还可进一步用于研究参与切割过程的分子机制，并可用于高通量药物筛选。转染前一天，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于10厘米培养皿中接种2.5×10⁶个Phoenix GP细胞。

该包装细胞系可稳定表达用于逆转录病毒颗粒在 trance 中形成的 gag 和 pol 蛋白。转染当天，使用明场显微镜观察细胞。细胞必须健康，并以单层形式贴附于培养板上，方可用于转染。

接下来，将DNA转染混合物加入125微升无血清DMEM中。加入3微克水疱性口炎病毒包膜糖蛋白载体（P-C-I-V-S-V-G）和3微克携带目的荧光蛋白基因的转移载体，再加入15微升聚醚胺转染试剂，混匀以获得携带不同荧光蛋白标记的病毒颗粒。每次转染应独立进行，并根据需要选择相应的标记物。

将混合物加入细胞后，在室温下孵育15分钟。随后将培养板在37摄氏度下孵育。可选步骤：24小时后，更换为七毫升新鲜培养基。

尽管这可能改善细胞状态，但可能会降低上清液中的病毒载量。转染后48小时，使用移液器将含有病毒颗粒的上清液转移至10毫升注射器中，安装0.20 µm聚四氟乙烯滤器，推动活塞，将滤液分装至2毫升微量离心管中。

立即留出 2 毫升等分试样用于后续操作。将剩余的病毒上清液及等分试样置于冰上，并转移至 -80 °C 保存，直至转导前 24 小时。在 6 孔板的每个孔中接种 2.0 至 3.0 × 10⁵ 个贴壁细胞（此处使用 293T 细胞）。次日进行贴壁细胞的转导操作时，移除培养板中已有的培养基。

向之前收集的2毫升病毒悬液中加入5微克/毫升的polybrain，并将混合物小心地加入细胞中。用封口膜密封培养板，然后将培养板放入吊桶式离心机中。

在32摄氏度下，以1500 × g离心120分钟。离心后，将细胞置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。24小时后，更换细胞培养基，且间隔时间至少为72小时。

转导后。准备通过流式细胞术分析转导的细胞，以定量转导的百分率。首先，使用可比的未转导细胞系作为阴性对照，确保门控正确设置在相应的通道中。

将参数通道电压设置为使阴性细胞群在各相关荧光轴上的数值低于10的3次方。接着，以阴性对照为基准，将超出其信号范围的事件设为阳性荧光门。然后利用转导后的细胞，确定特定荧光通道的阳性百分比。

将细胞分选至含有1毫升100% FBS的15毫升锥形管中。然后在水平转子离心机中以524 × g、32°C离心5分钟，沉淀分选后的细胞群体。

离心后，将细胞重悬于1毫升新鲜培养基中，然后在6厘米培养皿中加入2毫升DMEM，接种2×10⁶个细胞。在此浓度下，细胞融合度低于60%，可支持细胞生长和分裂至少两天。将细胞置于37°C培养箱中培养数天，以确保充分扩增。

克隆群体可以从最初转导的细胞或分选后的细胞中获得。在此阶段，根据所选荧光指标对细胞群体进行紧密分选，而非单个克隆，可确保为后续筛选保留备份细胞群体。若需要，应根据目标细胞群体设定分选门限，确保门限之间至少相隔一个对数尺度。使用自动细胞分配装置进行分选时，将单个细胞分选至96孔板中，需注意每孔平均含有一个细胞。

某些孔中可能没有细胞，而另一些孔中可能含有一个以上的细胞。分选后，将细胞在37摄氏度条件下培养至少两周，以扩增单个克隆。定期在显微镜下观察细胞，确保生长的细胞群体来源于单个细胞，而非多个细胞。

还需确保细胞在两周后未出现过度生长。通过流式细胞术对疑似单克隆群体进行筛选，并将其与阴性对照群体进行比较。真正的单克隆群体应表现出非常集中的荧光模式。

根据平均荧光强度和细胞群体的紧密程度，选择分离最明显的细胞群体。根据需要进行扩增，或短期保存于含10% DMSO的冻存液中，置于-80摄氏度；长期保存则置于液氮中。接下来，检测单克隆细胞群体是否可成功应用于多重高通量筛选系统。

选择一组具有可区分的吸收光谱、发射光谱或不同荧光强度的克隆，并将它们组合到一个单独的管中作为种子。将200微升含补充物的DMEM培养基中50,000个混合细胞分别加入96孔板的每个孔中。准备阴性对照和单色对照，用于在流式细胞仪上设置参数和补偿值。

设置补偿值，然后分析样本，以确保能够区分每一种独立建立的荧光细胞系。为了将条形码细胞系应用于生物学实验，首先选择经过改造的检测元件，使其通过融合方式或内部核糖体进入位点与标签或荧光蛋白偶联。

IRES，可通过蛋白质印迹、流式细胞术或显微镜进行直接检测。此处使用的系统包含一种生物学检测方法，其中HIV包膜蛋白在细胞表面表达，并暴露出其HA标签和Flag标签。该检测蛋白在表达TD番茄红荧光蛋白的条形码细胞中表达。

可通过使用FSE标记的抗Flag抗体染色来监测蛋白质的切割情况。当蛋白质未被切割时，可观察到染色信号；而当蛋白质被切割后，绿色荧光标记不再明显。为了在条形码细胞中建立生物学检测，需用含有选定检测元件的病毒颗粒转导这些细胞。

向选定的细胞中加入病毒性SUP natin，并通过离心处理。接着，用荧光标记的抗HA抗体孵育细胞。然后对带有条形码的细胞进行分选，以分离出含有检测元件且HA呈阳性的细胞。

最后，将含有不同底物的、带有独特条形码的细胞系混合。每种细胞系包含一种带有不同底物的检测体系。将细胞混合物与抗Flag抗体和ZI偶联抗体共同孵育，然后通过流式细胞术进行分析，以确定蛋白是否发生切割，从而追溯检测结果；在相应的检测通道中分析或解码细胞群体，以便区分不同遗传条形码标记的细胞系。

通过TD番茄的PE通道，随后在fite通道中分析以解码底物性质，从而揭示阳性细胞群，用于检测分泌途径中表面表达蛋白的切割情况。将Sub T一个细胞用荧光条形码标记以表达TD番茄，并根据不同的荧光强度分选为三个细胞群。然后，每个细胞群分别转导不同的逆转录病毒，以诱导表达野生型HIV包膜蛋白、突变型HIV包膜蛋白或登革病毒包膜蛋白。

PRM边界蛋白，其两侧分别带有Flag标签和HA标签。将转导后的细胞与抗HA抗体和抗Flag抗体共同孵育。通过抗HA染色确认工程化检测蛋白的存在，而抗Flag染色用于判断该蛋白是否被切割。

当未染色的混合群体通过流式细胞术分析时，克隆群体可根据 TD 番茄条形码进行区分，但在 fite 通道中无法区分。相反，当相同群体使用 flag fite 抗体染色后，其中一个群体对 flagg 呈阳性。根据条形码信息，该群体可被明确鉴定为携带突变型 HIV 包膜底物 it 的群体。

现在，您应该已经充分掌握了如何将反向阀技术与流式细胞术结合使用。为了建立带有荧光遗传条形码的细胞系，可在多重体系中实现四种生物学应用。将荧光遗传条形码细胞与基于细胞的检测方法以多重形式相结合，可显著提升高通量检测能力。在细胞系构建完成后，重要的是将其冻存保存。

然后定期将它们解冻，重新分析，并再次冻存。尽管最初建立荧光标记的遗传条形码细胞系可能较为耗时，但一旦建成，将显著提高后续应用的重复性和稳健性。