Name: 遗传条形码与荧光蛋白的复用的应用程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 学习利用逆转录病毒颗粒稳定表达荧光蛋白，对哺乳动物细胞进行遗传条形码标记的方法。通过荧光激活细胞分选获得克隆群体，结合流式细胞术实现高通量多重生物检测，提升细胞追踪与活性监测效率。

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我们感谢斯坦福大学的 Garry Nolan 博士提供 Phoenix GP 包装细胞系，用于生产逆转录病毒颗粒。感谢加州大学圣地亚哥分校的 Roger Tsien 博士提供 td Tomato。我们还要感谢圣地亚哥州立大学流式细胞术核心设施提供的服务与帮助。

1. 用于基因条形码技术的哺乳动物细胞准备、病毒生产及转导
<ol>
	<li>接种 2.5 × 106 转染前一天，在含10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养贴壁细胞至10 cm培养皿中（或细胞汇合度约为50–60%）。为生产逆转录病毒，可选用合适的包装细胞系，例如Phoenix-GP细胞系（由斯坦福大学Gary Nolan惠赠）。 
	注意：包装细胞系稳定表达用于逆转录病毒颗粒形成的 Gag 和 Pol 蛋白 在转染中确保转染前细胞状态良好，并以单层形式贴壁生长在培养板上。</li>
	<li>24小时后，制备DNA转染混合物。
	<ol>
		<li>向 125 μl 无血清 DMEM 培养基中加入 3 μg 水疱性口炎病毒包膜糖蛋白载体（pCI-VSVg）和 3 μg 携带目的荧光蛋白基因的转移载体。混匀后加入 15 μl 聚乙烯亚胺（2 mg/ml）。</li>
		<li>室温孵育混合物15分钟，然后逐滴加入细胞中。 
		注意：聚乙烯亚胺作为转染试剂加入均质DNA混合物中，以形成聚复合物。为获得携带不同荧光蛋白标记的病毒颗粒，需针对所选标记物分别进行独立转染。需注意逆转录病毒转移载体长度约为7 kb，若超过10 kb则无法被有效包装。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C条件下孵育培养板。为提高病毒产量，可将培养板置于30 °C或32 °C条件下孵育。 
	注意：转染后24小时，可将培养基更换为7 ml新鲜培养基，这可能有助于改善细胞状态，但可能会降低上清液中的病毒载量。</li>
	<li>转染后48小时，收集含有病毒颗粒的上清液，并使用0.45 μm聚四氟乙烯滤器过滤。建议使用新鲜收集的病毒上清液进行转导；否则将上清液分装后于-80 °C保存，避免反复冻融。需注意，每次冻融循环可能导致病毒滴度下降，降幅可能高达50%。</li>
	<li>在转导前24小时接种贴壁细胞系，或在转导前立即接种非贴壁细胞系。接种 2.0 x 105 至 3.0 × 105 贴壁细胞（此处为 Huh 7.5.1 和 HEK 293T）或 5.0 x 105 到 1 × 106 6 孔板中每孔非贴壁细胞（此处为 SupT1）。 
	注意：转导前务必校准接种细胞数量，尤其是贴壁细胞，以确保转导时细胞汇合度约为60%。</li>
	<li>向接种的细胞中加入终浓度为 5 μg/ml 的 Polybrene（hexadimethrene bromide），随后加入先前收集的病毒上清液，使感染率约为 20–40%（此处为 2 ml）。 
	注意：感染复数（MOI）或感染百分比通常是任意的，因为分选能够扩增任何细胞亚群。显然，较高的感染率会使扩增过程更简便、更快速。</li>
	<li>在32 °C、1,500 × g条件下，使用水平吊桶转子离心120分钟，对细胞进行转导。转导后，非贴壁细胞用新鲜培养基重悬，然后进行孵育；对于贴壁细胞，在转导后24小时更换新鲜培养基。 
	注意：建议在离心前使用封口膜密封培养板，以防止液体溢出。为增加基因条形码细胞的多样性，可使用携带不同荧光蛋白的病毒颗粒（来自步骤1.4）对细胞进行转导。在选择荧光标记时，需确保其与仪器兼容，并具有可区分的荧光参数。</li>
</ol>
2. 遗传条形码标记细胞的筛选与扩增
<ol>
	<li>转导后至少72小时，通过流式细胞术分析转导的哺乳动物细胞，以定量转导率百分比。使用相应的未转导细胞系作为阴性对照。 
	注意：由于将使用分选来纯化单个条形码标记的细胞群体，较高的初始转导率虽非必需，但可加快扩增过程。</li>
	<li>利用所选的细胞分选仪获取表达目标蛋白的细胞。
	<ol>
		<li>为此，确保在正确的通道中正确设置门控。
		<ol>
			<li>为此，使用相同的未处理细胞系作为阴性对照，并调节参数/通道电压，使阴性群体在每个荧光轴上的数值低于103。将每个荧光通道中高于阴性对照信号的事件确定为阳性荧光门控。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>需注意，不同仪器可能存在差异，应相应调整用于确定门控的合适电压，因此在每次实验设置中必须包含阳性和阴性对照。
		<ol>
			<li>在此实验设置中，荧光检测使用以下通道：eGFP采用FITC通道（530/30带通滤光片，前接502长通滤光片），tdTomato采用PE通道（585/42带通滤光片，前接556长通滤光片），E2 Crimson采用APC通道（660/20带通滤光片）。 
			注意：488 nm激光激发eGFP和tdTomato，而E2 Crimson由633 nm激光激发。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞分选至含有1 ml 100% FCS的15 ml锥形管中。 
	注意：分选荧光标记细胞群体并非强制步骤，也可直接进行单克隆分选（见下文）。基于所选荧光信号分选紧密的细胞群体可保留备份细胞群体，用于后续单克隆筛选。需注意，单个细胞有时难以培养，而大量细胞群体则易于冻存，并可在后期解冻后进行扩增。</li>
	<li>将分选后的细胞群体在悬桶转子离心机中以524 g、32 °C离心5分钟，以沉淀细胞。用1 ml新鲜培养基重悬细胞，并重新接种，使细胞汇合度低于60%，以保证至少两天的生长和分裂。
	<ol>
		<li>例如，将贴壁细胞以每孔约3 × 105个细胞接种于6孔板中，每孔2 ml培养基；或将2 × 106个细胞接种于6 cm培养皿中，加入2 ml培养基。贴壁细胞使用DMEM培养基，非贴壁细胞使用RPMI培养基（或根据需要使用指定培养基）。将接种后的细胞置于37 °C培养箱中培养数天，以实现扩增。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在不同强度下获得基因条形码标记细胞的克隆群体
<ol>
	<li>从最初转导的细胞（步骤 1.7）或分选后的细胞群（步骤 2.3）中获得单克隆细胞群体。 
	注意：这将确保群体内所有细胞的荧光蛋白表达水平相等或相近（群体均一，平均荧光强度的变异系数 CV 最高不超过 40%）。
	<ol>
		<li>为此，使用自动细胞沉积装置（ACDU）将单个细胞分选至 96 孔板中。根据目标细胞群设置分选门控。在选择不同荧光强度的细胞时，确保门控之间至少相隔一个对数尺度，以获得可区分的细胞群。本实验所用的流式细胞术设置应与步骤 2.2 中描述的设置相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 37 °C 培养箱中扩增单个克隆，时间不少于 2 周。在扩增过程中，定期在显微镜下观察细胞，确保生长的细胞群来源于单个细胞，而非多个细胞。 
	注意：需注意分选仪平均每个孔仅放置一个细胞，但部分孔可能无细胞，而另一些孔可能含有多个细胞。
	<ol>
		<li>为确保细胞群仅来源于单个细胞，操作过程中需格外轻柔，切勿通过移液扰动孔内细胞。逐孔在显微镜下观察培养板。 
		注意：尽管单个细胞有时难以识别，但一旦开始分裂，即可被清晰辨认。</li>
		<li>需注意细胞常在孔边缘“成团”生长。若观察到多个克隆群体，则弃用该孔；仅保留含有单一紧密细胞群的孔。 
		注意：建议将此类克隆转移至更大的培养板中进行扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术分析潜在的单克隆群体，并与采用相同流式细胞术实验设置的阴性对照进行比较。
	<ol>
		<li>仅分析样品的一部分，保留其余部分作为备份。根据平均荧光强度及群体的紧密程度，选择分离最清晰的细胞群。根据需要进行扩增，或将其在含 20% 甘油的冻存液中于 -80 °C 短期保存，或于液氮中长期保存。 
		注意：需注意“真正”的单克隆群体应具有非常紧密的荧光分布模式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 确保高通量筛选（HTS）的多重检测能力
<ol>
	<li>根据需要合并尽可能多的不同克隆群体，以便后续在多重检测体系中使用。选择具有可区分吸收/发射光谱和/或不同荧光强度的克隆。若采用适用于高通量筛选（HTS）的96孔板格式，则每孔接种50,000个细胞于200 μl培养基中。 
	注意：细胞数量仅为估算值，实际数值可能因细胞类型及其是否为贴壁细胞而有所调整。</li>
	<li>使用流式细胞术分析样品，以确保各个独立建立的荧光细胞系之间能够被明确区分。在分析前，需准备阴性对照和单色对照，用于设定仪器参数和补偿值。 
	注意：合理设置参数以清晰区分混合的细胞群体，将有助于其在多重检测体系中的进一步应用。</li>
</ol>
5. 将基因条形码细胞系适配至选定的生物学应用
<ol>
	<li>按照 Stolp et al., 201359 中所述方法，使用含有特定检测元件的病毒颗粒转导已建立的遗传条形码细胞系。请注意，所选检测方法应占据一个额外且可区分的荧光通道，因此需将其转入相应的条形码细胞系中。 
	注意：每个条形码细胞系可携带不同的检测系统。</li>
	<li>对含有检测元件的遗传性荧光条形码细胞进行分选。 
	注意：检测元件可被设计为与标签或荧光蛋白（通过融合表达或内部核糖体进入位点）偶联，以便通过蛋白质印迹、流式细胞术或显微镜进行直接检测。本方案所用系统依赖于单独的 HA 表位表面表达，或同时表达额外的 FLAG 表位。
	<ol>
		<li>使用 HA 抗体与 APC 荧光标记的二抗对含有检测元件的克隆群体进行染色，随后用抗 FLAG 抗体与 FITC 标记的二抗进行染色分析。</li>
		<li>为追溯检测元件，应在适当的通道中对群体进行分析或“解码”，以区分不同遗传条形码的细胞系。此处，通过在 PE 通道中检测 tdTomato 来解码底物的性质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文结合了两种成熟的技术：通过逆转录病毒技术进行基因工程改造，以及利用流式细胞术检测荧光蛋白。基于荧光蛋白的遗传条形码技术可用于构建独特的细胞系，为多重应用提供了一种稳健且简便的方法。通过逆转录病毒技术生成带有遗传条形码的工程化细胞最初是一个耗时较长的过程，但一旦建立成功，便可获得稳定可靠的细胞材料来源。该技术能够持续产生具有稳定荧光特性的基因工程细胞系，这些稳定的荧光特征即成为每种细胞独有的、可明确区分的生物标记。
利用基于其物理吸收/发射光谱易于区分的荧光蛋白，可对贴壁和非贴壁细胞类型进行条形码标记。这些荧光蛋白包括但不限于CFP、mCherry、E2 Crimson和tdTomato。一旦通过可区分的荧光蛋白进行遗传条形码标记，这些细胞即可混合，形成一组细胞群体。重要的是，该组细胞群体具有完全相同的基因型组成，仅在荧光特性上有所区别。因此，这类细胞组合非常适用于多重检测应用，可显著提高高通量分析能力。
由于逆转录病毒颗粒在插入宿主基因组时具有不同的插入偏好，加之感染复数（MOI）的差异，所携带的特定荧光蛋白基因产生的荧光...

荧光光谱技术、荧光显微镜技术和流式细胞术等均依赖于荧光现象，而荧光在生物化学、生物医学和化学应用中被广泛利用。无论是内源性荧光还是通过标记产生的荧光，均已用于分析蛋白质表达模式与表达谱、细胞命运、蛋白质相互作用及生物学功能1-9，并通过荧光/福斯特共振能量转移（FRET）技术用于检测生物大分子间的相互作用及构象变化10-13。自从分离出Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（GFP）14以来，研究人员又从其他刺胞动物（尤其是珊瑚）中发现了更多天然存在的荧光蛋白，显著增加了具有可区分激发/发射光谱的荧光蛋白种类。此外，通过对这些蛋白基因引入突变15-19，进一步拓展了其应用可能性，使科学家能够获得一系列真正的荧光蛋白工具，广泛应用于显微成像、流式细胞分析及其他基于荧光的技术研究中。
与此同时，尽管是独立发展，逆转录病毒技术的进步极大地促进了外源遗传信息在哺乳动物细胞中的稳定表达20-23。因此，该技术被广泛用于将荧光蛋白基因导入多种细胞类型和组织24-28，或用于制备转基因动物29-31，也就不足为奇了。根据逆转录病毒的特性，外源荧光蛋白的遗传信息被整合至细胞基因组中32，从而使细胞实现永久性荧光标记。这一特性使得研究人员能够追踪细胞命运，或在一群细胞中追踪单个细胞。此时，该荧光标记的细胞已获得独特的生物标识，可被视为“条形码化”细胞。其独有的生物标识可将其与其他细胞区分开来，更重要的是，能够将其与那些经基因改造表达不同荧光蛋白（具有可区分的吸收/发射光谱）的细胞区分开。例如，在追踪重编程因子向多能性转化的过程33、分析核内亚结构因子以阐明核仁定位机制34、构建荧光报告质粒用于转录研究35，以及对神经元进行遗传标记以研究神经网络结构36等生物学应用中，均已利用不同的荧光蛋白基因实现了相同的实验设计，以上仅是其中四个实例。
流式细胞术已广泛用于在单细胞水平上分析生物学过程，例如基因表达、细胞周期、凋亡以及通过磷酸化介导的信号传导37-43。荧光蛋白基因在哺乳动物细胞中的稳定表达进一步增强了流式细胞术在细胞分析38,44以及配体-受体相互作用研究45中的应用价值。技术能力的提升使得流式细胞术成为高通量、高内涵筛选中广泛应用的方法学46。尽管目前可用于整合酶标仪、成像系统和流式细胞仪的荧光检测设备及机器人技术数量不断增加，但在实验设计方面似乎仍缺乏能够充分利用并适配这些增强型技术能力的策略。
在多重化应用中，迫切需要快速、可靠、简单且稳健的基于细胞的方法学，以进一步增强高通量能力。这一点在药物发现领域尤为突出，因为在多重化格式中构建基于细胞的检测方法可显著提升高通量筛选的效能39,47-50。多重化技术能够在单一样本中实现同步分析，从而进一步提高高通量能力51-54。荧光遗传条形码技术不仅实现了优雅的多重化检测，而且一旦构建完成，便可避免耗时的实验流程，减少抗体、微珠和染料相关的成本39,52,55，并可降低高通量应用所需的筛选次数。我们近期已描述了如何利用逆转录病毒技术通过荧光遗传条形码增强生物学应用中的多重化能力，即表达先前开发的用于监测HIV-1蛋白酶活性的检测系统56,57，并应用于多种临床上常见的变异体58。本方法以更详尽的方式阐述了如何筛选和扩增携带遗传荧光条形码的细胞，以及如何构建表达不同荧光蛋白和/或不同荧光强度的单克隆细胞群体阵列。基于荧光特征可区分的细胞群体阵列增强了多重化能力，可进一步与针对不同生物学问题的基于细胞的检测方法联合应用。该方案还描述了如何构建携带实验室先前开发的一种基于细胞的检测系统的条形码细胞阵列作为示例59。因此，本方案的目的并非展示已广泛确立的逆转录病毒/慢病毒基因转移技术、荧光蛋白的价值或流式细胞术的应用60,48，而是展示将这三种技术结合用于多重化应用所具有的增强能力。

<table><tbody><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td>用于过滤病毒</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 聚四氟乙烯滤器</td><td>Pall Corporation</td><td>4219</td><td>用于过滤病毒</td></tr><tr><td>DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Corning</td><td>45000-304</td><td>HEK 293T 细胞的细胞生长培养基</td></tr><tr><td>PEI（聚乙烯亚胺）</td><td>Poly Sciences</td><td>23966-2</td><td>使用浓度为 2 mg/ml</td></tr><tr><td>水平转子离心机（带制冷）</td><td>Eppendorf</td><td>5805 000.017</td><td>用于离心感染</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>用于细胞洗涤</td></tr><tr><td>Polybrene（六亚甲基双溴化铵）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>用于提高病毒感染效率，使用浓度为 5 &amp;micro;g/ml。</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>用于细胞群体分选的仪器</td></tr><tr><td>FACSCanto</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>用于细胞分析的仪器</td></tr><tr><td>Phoenix-GP</td><td>由 Gary Nolan 惠赠</td><td></td><td>用于产生逆转录病毒颗粒的细胞系</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Mediatech</td><td>MT35015CV</td><td>用于细胞生长和分选</td></tr><tr><td>SupT1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>人 T 淋巴母细胞</td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>人胚胎肾细胞，同时含有 SV40 大 T 抗原</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>SupT1 细胞的细胞生长培养基</td></tr></tbody></table>

使用荧光蛋白进行多重应用的遗传条形码技术

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

荧光蛋白、荧光染料以及一般的荧光基团已经彻底改变了分子细胞生物学领域。特别是荧光蛋白及其基因的发现，使得研究人员能够构建用于定位的融合蛋白，分析目的蛋白的转录激活与翻译过程，或对单个细胞及细胞群体进行普遍示踪。将荧光蛋白基因与逆转录病毒技术相结合，进一步实现了这些蛋白在哺乳动物细胞中稳定且可靠的表达。本文展示了如何利用这些基因赋予细胞群体中各个细胞独特的生物条形码。由于该生物条形码通过逆转录病毒技术实现，因此细胞的标记是“永久性”的。因此，可在混合的条形码细胞中对各个细胞进行独立追踪，并将其应用于更复杂的生物学研究中。在细胞混合物中追踪不同细胞群体的方法特别适用于多重化应用，例如针对多个靶点的药物筛选，或不同启动子的激活谱分析。本实验方案详细描述了如何高效地构建并扩增带有不同遗传性荧光标记的条形码哺乳动物细胞，以及如何同时使用多个标记，或以不同强度使用单一标记。最后，本方案还阐述了如何将这些细胞进一步结合基于细胞的检测方法，通过多重化分析提升研究效能。

为了实现生物学应用中的多重检测，必须首先生成独立的克隆细胞群体。当带有条形码的细胞群体具有清晰且互不重叠的荧光特征时，多重检测的效果最佳。图1展示了哺乳动物SupT1细胞克隆群体的示例，说明表达mCherry和青色荧光蛋白（CFP）的条形码细胞可被同时分析，而不会丧失各自的荧光特性。因此，该矩阵展示了一组可用于多重生物学应用的荧光基因条形码细胞，且仍可在另一个可用检测通道中进行读数。为获得此类细胞组合，需牢记逆转录病毒技术的特性，该技术会因插入位点效应和/或感染复数（MOI）导致群体内荧光强度存在较大差异。图2显示，使用携带tdTomato或E2Crimson的病毒颗粒对哺乳动物细胞进行初始转导后，细胞表达一种或两种荧光蛋白的强度范围较广（左图）。如门控框所示，将单个细胞分选至96孔板中（中图），可在扩增后获得均一的克隆群体（右图）。均一性群体应具有较小的变异系数（CV），其具体数值因细胞类型而异，通常在平均荧光强度上的CV为30-40%。图2还表明，即使仅使用两种荧光蛋白构建矩阵，也可通过利用荧光强度差异进一步增加基因条形码群体的数量...

自从发现绿色荧光蛋白基因以来，荧光蛋白已对分子细胞生物学产生了深远影响。本实验方案描述了如何通过基因工程表达不同的荧光蛋白，从而实现对单个细胞的条形码标记。该方法可用于追踪细胞混合物中的不同细胞群体，特别适用于多重化应用。

荧光蛋白、荧光染料以及一般意义上的荧光基团已经彻底改变了分子细胞生物学领域。特别是，荧光蛋白的发现……

本实验的总体目标是利用荧光条形码标记哺乳动物细胞，以增强依赖不同荧光信号读出的多重高通量生物学检测。为此，使用逆转录病毒颗粒在哺乳动物细胞中稳定表达荧光蛋白，从而实现细胞的条形码标记。随后通过荧光激活细胞分选技术获得克隆性的条形码细胞群体。随后扩增克隆群体，合并后通过流式细胞术进行分析，以确认它们彼此之间可被区分，因而可同时使用。最后，用带有标签的检测方法转导条形码细胞系。利用与条形码通道不同的荧光通道监测蛋白质和生物学活性。结果表明，荧光条形码标记哺乳动物细胞的方法在高通量环境中具有多重应用价值。该技术相较于现有方法的主要优势在于，无需对抗体或染料进行精细校准；一旦建立基因条形码标记的细胞系，便无需进一步操作，且由于目标蛋白可长期表达，这些细胞系还可进一步用于生物学适应性研究。将荧光基因条形码标记的细胞系与细胞表面检测相结合，可使我们在高通量模式下独立地研究各种生物学功能或效应。在本示例中，我们采用荧光遗传条形码包被技术，以多重监测不同病毒底物的切割情况。该检测方法还可进一步用于研究参与切割过程的分子机制，并适用于高通量药物筛选。转染前一天，将 2.5 × 10⁶ 个 Phoenix GP 细胞接种于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中的 10 厘米培养皿中。该包装细胞系可稳定表达用于逆转录病毒颗粒形成的 gag 和 pol 蛋白。在转染当天，使用明场显微镜观察细胞。用于转染的细胞必须健康，并以单层形式贴附于培养皿表面。接下来，将125微升无血清DMEM培养基用于制备DNA转染混合物。加入3微克水疱性口炎病毒包膜糖蛋白载体（P-C-I-V-S-V-G）和3微克携带目的荧光蛋白基因的转移载体，再加入15微升聚醚胺转染试剂，混匀以获得携带不同荧光蛋白标记的病毒颗粒。为实现此目的，需针对所选标记物分别独立进行每次转染。将混合物加入细胞后，在室温下孵育15分钟。随后将培养板在37摄氏度下孵育。可选步骤：24小时后，更换为七毫升新鲜培养基。尽管这可能改善细胞的健康状态，但可能会降低上清液中的病毒载量。转染后48小时，使用移液器将含有病毒颗粒的上清液转移至10毫升注射器中，安装0.20微米聚四氟乙烯滤器，推动活塞，将滤过液分装至2毫升微量离心管中。留出 2 毫升等分试样用于立即使用。将剩余的病毒上清液及等分试样置于冰上，并转移至 -80 °C 保存，直至在六孔板的每个孔中进行转导前 24 小时使用。每个孔接种 2.0 至 3.0 × 10⁵ 个贴壁细胞，此处使用 293T 细胞。第二天，为转导贴壁细胞，从板中移除现有培养基。向之前收集的 2 毫升病毒悬液中加入 5 微克/毫升的 poly brain，轻柔地将混合物加入细胞中。用封口膜密封培养板，然后将培养板置于离心机的吊桶中。在32摄氏度下以1500 × g离心120分钟。离心后，将细胞置于37摄氏度、5% CO₂环境中孵育。24小时后，更换细胞培养基，且换液间隔至少为72小时。转导后。准备通过流式细胞术分析转导的细胞，以定量转导的百分率。首先，使用可比的未转导细胞系作为阴性对照，确保门控正确设置在相应的通道中。将参数通道电压设置为使阴性群体在每个感兴趣的荧光轴上的数值低于10的3次方。接下来，以阴性对照以外出现的事件设定阳性荧光门。然后利用转导后的细胞，确定特定荧光通道的阳性百分比。将细胞分选至含有1毫升100% FBS的15毫升锥形管中。然后在水平转子离心机中以524 × g、32°C离心5分钟，沉淀分选后的细胞群体。离心后，将细胞重悬于1毫升新鲜培养基中，然后在6厘米培养皿中加入2毫升DMEM，接种两份各10的6次方个细胞。在此浓度下，细胞融合度低于60%，可支持细胞生长和分裂至少两天。将细胞置于37摄氏度的培养箱中培养数天，以进行扩增。克隆群体可从最初转导的细胞或分选后的细胞中获得。在此阶段，根据所选荧光信号对细胞群体进行分选，而非对单个克隆进行分选，可确保为后续筛选保留备份细胞群体。若需要，应根据目标细胞群体设置分选门控，并确保门控之间至少相隔一个对数尺度。若使用自动细胞分配装置进行单细胞分选至96孔板，需注意每孔平均将含有一个细胞。某些孔中可能没有细胞，而另一些孔中可能含有一个以上的细胞。分选后，将细胞在37摄氏度条件下培养至少两周，以扩增单个克隆。定期在显微镜下观察细胞，确保生长的细胞群来源于单个细胞，而非多个细胞。同时确保细胞在两周后未出现过度生长。通过流式细胞术对疑似单克隆群体进行筛选，并将其与阴性对照群体进行比较。真正的单克隆群体应表现出非常紧密的荧光模式。根据平均荧光强度和细胞群体的紧密程度，选择分离最明显的细胞群体。根据需要进行扩增，或短期保存于含10% DMSO的冻存液中（-80°C），长期保存则置于液氮中。接下来，检测这些单克隆细胞群体是否可用于多重高通量筛选系统。选择一组具有可区分的吸收光谱、发射光谱或不同荧光强度的克隆，并将它们混合至同一管中作为种子细胞。每孔加入200微升含补充剂的DMEM培养基，其中包含50,000个混合细胞，接种于96孔板的各个孔中。同时准备阴性对照和单色对照，用于在流式细胞仪上设置参数和补偿值。设置补偿值，然后分析样本，以确保能够区分每个独立建立的荧光细胞系。为了将条形码细胞系应用于生物学实验，首先选择经过改造的检测元件，使其通过融合方式或内部核糖体进入位点与标签或荧光蛋白偶联。IRES，可通过蛋白质印迹、流式细胞术或显微镜进行直接检测。此处使用的系统包含一种生物学检测方法，其中HIV包膜蛋白在细胞表面表达，并暴露出其HA标签和Flag标签。该检测蛋白在表达TD番茄红荧光蛋白的条形码细胞中表达。可通过使用FSE标记的抗Flag抗体染色来监测蛋白质的切割情况。当蛋白质未被切割时，可观察到染色信号；而当蛋白质被切割后，绿色荧光标记不再明显。为了在条形码细胞中建立生物学检测，需用含有选定检测元件的病毒颗粒转导这些细胞。向选定的细胞中加入病毒性 SUP natin，并通过离心进行旋转处理。接着，用荧光标记的抗 HA 抗体孵育细胞。然后，对带有条形码的细胞进行分选，以分离出含有对 ha 呈阳性反应的检测元件的细胞。最后，将含有不同底物的、带有不同条形码的细胞系混合。每种细胞系包含一种带有不同底物的检测体系。将细胞混合物与抗Flag抗体和ZI偶联抗体共同孵育，然后通过流式细胞术进行分析，以确定蛋白是否发生切割，从而追溯检测结果，在适当的通道中分析或解码细胞群体，以便区分具有不同遗传条形码的细胞系。通过TD番茄的PE通道，随后在fite通道中分析以解码底物的性质，从而揭示阳性细胞群，用于检测分泌途径中表面表达蛋白的切割情况。将Sub T一个细胞进行荧光条形码标记以表达TD番茄，并根据不同的荧光强度分选为三个细胞群。然后，每个细胞群分别转导不同的逆转录病毒，以诱导表达野生型HIV包膜蛋白、突变型HIV包膜蛋白或登革病毒包膜蛋白。PRM 边界蛋白，其两侧分别带有 Flag 和 HA 标签。将转导后的细胞与抗 HA 和抗 Flag 抗体共同孵育。通过抗 HA 染色确认工程化检测蛋白的存在，而抗 Flag 染色用于判断该蛋白是否被切割。当通过流式细胞术分析未染色的混合群体时，可根据 TD 番茄条形码区分克隆群体，但在 fite 通道中无法区分。相反，当用 flag fite 抗体对相同群体进行染色后，其中一个群体对 flagg 呈阳性。根据条形码信息，可轻松将该群体鉴定为携带突变型 HIV 包膜底物 it 的群体。现在，您应该已经充分掌握了如何将反向阀技术与流式细胞术结合使用。为了建立带有荧光遗传条形码的细胞系，可在多重体系中实现四种生物学应用。将带有荧光遗传条形码的细胞与基于细胞的检测方法以多重形式相结合，可显著增强高通量检测能力。在细胞系构建完成后，必须及时将其冻存。然后定期将它们解冻，重新分析，并再次冻存。尽管最初建立荧光标记的遗传条形码细胞系可能较为耗时，但一旦建立完成，将显著提高未来应用的重复性和稳健性。

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