Name: 娜功能分析 + / H +细胞内的隔间使用质子打死选择器来表达它们的质膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解如何通过质子致死筛选法选择表达钠氢交换体的细胞系，并测量细胞内pH恢复与快速离子摄取动力学，以确定转运蛋白的亲和常数与离子选择性。该方法为研究细胞pH调控机制提供了可靠手段。

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作者们衷心感谢所有致力于pH值和离子转运研究的科学界成员，正是他们开创并改进了本文所描述的测量方法。特别感谢Jacques Pouysségur博士，他首创了本研究中所采用的H+-杀伤筛选技术。同时感谢尼斯-索菲亚安提波利斯大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家研究局（ANR，项目编号JCJC SVSE1 NHEint）以及ICST Labex提供的支持。

1. H+ 杀伤筛选
<ol>
	<li>细胞系
	<ol>
		<li>使用任意组合的哺乳动物表达载体和转染方法，对 NHE 缺陷型细胞（例如，源自 CCL39 的 PS120 细胞系16）进行稳定转染，以实现高效的转染效率，并可在成纤维细胞系中进行筛选。 
		注意：多年来一直采用磷酸钙沉淀法19，转染效率良好。近年来已被 Lipofectamine2000 等商业化试剂取代，转染操作按照制造商说明书进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液
	<ol>
		<li>按以下描述配制三种无菌溶液，并通过过滤（0.22 µm）进行灭菌。
		<ol>
			<li>配制 NH4+ 加载溶液（pH 7.4），包含 50 mM NH4Cl、70 mM 胆碱氯化物、5 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖和 15 mM MOPS，调至 pH 7.4。</li>
			<li>配制洗涤溶液（pH 7.0），包含 120 mM 胆碱氯化物、5 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，调至 pH 7.0。</li>
			<li>配制恢复溶液（pH 7.4），包含 120 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，调至 pH 7.4。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始筛选前，准备一个可在 37 °C 下使用且不连接外部 CO2 气源的细胞培养箱（称为无 CO2 培养箱），因为 5% CO2 会导致缓冲作用，可能干扰酸化过程。将表达目标 NHE 的细胞系扩增至约 2 × 108 个细胞（通常约为 20 个汇合的 100 mm 培养皿）。</li>
	<li>H+ 杀伤程序：
	<ol>
		<li>将表达目标胞内 NHE 的细胞在无 CO2 培养箱中，于 37 °C 下在加载溶液中孵育 1 小时。</li>
		<li>吸除加载溶液，然后用上述洗涤溶液清洗两次。此步骤需操作迅速，以彻底去除残留的细胞外 NH4Cl，否则会影响形成陡峭的 NH4+ 梯度，进而影响酸化过程。</li>
		<li>吸除洗涤液后，将细胞再次置于无 CO2 培养箱中，在恢复溶液中于 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>将恢复溶液更换为常规培养基（通常为含 7.5% FCS 的 DMEM），并在标准培养条件下（37 °C，5% CO2 和 95% 空气的湿润环境）继续培养细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周重复该筛选循环两次，直至出现稳定的克隆。 
	注意：需特别注意细胞培养和筛选条件。长时间培养及反复操作易导致污染，可能毁掉数月的工作成果。
	<ol>
		<li>此处选择是将克隆扩增后单独进行表征（如第 2–3 节所述），还是将它们混合以生成细胞群体后再进行表征。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为保留耐酸化细胞，需定期进行反向筛选（约每两周一次），以淘汰可能已恢复为亲本酸敏感表型的细胞（图 1B）。</li>
</ol>
2. 细胞内pH值测定
2.1）荧光pH成像
<ol>
	<li>按照制造商的说明，使用比率型pH敏感性荧光染料BCECF/AM，该染料在490 nm激发时对pH敏感，并具有445 nm的等吸收点。
	<ol>
		<li>或者，可根据制造商的说明使用其他pH敏感探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用由倒置显微镜与高灵敏度视频相机组成的成像系统。该系统应配备450 nm和490 nm窄带干涉滤光片，并搭配适当的石英中性密度滤光片用于激发。
	<ol>
		<li>如有可能，应使用合适的滤光片组合和照明条件，使λ1和λ2的荧光值相近，从而使比值接近1。同时应避免λ1和/或λ2的本底荧光值过高（饱和）或过低。否则可能产生重要的人为假象，导致即使细胞内pH发生变化，也无法检测到比值变化。 
		注意：该系统必须能够实现快速灌流，并可在上述两个激发波长下进行时间序列激发，同时在适当的发射波长（BCECF为535 nm）进行信号采集。系统应配备可实现自动数据采集和存储的软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.2）NHE 正向活性的测量（细胞质中质子的排出）
<ol>
	<li>在无 CO2 条件下，将细胞在 NH4+ 负载液中孵育 1 小时，以酸化细胞（见步骤 1.4）。</li>
	<li>在孵育的最后五分钟，向溶液中加入 BCECF-AM（终浓度为 5 µM），然后用 NH4+ 负载液冲洗，以去除细胞外探针。</li>
	<li>将细胞置于显微镜下，采集多张图像以记录稳定的基线。灌注冲洗液（见上文）。此操作将导致荧光下降，对应于细胞内酸化过程。</li>
	<li>在 pH 稳定后，灌注以下任一溶液，以测定由 Li+/H+、Na+/H+ 或 K+/H+ 交换介导的 pH 恢复速率。每种溶液均含有一种待测的潜在耦合阳离子，用于 H+ 交换。若其中任一阳离子被转运，将在 495 nm 处引起荧光增强，对应于细胞内 pH 升高： 
	120 mM LiCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，pH 7.4 
	120 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，pH 7.4 
	125 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，pH 7.4</li>
</ol>
2.3）NHE 反向活性的测定
注意：此处的原理是逆转跨膜离子梯度。
<ol>
	<li>在测量之前，用感兴趣的细胞内阳离子对细胞进行加载（见下文）。</li>
	<li>用BCECF/AM孵育5分钟（见步骤2.2.2）；冲洗后，置于视频显微镜下观察。</li>
	<li>灌注上样溶液，并采集多张图像以记录稳定的基线。</li>
	<li>在基线稳定后，当细胞灌注含有 120 mM 氯化胆碱、5 mM KCl、1 mM MgCl₂ 的细胞外酸性溶液时，观察 pH 值的变化2，2 mM CaCl2，5 mM 葡萄糖和 15 mM MES，pH 6.5。</li>
	<li>对于 LiCl 负载，将细胞在含有 120 mM LiCl、5 mM KCl、1 mM MgCl 的溶液中孵育 2 小时2，2 mM CaCl2，5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，pH 7.4。通过原子吸收光谱法测得的细胞内锂浓度约为 60 mM。</li>
	<li>用于 Na+ 孵育，将细胞在含有 120 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl 的溶液中孵育两小时2，2 mM CaCl2，5 mM 葡萄糖和 15 mM HEPES，pH 7.4，同时加入 1 mM 乌本苷以抑制 Na/K ATP酶。在此条件下，细胞内 Na+ 浓度在 40 mM 范围内。 
	注意：K+ 无需进行上样，因为胞质中的 K+ 浓度在140 mM范围内，因此容易形成向外的K+浓度梯度。</li>
</ol>
2.4）数据处理与校准：
注意：此步骤适用于正向和反向测量。
<ol>
	<li>每次实验结束时，用含有 140 mM KCl、20 mM HEPES 和 5 µM 缬氨霉素（nigericin）的溶液灌注细胞，该溶液的 pH 值需调节至 6.5 至 7.4 之间。</li>
	<li>从图像中收集荧光测量数据（灰度值代表荧光强度），以文本格式导出，并按以下说明使用电子表格软件进行处理。</li>
	<li>使用以下公式计算每个单个细胞或感兴趣区域的细胞内 pH 值： 
	pH = pKa + (Log (R-Rmin)/(Rmax-R))x Fmin(λ2)/Fmax(λ2)</li>
	<li>如果探针发生漂白或泄漏，导致实验过程中 450 nm 荧光信号下降，则使用 Fmin(λ2)/Fmax(λ2) 比值进行校正。然而，在本实验所描述的条件下，这种情况极为罕见。</li>
	<li>由于每次 pH 测量结束后均包含校准数据，需检查相应计算出的 pH 值是否与用于校准的 pH 值存在差异。若存在差异，则按以下步骤对所有实验测定的 pH 值进行校准校正：
	<ol>
		<li>计算以下商值（Q，即测量值之差与校准值之差的比值），将整个数据集乘以 Q，再通过加或减进行最终调整，使计算值与相应的校准值一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过快速锂置换法测定NHE7的初始速率+ 摄取
<ol>
	<li>将细胞接种于多孔板（6 至 24 孔）中，并使用上述的 NH4+ 负载法，或参考文献20中所述的尼日里菌素/牛血清白蛋白（BSA）酸化法对细胞进行酸化处理。</li>
	<li>用上述冲洗液快速冲洗孔板两次，然后将细胞在含有 1–10 mM 锂（略低于 Km 值）以及所需浓度的目标阳离子和/或抑制剂的摄取溶液中孵育一定时间。</li>
	<li>保持较短且一致的摄取时间（通常为一分钟或更短），以确保转运过程处于初始速率条件下。同时确保所有用于摄取实验的溶液均为等渗溶液。</li>
	<li>摄取时间结束后，小心移除摄取液，并用预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞四次。洗涤过程应尽可能迅速（四次洗涤总时间少于 10 秒为宜），以防止锂离子外流。</li>
	<li>用 25% 硝酸裂解细胞。每孔加入 250 µl 25% 硝酸，静置至少 1 小时，然后用移液器吸头末端刮取每孔内容物，并将整个孔内悬液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>将裂解液转移至 1.5 ml 微量离心管中，在 15,000 × g 条件下离心 5 分钟（室温），以去除细胞碎片。</li>
	<li>采用原子吸收光谱法测定上清液中的锂含量21。 
	注意：不同厂商提供原子吸收光谱仪，仪器需配备锂空心阴极灯。请遵循制造商的操作说明，此类设备精度高但较为精密。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了如何在不通过定点诱变改变细胞内 Na+/H+ 交换体原始序列的情况下，筛选出在细胞质膜上表达该蛋白的细胞。现在可对这些交换体进行表征。
该方法基于细胞内质子的细胞毒性，用于筛选能够表达囊泡型Na+/+ 细胞膜上的交换器。原则上，可以使用其他可能被怀疑参与转运的阳离子，例如 Li+，K+，或 Cs+然而，这增加了一层额外的不确定性。如果筛选未获得任何阳性克隆，则很难判断是所测试的阳离子未被转运，还是交换体未定位至质膜。由于这些原因，筛选实验已采用Na+ 作为偶联阳离子，因为这是生理条件下细胞外最丰富的底物。这促使我们选择了表达 NHE7 的变异体18，以及质膜上的 NHE6 和 NHE9（Poët 和 Counillon，未发表结果）。
这种质膜表达使得可以通过以往仅适用于质膜转运蛋白的方法来测定这些转运蛋白的功能参数。当...

大多数细胞内区室均表现出酸性的腔内pH值，这是蛋白质、激素和神经递质的成熟、转运、循环以及装载过程中的一个关键参数。研究表明，细胞质与囊泡内容物之间的pH梯度由液泡型H+ATP酶1产生，并与囊泡ClC氯离子转运蛋白协同作用2。在基因敲除（KO）小鼠和人类患者中，这些转运蛋白的重要性已通过其基因突变所导致的严重表型得以证实3-6。
SLC9A家族的钠-氢交换体成员，也被称为Na+/H+交换体（NHEs），已被证实是细胞内pH值和细胞体积调节以及上皮细胞酸碱当量定向转运中的关键效应分子。除了位于质膜上的NHEs外，还有三种高度保守的Na+/H+交换体NHE6、NHE7和NHE9在高尔基体反面网络和早期内体中表达7。这些交换体基因的突变已被证实与Angelman样综合征或Christianson综合征8-9、家族性自闭症10以及注意缺陷多动障碍11-12相关。这些交换体还参与了阿尔茨海默病易感性13和X染色体连锁智力障碍邻近基因综合征14等神经退行性疾病。综上所述，这些研究凸显了这些细胞内NHEs在大脑发育和/或功能中的重要作用。
这些交换蛋白的细胞内定位阻碍了对其离子选择性、转运方向、动力学参数及调控机制的准确测定。与所有表达于细胞内区室的转运蛋白一样，评估其生化活性极为困难，因此难以充分理解其生理功能以及相关病理机制。基于细胞质中较高的K+浓度，目前最普遍接受的假说是这些蛋白作为K+偶联的质子外排转运蛋白发挥作用。此类质子泄漏的存在早有推测，因其可能抵消V-ATPase的质子泵送作用，从而维持囊泡pH的稳态。本文的可视化文章旨在：（i）展示一种可实现将此类囊泡转运蛋白在细胞质膜上表达的细胞系进行遗传筛选的方法；（ii）介绍两种独立的方法以检测这些转运蛋白的功能。
三十年前，Pouysségur 和 Franchi 开创了一种遗传学方法，实现了对 NHE 家族成员的分子克隆与表征15。该方法基于细胞内质子的毒性作为筛选手段。第一步是利用该转运体的可逆性，获得质膜上任何 Na+/H+ 交换功能缺失的细胞系。成纤维细胞（CCL39 细胞系）先用 Na+ 或 Li+ 预加载，随后置于酸性细胞外环境（pH 6.5）中 2 小时。这导致表达功能性 Na+/H+ 交换的细胞死亡，从而筛选出缺乏反向转运体的细胞（PS120 细胞系）16。当在无碳酸氢盐的培养基中培养时，这些细胞对急性细胞内酸化极为敏感。因此，若此类细胞经历急性细胞内酸化处理，则任何在质膜上表达的功能性质子外排机制都将被正向筛选出来（见17）。此类酸化技术可用于分离具有转运缺陷的细胞系，从而强制使野生型（WT）细胞内 NHE 在质膜上表达。
由于真核生物的Na+/H+交换体是电中性的，因此无法使用在通道测量中极为成功的电生理学方法进行检测。本文因此展示了如何通过细胞内pH值测定以及锂离子快速摄取动力学来测量该交换体的活性。值得注意的是，由于其基本原理相同，为筛选部分所开发的许多方法也可直接用于功能测定。
有趣的是，我们观察到，采用本文所述方法筛选出的细胞系中存在的转运缺陷，会导致其他囊泡蛋白（如囊泡钾通道TWIK118）在细胞膜上的表达水平更高。这表明可能存在一种针对囊泡跨膜蛋白的普遍滞留缺陷机制。因此，该筛选方法及其所产生的细胞系可能为从事细胞内区室膜蛋白研究的科学界提供一种有前景的工具。此外，本文所介绍的检测技术也可能适用于研究其他非电致性转运蛋白。

<table><tbody><tr><td>标准细胞培养设备</td><td></td><td></td><td>用于由多种不同目录号设备组成的 H+ 杀伤筛选</td></tr><tr><td>带 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;的培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>不带 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;的培养箱</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>层流罩 PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>优质胎牛血清（FBS gold）</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>带塞曼炉系统的原子吸收光谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>荧光视频显微镜系统</td><td>Leica</td><td></td><td>由多种不同目录号设备组成</td></tr><tr><td>倒置自动显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜支架</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>透射荧光装置</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>电机支架</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED 透射光源&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>相机输出模块</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>图像采集/分析软件</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>光学部件</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>荧光氙灯</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>Metafluor/Mmfluor 软件</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH 敏感探针 BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>尼日霉素（Nigericin）</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 na+/h+ 交换体并进行功能表征

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

内体酸化对于多种生理过程至关重要，例如蛋白质的回收与降解、受体脱敏以及突触囊泡中神经递质的装载。这种酸化过程被认为由质子ATP酶介导，并与ClC氯离子转运体相偶联。此外，在这些细胞器中还表达一类高度保守的电中性质子转运体——Na+/H+交换体（NHE）6、7和9。这些基因的突变已被证实与人类认知障碍及神经退行性疾病相关。然而，由于其定位于细胞内膜结构，导致难以进行详细的功能表征，因此它们的具体作用仍不明确。本文介绍了一种解决该问题的方法，即筛选能够在急性胞质酸化条件下存活的突变细胞系，这些细胞系可将细胞内NHE保留在质膜上。随后，本文展示了两种互补的实验方案，用于测定这些交换体的离子选择性与活性：（i）基于荧光视频显微镜检测细胞内pH变化的方法；（ii）基于锂离子快速摄取动力学的测定方法。这些实验方案可推广应用于其他非生电性转运体的功能研究。此外，本文所描述的筛选方法可获得具有细胞内滞留缺陷表型的细胞，因此这些细胞会将其他囊泡膜蛋白也表达于质膜表面。由此可见，本文所提出的实验策略可能成为一种强有力的工具，用于研究那些随着筛选所用的囊泡Na+/H+交换体一同在质膜上表达的其他细胞内蛋白。

选择：
H+ 杀灭筛选基于弱碱性物质铵离子的扩散，如图1A所示。Walter Boron 及其合作者最早研究了弱酸弱碱扩散对细胞内pH的影响22。随后，Jacques Pouysségur 进一步发展了利用该现象诱导致死性酸化以实现正向遗传筛选的巧妙思路17。在此类实验方案中，冲洗步骤后细胞内pH值会降至约5.5。若细胞未能在质膜上表达有功能的NHE，则无法恢复中性pH值，表现出典型的酸化形态，即细胞扁平、胞质颗粒化（图1B）。经过多次重复筛选（约每周两次H+杀灭处理），能够完全且稳定耐受该酸化环境的细胞逐渐出现，频率约为10-7（图1C）。由此可形成单个细胞克隆，可根据需要对克隆进行单独鉴定，或混合获得细胞群体。可开展细胞表面生物素化标记或RNA沉默等常规实验，以验证在质膜上表达的蛋白确为细胞内NHE（如NHE7）（例如参见 Milosavljevic et al...

本文的第一部分介绍了如何筛选在细胞质膜上表达囊泡型 Na+/H+ 交换体的突变细胞系。第二部分提供了基于细胞内 pH 值测定和快速离子吸收的实验方案，用于确定这些交换体的离子选择性及动力学参数。

利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na+/H+ 交换体并进行功能表征

内体酸化对于多种过程至关重要，例如蛋白质的回收与降解、受体脱敏以及……

以下实验的总体目标是测量细胞内表达的钠-质子交换体的活性。首先通过质子杀伤筛选法，选择在质膜上表达细胞内钠-质子交换体的细胞；第二步，将筛选出的细胞进行酸化处理，随后测量细胞内pH的恢复情况，以确认细胞的钠-质子交换活性。随后通过测量离子转运的快速动力学，以确定被转运阳离子及其抑制剂的亲和常数。最终，通过监测选定体细胞内pH值的变化及其快速动力学，可实现对细胞内蛋白质交换功能的表征。该技术相较于现有方法（如表达突变型转运蛋白或使用透化细胞）的主要优势在于，它能够使野生型细胞内转运蛋白在质膜上表达，从而可直接测定其功能。演示该实验操作的是来自我实验室的研究科学家Dr. Mallory poet。开始进行质子杀伤实验时，首先将表达目标细胞内钠-质子交换体的细胞置于加载液中，在37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育1小时。接着，吸除加载液，并用新鲜培养基将细胞洗涤两次。第二次洗涤后，吸去培养基，将细胞在无二氧化碳培养箱中用复苏液孵育。再过一小时后，将复苏液更换为常规培养基，并在标准培养条件下培养细胞。每周重复两次该筛选循环，直至获得稳定的克隆，用于成像细胞内荧光pH值。首先配备一套成像系统，包括倒置显微镜、高灵敏度视频相机，以及用于激发的450纳米和490纳米窄带干涉滤光片，并配合适当的石英中性密度滤光片。如果可能，使用适当的滤光片组合和照明条件，使通道一和通道二的荧光值相近，从而使比值接近1，以测量钠-质子交换体的正向活性。接下来，用氯化铵负载溶液孵育细胞1小时，以酸化细胞。在孵育的最后五分钟内，若无二氧化碳存在，则用一种比率型pH敏感性荧光染料对细胞进行染色。孵育结束后，用氯化铵加载液冲洗细胞，以去除细胞外的探针，并将染色后的细胞置于显微镜下。根据需要选择感兴趣区域，用于测定荧光值。然后记录多张图像以建立基线，用RIN溶液灌注细胞以引发荧光下降。待pH值稳定后，用感兴趣的溶液灌注细胞，以测量由锂-氢、钠-氢或钾-氢交换介导的pH恢复速率。接着用添加了氯化钾和gerin的hippies溶液灌注细胞。然后从图像中收集荧光测量数据，并将数据以文本格式导出至电子表格程序，以测定钠-质子交换体的初始速率。七、通过快速锂离子摄取，采用上述展示的伊米迪乌姆（Imodium）负载技术对细胞和多孔板进行酸化处理。接着，按照上述方法快速冲洗多孔板两次。然后将细胞在含有1至10微摩尔锂以及所需浓度的目标阳离子或抑制剂的摄取溶液中孵育，时间约为一分钟或更短。在摄取阶段结束时，小心移除摄取液，并在少于10秒内用预冷的PBS快速洗涤细胞四次，以防止锂外流。随后每孔加入250微升25%硝酸裂解细胞，室温下裂解至少1小时。孵育结束后，用移液器吸头末端刮下每孔细胞，并将各孔中的悬液转移至新的微量离心管中。最后，在室温下以15,000 ×g离心5分钟，去除细胞碎片，然后采用原子吸收光谱法测定上清液中的锂含量。根据制造商的说明，质子杀伤筛选基于弱碱性物质铵的扩散作用。例如，细胞若在质膜上不表达有功能的钠-质子交换体，则无法恢复中性pH值，因此表现出典型的酸化特征，即细胞形态扁平、胞质颗粒化，如本代表性图像所示。经过多次筛选循环后，能够完全且稳定存活的细胞即为阳性克隆。然而，这些酸化细胞会形成独立的单细胞克隆，如图所示。通过检测不同实验条件下细胞内pH值的变化，可表征定位于质膜上的细胞内钠-质子交换体的活性及离子选择性，如这些图表中在洛哌丁胺（Imodium）加载诱导酸化后所观察到的结果。关于酶动力学，初始摄取速率的剂量反应关系可进一步用于推导底物的亲和常数以及抑制剂的抑制常数。事实上，转运蛋白的一个有趣特性是不同的偶联阳离子将竞争性地参与转运过程，从而可以通过锂离子摄取与钠离子的竞争实验来测定钠离子的亲和常数，如本图所示。按照此方法进行操作。此外，还可进行其他实验，例如细胞表面生物创新技术结合RNA沉默技术，以验证目标转运蛋白是否确实表达于质膜上。

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生物学

娜功能分析<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt;细胞内的隔间使用质子打死选择器来表达它们的质膜

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