利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na⁺/H⁺ 交换体并进行功能表征

以下实验的总体目标是测量细胞内表达的钠-质子交换体的活性。首先通过质子杀伤筛选法，选择在质膜上表达细胞内钠-质子交换体的细胞；第二步，将筛选出的细胞进行酸化处理，随后测量细胞内pH的恢复情况，以确认细胞的钠-质子交换活性。

随后通过测量离子转运的快速动力学，以确定被转运阳离子及其抑制剂的亲和常数。最终，通过监测所选体细胞内 pH 值的变化及其快速动力学，可实现对细胞内蛋白质交换功能的表征。该技术相较于现有方法（如表达突变型转运蛋白或使用透化细胞）的主要优势在于，它能够使野生型细胞内转运蛋白在质膜上表达，从而可直接测定其功能。

演示该实验步骤的是来自我实验室的研究科学家Dr. Mallory poet。开始质子杀伤实验时，首先将表达目标细胞内钠-质子交换体的细胞置于加载液中，在37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育1小时。接着，吸除加载液，并用新鲜培养基将细胞洗涤两次。

第二次洗涤后，吸去培养基，将细胞在无二氧化碳培养箱中用复苏液孵育。再过一小时后，将复苏液更换为常规培养基，并在标准培养条件下继续培养细胞。每周重复两次该筛选循环，直至获得稳定的克隆，用于成像细胞内荧光pH值。

首先配备一套成像系统，该系统由倒置显微镜与高灵敏度摄像机组成，并配备450纳米和490纳米窄带干涉滤光片，同时配合相应的石英中性密度滤光片用于激发。如果可能，使用适当的滤光片组合和照明条件，使通道一和通道二的荧光强度值相近，从而使比值接近1，以测量钠-质子交换体的正向活性。接下来，用氯化铵负载溶液孵育细胞1小时以实现细胞酸化。

在孵育的最后五分钟内，若无二氧化碳存在，则用一种比率型pH敏感性荧光染料对细胞进行染色。孵育结束后，用氯化铵加载液冲洗细胞，以去除细胞外的探针，并将染色后的细胞置于显微镜下。根据需要选择感兴趣区域，用于测定荧光值。

然后采集多张图像以建立基线，再用 RIN 溶液灌注细胞，以引发荧光信号下降。待 pH 值稳定后，用目标溶液灌注细胞，以测定由锂氢、钠氢或钾氢交换介导的 pH 恢复速率。随后，用添加了氯化钾和 gerin 的 hippies 溶液灌注细胞。

然后从图像中收集荧光测量数据，并将数据以文本格式导出至电子表格程序，以测定钠-质子交换体的初始速率。七、通过快速锂离子摄取，采用刚刚演示的伊米迪乌姆（Imodium）负载技术对细胞和多孔板进行酸化处理。接着，按照刚刚演示的方法，快速冲洗多孔板两次。

然后将细胞在含有1至10微摩尔锂以及所需浓度的目标阳离子或抑制剂的摄取溶液中孵育，时间约为一分钟或更短。在摄取阶段结束时，小心移除摄取液，并在少于10秒内用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤细胞四次，以防止锂外流。随后每孔加入250微升25%硝酸裂解细胞，裂解时间至少为一小时。孵育结束后，用移液器吸头末端刮取每孔细胞，并将各孔中的悬液转移至新的微量离心管中。最后，在室温下以15,000 × g离心5分钟，去除细胞碎片，然后采用原子吸收光谱法测定上清液中的锂含量。

根据制造商的说明，质子杀灭筛选基于弱碱性物质铵离子的扩散作用。例如，若细胞在质膜上不表达有功能的钠-质子交换体，则无法恢复中性pH值，因而表现出典型的酸化特征，即细胞形态扁平、胞质颗粒化，如本代表性图像所示。经过多次筛选循环后，能够完全且稳定存活的细胞即为阳性克隆。然而，这些酸化细胞会形成独立的单细胞克隆，如图所示。通过检测不同实验条件下细胞内pH值的变化，可表征定位于质膜上的细胞内钠-质子交换体的活性及离子选择性，如在伊美达（Imodium）加载诱导酸化后的图表中所观察到的结果。

关于酶动力学，初始摄取速率的剂量反应关系可进一步用于推导底物的亲和常数以及抑制剂的抑制常数。事实上，转运蛋白的一个有趣特性是不同的偶联阳离子会相互竞争转运过程，从而可以通过锂离子摄取与钠离子的竞争实验来测定钠离子的亲和常数，如此处图示所示。通过这一实验流程，还可开展其他实验，例如细胞表面生物技术创新结合RNA沉默技术，以验证目标转运蛋白是否确实表达于质膜上。