Name: 小体积的生物测定评估细菌/浮游植物共培养使用水脉冲幅度调制（WATER-PAM）荧光 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用WATER-PAM荧光法进行小体积生物测定，快速筛选细菌与微藻共培养体系中的光合健康状态。该方法可高效识别病原菌或共生菌对藻类生理的影响，为微生物-藻类相互作用研究提供可靠工具。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（资助号 402105）、加拿大创新基金会（资助号 129087）以及阿尔伯塔省教育部与培训部（资助号 AAETRCP-12-026-SEG）对 RJC 的资助。

1. 实验设置的计算
<ol>
	<li>使用公式 1 计算整个实验所需对照用的藻类和/或细菌培养物的体积： 
	<img alt="Static equilibrium; equation: V_control=(0.5ml/well)×(3wells/control)×(ycontrols/d)×(zd); diagram." src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
	其中 y 表示每天所需的对照数量，z 表示天数。</li>
	<li>使用公式 2 计算实验所需藻类和/或细菌培养物共培养的体积： 
	<img alt="Equation for co-culture volume, V. Formula with variables for culture system calculation." src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"> 
	注意：可用任何化合物筛选替代“共培养”实验；只需根据实验设计调整最终的化合物、溶剂和藻类浓度即可。</li>
	<li>使用公式1和公式2计算对数早期藻类培养液的最终体积（通常为培养约5天后）4 细胞/ml，但应通过绘制藻类生长曲线来确定实验所需浓度（此体积用于步骤2.3），使用公式3： 
	<img alt="Equation showing volume calculation of early-exponential algal culture; VA=Vcontrol+Vco-culture+10ml." src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 3"></li>
	<li>使用公式 1 和公式 2 计算 10 的最终体积4 实验所需每毫升菌落形成单位（cfu/ml）的细菌培养物（或所需接种浓度），使用公式4计算（此体积用于步骤4.2）： 
	<img alt="Volume calculation for bacterial culture formula: VB = Vcontrol + Vco-culture + 10 ml." src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 4"> 
	注意：在步骤 1.3 和 1.4 中额外使用 10 ml，以弥补移液误差及所进行的任何检测所需用量例如， WATER-PAM，流式细胞术，显微镜检查 等等。) 在第0天。根据实验设计需要可增加此体积。 
	注意：有关8天实验的计算示例，请参见第10节。培养基配方见补充表格。</li>
</ol>
2. 实验设置用藻类细胞的培养
<ol>
	<li>分离或获取处于活跃生长期的无菌藻类培养物。</li>
	<li>无菌操作下，将藻类培养物体积的10%转移至无菌的藻类培养基中例如， L1 或类似的海洋藻类培养基（见材料与设备表），确保藻类培养物在新鲜培养基中的稀释比例为 1:9。将稀释后的藻类置于昼夜循环培养箱中，采用该藻株先前确定的生长条件进行培养（例如， 18 °C 采用16小时光照:8小时黑暗的光周期是常见的做法。</li>
	<li>当培养物进入对数生长期初期时，将藻类重新接种于相同的无菌藻类培养基中（例如， L1 或类似的海洋藻类培养基），确保最终浓度为1:9的稀释比例，且藻类的最终体积等于VA 计算（步骤 1.3）。 
	注意：必须确保这些培养物为无菌培养。通过平板培养法检测所有藻类培养基和藻类原种瓶是否存在污染， 20 μl 分装至通用海洋细菌培养基中（例如， 添加1.5%琼脂的2216号海洋肉汤或类似培养基</li>
	<li>将藻类培养物培养至对数生长期初期（约104 细胞/毫升 
	注意：每种藻类菌株的生长曲线均因其培养条件而异。对数生长期早期（约104 细胞/ml）可通过基于细胞密度的藻类生长曲线（例如使用流式细胞术或显微镜）测定。</li>
</ol>
3. 准备用于接种的细菌细胞
<ol>
	<li>预先通过在选定的细菌培养基和培养条件下绘制生长曲线，确定细菌在稳定期的菌浓度（cfu/ml）和光密度（OD）例如， Marine Broth 2216 25 °C 以及160 rpm（或类似条件）。利用该信息培养细胞（步骤3.3），并在后续步骤3.7中正确稀释细胞。</li>
	<li>无菌操作下，从1.5%琼脂平板上挑取一个分离且新鲜培养的细菌菌落（例如， 2216号海水培养基（添加1.5%琼脂）或类似的海洋细菌固体培养基，加入5 ml细菌液体培养基中例如， 海水培养基2216或类似的海洋细菌培养基</li>
	<li>在旋转滚筒或摇床中培养细菌至稳定期（约 12 - 36 小时，具体时间取决于细菌种类）。实验设计应确保细菌达到稳定期（约 108 - 109 cfu/ml）的同时，藻类细胞也达到对数生长期初期（~104 细胞/毫升</li>
	<li>使用移液器将附着在试管壁上的任何生物膜冲洗至培养基中。取1 ml充分混匀的细菌培养物，移入无菌的1.5 ml微量离心管中。在14,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>移除并弃去上清液（细菌培养基），注意不要扰动沉淀（细菌细胞）。加入1 ml无菌藻类培养基（例如， 将L1或类似物加入微量离心管（含沉淀）中。涡旋振荡微量离心管，使沉淀在藻类培养基中充分重悬。</li>
	<li>第二次洗涤：重复步骤 3.5。 
	注意：在将细菌接种至藻类之前，必须使用藻类培养基彻底清洗细菌细胞，以完全去除所有细菌培养基、细胞碎片、分泌蛋白及小分子物质，否则可能改变藻类培养基的营养成分或向筛选体系中引入具有生物活性的分子。</li>
	<li>将洗涤后的细菌细胞在藻类培养基中进行系列稀释，最终浓度为所需最终细菌浓度（cfu/ml）的100倍。将洗涤并稀释于藻类培养基中的细菌细胞保存于微量离心管中，用于步骤4.2。 
	注意：实验设计应基于第0天时藻类与细菌的比例为1:1。为此，实验所需的初始细菌浓度为104 cfu/ml，因此在步骤3.7中，初始细胞应进行连续稀释至106 cfu/ml</li>
</ol>
4. 实验设置前的细菌准备
<ol>
	<li>准备4个无菌的灭菌玻璃锥形瓶，并分别标记为：a) “藻类对照瓶”，b) “稀释细菌储备液瓶”，c) “细菌对照瓶”，和 d) “共培养瓶”。</li>
	<li>稀释来自细菌悬液的样本 步骤 3.7 用无菌藻类培养基按 1:99 稀释至终体积 = VB （步骤1.4）在标记为稀释菌液原液的烧瓶中进行稀释（步骤4.1）。 
	注意：在前面的示例（步骤 4.2）中，该 1:99 稀释度可得到 10 的最终浓度4 cfu/ml。轻轻摇动烧瓶以混匀细胞。</li>
	<li>移液管 V对照 （步骤 1.1）从稀释的菌液原液中取样，加入细菌对照瓶中。</li>
	<li>移液管 V对照 将无菌藻类培养基加入细菌对照瓶中（此为1:1稀释）。轻轻摇动瓶子以混匀细胞，置于一旁待用，进行步骤7.3。</li>
	<li>移液器 V共培养 从稀释的菌液储备瓶转移至共培养瓶，将瓶子置于一旁以用于步骤6.1。 
	注意：当同时对同一种藻类进行多次共培养时（即， 两种不同细菌分离株与一个对照组的共培养）需要重新计算V共培养 对每种菌株分别进行操作，然后对每种共培养体系分别重复步骤 4.5。同时也有必要增加 VA 在步骤1.3中计算，以包含公式5所示的两种共培养体系： 
	<img alt="Equation for total volume in co-culture experiment, V_A=V_control+V_co-culture1+V_co-culture2+10ml." src="/files/ftp_upload/52455/52455equation4.5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 5"></li>
</ol>
5. 实验设置前的藻类准备
<ol>
	<li>使用宽口移液管吸头轻轻混合对数生长期的藻类培养物（来自步骤 2.4），直至细胞均匀分散。</li>
	<li>用 10 ml 移液管从藻类原液瓶中吸取 Vcontrol 体积的藻液，加入藻类对照培养瓶中。操作时应轻柔移液，随后将藻类原液瓶放回昼夜培养箱中。</li>
	<li>向藻类对照培养瓶中加入 Vcontrol 体积的无菌藻类培养基（实现 1:1 稀释）。轻轻旋转混匀培养瓶，并置于昼夜培养箱中，待步骤 7.4 使用。</li>
</ol>
6. 准备实验性共培养
<ol>
	<li>用移液器将藻类储备烧瓶中的 Vco-culture 轻柔地转移至步骤 4.5 中的细菌共培养烧瓶中。将共培养烧瓶放回昼夜培养箱中，待步骤 7.5 使用。 
	注意：细菌对照组中的细菌浓度应与实验共培养组中的细菌浓度相等。同样，藻类对照组中的藻类浓度应与实验共培养组中的藻类浓度相等。通过保持初始细菌和藻类浓度一致，可在整个实验过程中比较种群密度。</li>
</ol>
7. 设置微量滴定板
<ol>
	<li>按照 图1 所示，将一个无菌的48孔微孔板进行分区。在含有无菌稀释液或非光合作用样品的外周孔上方进行标记。 
	注意：对于同一天采集的样品，可对微孔板上的孔位进行随机化处理。例如，实验中第1天的样品将放置于第1象限；需要随机化的孔位为B2–4和C2–4。微孔板的边缘孔应如 图1 所示，填充无菌溶液。</li>
</ol>
<img alt="数据分析图表中的彩色编码网格；多变量比较方法；科研或教育用途。" src="/files/ftp_upload/52455/52455fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 48孔微孔板中样品放置的示意图。 各孔加样方式如下：第1列和第6列，A至F行（<img alt="静力平衡，ΣFx=0，ΣFy=0 示意图；矢量表示结构分析中的受力，工程学研究。" src="/files/ftp_upload/52455/circle1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="圆圈1">）加入1 ml 1x PBS（或其他无菌溶液/培养基）；A行和F行，第2至8列（<img alt="静力平衡，ΣFx=0，MA=0，物理示意图，稳定性分析，力平衡研究。" src="/files/ftp_upload/52455/circle2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="圆圈2">）加入1 ml 细菌对照；B行和E行，第2至8列（<img alt="静力平衡示意图，ΣFx=0，展示物理学中力与矢量的原理。" src="/files/ftp_upload/52455/circle3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="圆圈3">）加入1 ml 藻类对照；C行和D行，第2至8列（<img alt="静力平衡示意图，ΣFx=0，展示平衡力与力矩方程。" src="/files/ftp_upload/52455/circle4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="圆圈4">）加入1 ml 共培养液。该微孔板分为4个象限（A2、A5、D2 和 D5），每个象限分别对应特定的采样日（第1至4天），应在不同微孔板间进行随机化并相应标记。在每一天内，建议使用随机数生成器对藻类对照（<img alt="静力平衡，ΣFx=0，ΣFy=0，示意图，力分析，静力学原理，教育用途。" src="/files/ftp_upload/52455/circle5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="圆圈5">）和共培养（<img alt="静力平衡示意图，ΣF=0，MA=0，展示支撑梁上的力平衡。" src="/files/ftp_upload/52455/circle6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="圆圈6">）孔位进行随机化。在盖子上标记覆盖1x PBS 和/或细菌对照孔的位置，以防止对藻类培养物造成遮光影响。
<ol start="2">
	<li>根据图1所示，在相应孔中缓慢而小心地加入1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）或其他无菌溶液。若PBS溅入其他孔中，会改变藻类和/或共培养体系的离子强度，因此操作需谨慎。</li>
	<li>将1 ml细菌对照培养物加入标记为细菌对照的孔中（图1）。每次移液前需轻轻摇动细菌培养瓶，防止细菌沉降。</li>
	<li>使用宽口移液枪头，将1 ml藻类对照培养物加入标记为藻类对照的孔中（图1）。摇动藻类培养瓶的频率应与细菌培养瓶一致。若藻类易沉降或上浮，应根据需要增加摇动频率，以维持肉眼可见的均匀培养状态。</li>
	<li>使用宽口移液枪头，将1 ml共培养液加入相应孔中（图1）。共培养瓶的摇动频率应与藻类培养瓶保持一致。</li>
	<li>用封口膜密封每块培养板，并置于设定好温度和昼夜光照周期的培养箱中（通常采用18 °C、16:8 hr 光照:黑暗周期）。将培养板放置于昼夜培养箱中，直至准备进行PAM测定（第8节）。确保所有培养板朝向一致，以保证光照条件均一。</li>
	<li>从PBS、藻类培养基、藻类储备液和藻类对照中各取20 μl样品，点样于合适的非选择性培养基（例如，添加1.5%琼脂的Marine Broth 2216），在18 - 25 °C下培养72 hr，检测是否存在污染。若在不应含细菌的溶液中出现菌落生长，则相关数据不应使用。</li>
	<li>利用藻类对照和共培养瓶中剩余的样品进行PAM荧光测定，获得实验第0天的PAM荧光读数（见步骤8.1）。其他第0天的测定也应使用剩余的藻类对照、细菌对照及共培养样品进行。</li>
</ol>
8. 对库存样品进行PAM荧光测定读数
<ol>
	<li>使用洁净比色皿中的无菌藻类培养基对 WATER-PAM 进行调零，然后进行读数8。</li>
	<li>从藻类对照组或共培养烧瓶中吸取 300 µl 样品，加入含有 2.7 ml 实验所用相同藻类培养基的洁净比色皿中。用宽口移液枪头轻轻混合样品与稀释液。</li>
	<li>将比色皿放入 WATER-PAM 前，用纸巾擦去比色皿外壁所有指纹。</li>
	<li>将比色皿放入 WATER-PAM 中，盖上盖子，使其暗适应 3 分钟。暗适应时间因藻类物种而异，需根据实验所用特定藻种确定。为避免过长的暗适应时间（>20 分钟），建议在藻类昼夜培养箱的暗周期中期进行 WATER-PAM 测量16,17。</li>
	<li>暗适应结束后，按下 F0 按钮。若荧光读数超过 3,900，则用藻类培养基将样品按 1:1 比例稀释。再次暗适应 3 分钟后重新读数。若 F0 或 Fm 读数仍高于 3,900，则继续按 1:1 比例用藻类培养基稀释样品，直至 F0 和 Fm 读数低于 3,900。 
	注意：记录最终荧光值时需考虑稀释倍数。例如，若藻类样品从孔板转移至稀释管时已按 1:9 比例稀释，则测得的荧光值为 500 时，应乘以稀释倍数的倒数（本例中为 10），该管的实际荧光值为 5,000。</li>
	<li>设定 F0 后，每隔 90 秒按下 SAT 按钮进行一次饱和脉冲（SAT-Pulse）测量，以获取 Fm 读数。读数间隔可根据藻株特性适当调整。测量完成后弃去样品。</li>
	<li>对剩余样品重复步骤 8.1 至 8.6。</li>
</ol>
9. 从微孔板获取PAM荧光测定读数
<ol>
	<li>标记6个无菌样品管 &gt;藻类对照组B2至B4孔各加3 ml，细菌共培养组C2至C4孔各加3 ml（参见培养板布局图 图1).</li>
	<li>将 2.7 ml 无菌藻类培养基分装至每支试管中。</li>
	<li>将试管放入昼夜培养箱中，在藻类培养温度下适应30分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出微孔板之前，需用铝箔（或类似材料）覆盖微孔板，以限制光线进入已暗适应的孔中；仅在将培养物从孔中转移至稀释管的过程中（步骤9.5 - 9.7）才可移除铝箔。</li>
	<li>用宽口移液器吸头缓慢地上下吹打，无菌混合第一块微孔板的孔（B2孔）。</li>
	<li>从培养箱中取出稀释管，并在无菌条件下转移 300 µl 来自B2孔（图1) 使用宽口移液器吸头将其加入对应的样品管中（此为样品在藻类培养基中的1:9稀释）。</li>
	<li>对剩余的孔（B3、4 和 C2 - 4）重复步骤 9.5 - 9.6。</li>
	<li>用铝箔覆盖样品管，并将其放回昼夜培养箱中，直至准备进行WATER-PAM检测。</li>
	<li>按照步骤 8.1 - 8.7 所述进行 WATER-PAM 测定。将微孔板用封口膜密封后，放回培养箱中。</li>
	<li>在实验持续期间，按照预定的时间间隔重复读数。采样的频率和持续时间应在实验开始前进行规划。</li>
</ol>
10. 示例实验
该实验为一种细菌（Phaeobacter gallaeciensis BS107）与一种微藻（Emiliania huxleyi 菌株 (CCMP3266)）的10天共培养实验。实验包括微藻对照组、细菌对照组以及细菌-微藻共培养实验组。
<ol>
	<li>计算所需细菌和藻类储备液的体积（步骤 1.1 - 1.4） 
	<img alt="科学研究中藻-菌共培养体积计算、对照组和实验组方程。" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation10.1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 10"></li>
	<li>通过将 4 ml 藻液接种至 36 ml 培养基中，制备体积 VA 为 40 ml 的藻类储备液，并培养至对数早期生长阶段，细胞密度约为 ~104 个细胞/ml（步骤 2.1 - 2.4）。</li>
	<li>将第 3 节中获得的浓度为 106 cfu/ml 的细菌液 400 μl 用藻类培养基稀释至总体积 VB 为 40 ml，制备细菌储备液（最终细菌浓度为 104 cfu/ml）。</li>
	<li>将一半（20 ml）细菌储备液转移至细菌对照组瓶中，并加入 20 ml 藻类培养基，制成细菌对照组；将一半（20 ml）藻类储备液转移至藻类对照组瓶中，并加入 20 ml 藻类培养基，制成藻类对照组（第 5 节）。将剩余的 20 ml 细菌储备液转移至共培养瓶中，并与剩余的 20 ml 藻类储备液混合，建立共培养体系（第 6 节）。</li>
	<li>用移液器将 1× PBS（pH 7.4）、各对照组及共培养体系分别加入两个预先标记的微量培养板中（图 1），每孔 1 ml。取剩余的对照组和共培养体系各 3 ml，用于第 0 天的测定（cfu 计数、WATER-PAM（第 8 节）、藻类细胞形态的显微观察，以及用于流式细胞术的藻类细胞固定）。</li>
	<li>在 10 天内每天对藻类对照组和共培养体系进行一次 WATER-PAM 测定，且每次测定时间应与第 0 天测定时一致（第 8 节）。</li>
</ol>
11. 其他关注参数
<ol>
	<li>测定细菌cfu浓度：将细菌对照组和共培养组用无菌1x PBS（或类似溶液）进行系列稀释，取稀释液点种于添加1.5%琼脂的Marine Broth 2216培养基（或类似培养基）平板上，培养后观察菌落形成单位（cfu）数量，以确定每孔的细菌cfu/ml18.</li>
	<li>为评估藻类细胞浓度：用终浓度为0.15%的戊二醛固定藻类对照组和共培养样品，在暗处孵育10分钟，随后在液氮中快速冷冻，并于-80°C保存。80 °C使用流式细胞仪（FACS Calibur 或类似仪器）对所有样品进行检测，以计数藻类细胞。</li>
	<li>观察藻类细胞形态：利用显微镜观察藻类培养物及细菌-藻类共培养物即， 光学显微镜、落射荧光显微镜或类似技术</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微型化格式下的藻类生长。
将藻类培养物微型化至微孔板中1 ml的培养体积，可增加实验内的重复次数。在整个实验过程中确保藻类处于健康状态至关重要；可采用微孔板形式进行生长曲线测定（图2），以评估不同藻类培养基，确保满足藻类的营养需求。此外，优化昼夜循环（光照与黑暗周期）和温度条件也可能十分关键。针对特定藻类进行适当优化后，可使藻类培养物保持健康状态，并在26天内维持峰值荧光水平，甚至在140天后仍可检测到潜在的光化学量子产量（图2）。
尽量减少蒸发效应。
在基于液体的检测中，应尽量减少蒸发效应，因为通常会观察到“边缘效应”，即微孔板边缘孔中的蒸发量大于靠近板中央孔中的蒸发量。尽管在板的边缘已观察到蒸发现象，但蒸发速率并不会限制实验持续时间，因为在此实验体系中已成功维持了健康的藻类培养物，其荧光峰值出现在第26天（图2）。为尽量减少任何潜在的“边缘效应”，可在微孔板四周的孔（A和H列，1...

浮游植物生理学的传统研究通常在中等规模的实验体系中进行，体积范围从锥形瓶中的20 ml到烧瓶中的5 L1–7。这种实验规模需要在监测过程中进行取样，因为每个时间点都需牺牲重复样本，从而导致实验设置难以管理。
通过微型化藻类生理学实验的实验体积，在相同昼夜培养箱空间内增加独立实验数量，将减少或消除从大体积培养中取样不足和伪重复带来的限制。已开发出一种微孔板格式的藻类生物测定方法，采用1 ml培养体积在不同条件下进行藻类实验操作。这种小体积实验方式可增加重复次数，由于重复样本和实验之间的变异性降低，提高了实验的可重复性，并可在长达140天内维持实验对照（例如，无菌藻类培养）的同时实现真正的重复（即，真实生物学重复）（图2）12。
这种微量滴定板格式可轻松适用于多种实验问题，例如：某种细菌与其藻类宿主之间是否存在共生、中性或致病性相互作用？某种化合物的添加对藻类具有刺激作用还是毒性作用？利用这种新格式，可以快速、高通量地回答上述及其他类似问题9–11。
48孔微孔培养板可使每个1 ml的孔成为一个独立的实验体系，并在单个时间点进行取样。可从此1 ml体积中检测多种参数，包括但不限于：利用水体脉冲振幅调制（WATER-Pulse-Amplitude-Modulated，WATER-PAM）荧光仪（见材料与设备表）13测定叶绿素荧光及光化学参数。WATER-PAM荧光测定法是一种快速、非侵入性的技术，可用于监测藻类实验过程13。该方法能够利用少量培养液体积（将150–300 μl培养物用培养基稀释至2–4 ml体积用于WATER-PAM检测）来测定光合效率和光系统II（PSII）的健康状况14,15。除WATER-PAM荧光测定外，该实验体系还可用于测定多种其他参数，包括但不限于：显微观察附着于藻细胞的细菌以及藻细胞形态的变化；细菌菌落形成单位（cfu）计数；以及用于藻细胞计数和亚群鉴定的流式细胞术。

<table><tbody><tr><td>10立方英尺昼夜培养箱（6012-1）</td><td>卡龙公司</td><td>112310-6012-1-11</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caronproducts.com&quot;&gt;www.caronproducts.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 25 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，通气/闭盖，7 ml 工作体积，200 个/箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>N156340</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>多孔组织培养板 &amp;ndash; 48孔</td><td>BD 生物科学发现实验耗材</td><td>353078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com/&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P1000 Gilson 移液器标准&amp;mdash;Gilson移液器</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F123602</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mandel.ca&quot;&gt;www.mandel.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P10mL Gilson 移液器标准&amp;mdash;Gilson移液器</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F161201</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mandel.ca&quot;&gt;www.mandel.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>宽口吸头，非无菌 [100&amp;ndash;1,250 &amp;micro;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-468</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ca.vwr.com&quot;&gt;www.ca.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>超细非无菌吸头 [100&amp;ndash;1,250 &amp;micro;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-470</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ca.vwr.com&quot;&gt;www.ca.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Finntip 10 ml [体积：1 - 10 ml]</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>9402151</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.cn&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>WATER-脉冲幅度调制（Water-ED）</td><td>Heinz Walz GmbH，德国埃菲尔特里希</td><td>EDEE0232</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.walz.com&quot;&gt;www.walz.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>15 mm 直径石英玻璃比色皿（WATER-K）</td><td>卡龙公司</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caronproducts.com&quot;&gt;www.caronproducts.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠（结晶状/符合美国化学会标准），Fisher Chemical</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BD Difco 海洋肉汤 2216</td><td>BD 生物科学发现实验耗材</td><td>BD 生物科学发现实验耗材</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BD Bacto 琼脂</td><td>BD 生物科学发现实验耗材</td><td>BD生物科学发现实验室器具</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>L1 培养基试剂盒，50 L</td><td>国家海洋藻类与微生物保藏中心</td><td>国家海洋藻类与微生物保藏中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ncma.bigelow.org&quot;&gt;www.ncma.bigelow.org&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用 water-脉冲振幅调制（water-pam）荧光测定法评估细菌/浮游植物共培养的小体积生物测定法

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

传统的微藻实验操作方法通常使用较大量的培养液（20 ml 至 5 L），以便在实验过程中对培养物进行取样1–7。然而，大量取样在多个方面可能存在问题：1）导致实验过程中培养体系的总体积以及表面积与体积比发生变化；2）常采用伪重复（即，从同一处理组的同一个培养瓶中多次取样8），而非真正的重复（即，从多个重复处理组中分别取样）；3）实验持续时间受限于培养液的总体积；4）在长期实验中难以维持无菌培养或正常细菌微群落，因为在取样过程中容易发生污染。
使用微孔板可使每个重复样的培养体积达到1 ml，并在12.65 × 8.5 × 2.2 cm的板内实现多达48个独立处理，从而减少实验体积，并在无需对任一处理进行亚抽样的情况下实现大量重复。此外，该技术可进行调整以适应多种实验形式，包括：细菌-藻类共培养、藻类生理学测试以及毒素筛选9–11。含有藻类、细菌和/或共培养物的各个孔可用于多种实验室操作，包括但不限于：水脉冲振幅调制（WATER-PAM）荧光测定、显微镜观察、细菌菌落形成单位（cfu）计数以及流式细胞术分析。微孔板格式与WATER-PAM荧光测定相结合，可在实验过程中对光化学产量及其他光化学参数进行多次快速测量，样品间变异小、重复性高，并避免了在实验期间对大体积培养瓶或锥形瓶进行多次亚抽样所带来的诸多问题。

WATER-PAM 荧光测定读数。
WATER-Pulse-Amplitude-Modulated（PAM）荧光测定法是一种快速高效的方法，用于测定藻类培养物的荧光（作为叶绿素含量的替代指标）和光合产量（PSII 健康状况）。PAM WinControl 软件会生成一个包含原始数据值的电子表格（以下为暗适应藻类样品的基本参数）：
    F0 = 暗适应细胞的荧光强度
    Fm = LED 饱和脉冲光后的最大荧光值
    Fv/Fm = (Fm - F0)/Fm = 暗适应样品的潜在量子产量19
PAM 荧光测定法具有多种用途，可提供大量关于藻类光合作用系统及其健康状况的信息。此外，在检测...

本实验的目的是展示采用微孔板形式进行微藻筛选的可重复性和适应性。该快速筛选方法结合了 WATER-脉冲振幅调制（WATER-PAM）荧光测定技术，以光合产量作为光系统 II（PSII）健康状况的指标，并利用小体积的细菌-微藻共培养体系。

利用 WATER-脉冲振幅调制（WATER-PAM）荧光测定法评估细菌/浮游植物共培养的小体积生物测定法

传统的微藻实验操作方法通常采用较大体积的培养液（20 ml 至 5 L），以便培养物能够……

以下实验的总体目标是介绍一种微型化的藻类生物测定法，旨在快速筛选藻类培养物，以鉴定可能影响藻类培养物健康或生理状态的微生物共生体或病原体。该方法首先制备藻类与细菌在培养基中的对照混合物，并配制不同浓度的实验性藻-细菌共培养体系。下一步是将上述混合物分装至48孔板中，以实现稳定、可重复且快速的筛选。接下来，使用脉冲振幅调制荧光法对培养板进行孵育并监测，该方法通过测量参数来推断系统的光合作用健康状况。该时间过程实验的结果揭示了细菌对藻类具有致病性、共生性或中性的影响。在时间过程实验中，也可应用其他小体积筛选方法。与采用大体积进行藻类生物测定的传统方法相比，该技术的主要优势在于微型化生物测定能够使用小体积样品，从而实现更高的重复性。该方法最初旨在研究藻类对细菌病原体或共生菌的响应，但也可用于探究化学活性分子或营养物质对藻类健康与生理状态的影响。初学者在初次使用该方法时，可能会在将等分试样和藻类样品加入微型微孔板时遇到困难，因为该方法需要严格的无菌操作技术和周密的实验设计才能成功。把握实验时间。需同时将细菌培养至稳定期，将藻类细胞培养至对数生长期早期。在开始实验前，充分了解所用细菌和藻类菌株的特性至关重要。了解对数生长期的起始时间、细菌和藻类菌株的初始浓度，以及暗适应所需的时间非常重要。使用Pam时，为制备细菌，需将玻璃试管壁上存在的任何生物膜冲洗至细菌培养液中，然后无菌吸取一毫升培养液，转移至微量离心管中。将微量离心管在14,000 ×g条件下离心1分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀，然后将沉淀重悬于1毫升无菌algo培养基（如L1培养基）中，涡旋振荡使形成均匀的悬浮液。随后再次通过离心、弃去上清液，并将沉淀重悬于无菌培养基中，洗涤细菌细胞一次。使用lgal培养基进行洗涤可彻底去除细菌培养基中的碎屑和小分子物质，这对后续实验步骤至关重要。经过这两次洗涤后，使用倍比稀释法在培养基中稀释细菌细胞，使其浓度比与藻细胞进行一比一培养时所需的浓度高100倍。取一定体积的该100倍浓缩菌液加入无菌培养基中，使细菌细胞的终浓度为一倍浓度（1×），即与藻细胞浓度相等。此培养物称为一倍浓度（1×）细菌储备液。下一步，请准备三个已标记的灭菌锥形瓶。然后将计算好的一倍细菌储备液转移至细菌对照瓶中，并加入等体积的无菌培养基。接着，将计算好的一倍细菌储备液转移至共培养瓶中。现在使用宽口移液管混匀对数生长期的藻类培养物。然后用10毫升移液管将对照体积的培养物转移至藻类对照培养瓶中，随后加入等体积的藻类培养基。最后，将计算好的藻类培养物体积转移至共培养瓶中。首先，准备一个无菌的48孔微孔板。将含有稀释液或非光合作用样品的外周孔上方做好标记。在相应孔中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以尽量减少边缘效应和蒸发。然后向细菌对照孔中加入1毫升适当稀释的细菌对照培养液。取样前请记得混匀培养瓶。接下来，

a-small-volume-bioassay-to-assess-bacterialphytoplankton-co-culture

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在线生长监测与可定制光照条件的实验室光生物反应器操作

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利用 WATER-脉冲振幅调制（WATER-PAM）荧光测定法评估细菌/浮游植物共培养的小体积生物测定法

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