通过原子力谱学研究单分子粘附

本实验的总体目标是将单个聚合物连接到原子力显微镜（AFM）悬臂针尖上，从而对同一分子进行多次、重复四次的光谱表面解吸实验。该目标的实现首先通过等离子体活化针尖表面，以形成羟基基团作为第二步；随后利用上向浸泡法使悬臂针尖发生氨丙基硅烷化处理，从而在针尖表面形成氨基基团。

第三步是将聚乙二醇分子与氨基连接。它们可防止探针尖端与基底之间的非特异性相互作用，并作为聚合物的连接分子。最后，将聚合物共价偶联到聚乙二醇分子上，形成探针。

测量结果表明，该方法确实可以实现使用同一个聚合物力探针完成一整套实验，或者同样地，获取数百条力-距离曲线。单分子实验相较于系综方法的主要优势在于，能够研究那些罕见的构象和低频状态，而这些信息在系综平均中通常会被掩盖。由于其尺寸微小，这些实验结果可直接与分子动力学模拟进行比较。

第一步是将探针分子共价连接到悬臂针尖上。使用新鲜的氮化硅悬臂芯片，选择弹簧常数为10至100皮牛顿每纳米的芯片。

使用镊子将芯片放置在干净的玻璃载片或培养皿上。接着，将载有芯片的载片放入100瓦的等离子体腔室中，在抽真空后通入氧气，于0.25毫巴和20瓦条件下处理15分钟。在后续步骤中，应使用通风橱，以避免在等离子体处理过程中吸入有机蒸气。

在玻璃培养皿中准备进行悬臂梁的氨基硅烷化处理，加入2.5毫升向上测试溶液。此外，准备一个盛有丙酮的容器。等离子体处理一完成，立即取出悬臂梁。

将每个悬臂依次浸入丙酮中1秒，然后放入Optus溶液中。室温下孵育悬臂15分钟后再进行后续操作。在悬臂孵育的同时，开始准备进行聚乙二醇化修饰，以尽量减少水分和空气对组分的影响。

从预先准备好的离心管开始，其中一管含有 m peg 和 NHS，另一管含有染料。NHS Peg。测定每管中内容物的重量。

接下来，取含有 EG NHS 的离心管，准备加入氯仿。加入氯仿，使终浓度为 25 毫摩尔每升，并确保溶液量足以在后续步骤中覆盖悬臂梁。将离心管置于涡旋振荡器上，以确保粉末充分溶解。

将装有 EG NHS 的离心管置于一旁，用于后续与饮食相关的操作。NHS peg。加入氯仿，使其达到 0.25 毫摩尔的最终浓度。

使用涡旋混合器确保粉末完全溶解。接着混合溶液，以调节饮食中NHS-peg与甲基-peg-NHS分子之间的比例。该比例通常为1比500。

取一个带盖的小型玻璃培养皿以减少蒸发，并将混合物填充至悬臂处。完成孵育。在 APT 测试溶液中，准备两个装有约 10 毫升丙酮的容器和一个装有氯仿的容器，用于冲洗。

将每根探针在丙酮中浸渍两次，在氯仿中浸渍一次，然后放入聚乙二醇溶液中。盖上培养皿，使悬臂梁保持在溶液中。在此期间，用一小时时间准备探针分子（本实验中为多氨基酸聚脱酪氨酸）的共价偶联。

首先取一摩尔氢氧化钠溶液，将探针分子溶解至浓度为一毫克每毫升。对于多聚D-酪氨酸，用pH为8至8.5的硼酸钠缓冲液替代氢氧化钠，并在功能化处理前立即使用该缓冲液。

当悬臂梁在聚乙二醇溶液中完成孵育后，准备三个用于冲洗的容器和一个聚酪氨酸包被液的容器。用于冲洗的八种缓冲液分别为：5 毫升氯仿、5 毫升乙醇、5 毫升包被缓冲液。使用约 300 微升的聚酪氨酸包被缓冲液。

取出悬臂梁，依次将其先浸入氯仿，再浸入乙醇，最后浸入八孔缓冲液中。在将悬臂梁放入聚酪氨酸八孔缓冲液之前，让悬臂梁芯片孵育一小时。准备约五毫升的bate缓冲液置于一个容器中，另取五毫升超纯水置于另一容器中，用于冲洗悬臂梁，同时准备20毫升超纯水用于储存悬臂梁。

取悬臂梁，依次将其浸入Boite缓冲液和超纯水中进行清洗，随后将其浸入超纯水中保存。悬臂梁现在可用于数据采集。

当原子力显微镜（AFM）探针完成功能化修饰且样品表面已制备并安装完毕后，即可开始进行荧光显微镜（FM）数据采集操作。首先，将功能化修饰后的悬臂梁装入适用于液体环境中测量的原子力显微镜（AFM）悬臂梁支架中。随后，将该悬臂梁支架连接至原子力显微镜（AFM）探头。

继续向流体池中注入水，以浸没悬臂和样品表面。然后将原子力显微镜的探头部分下降至液体池上。让系统平衡至少半小时。

平衡后，将悬臂远离表面，然后记录热噪声谱；需要记录10个或更多谱图，以获得足够的信噪比，从而排除表面阻尼效应。接下来，小心接近表面，测量逆光杠杆灵敏度。

该过程包括将悬臂针尖推压至硬质表面，以记录力与压电陶瓷移动距离的关系。测量接触阶段的斜率，并取其倒数以确定光杠杆灵敏度的倒数。接下来，结合光杠杆灵敏度的倒数和热噪声谱，通过将热噪声谱拟合为谐振子模型来确定悬臂的弹性常数。

现在设置合适的数据采集参数。在数据采集结束时，针对每种实验条件记录大量力-距离曲线。再次测定灵敏度和弹簧常数，以检查系统的稳定性和一致性。

红色曲线显示了聚酪氨酸从甲基自组装单层在不纯水中拉伸时的强制距离曲线示例。力值单步降至零表明单个分子发生脱离。黑色曲线为对应的S形拟合结果。

提取的平台长度和平台力用箭头标示。悬臂的伸展-回缩速度为0.5微米每秒，表面停留时间为1秒。不同的液体环境导致所提取的平台力发生变化。

这些直方图反映了在纯水和水-乙醇混合溶液中测得的平台力提取值。每种溶液均在同一单个聚合物上记录至少300条力-距离曲线。此处展示了在纯水和水-乙醇混合溶液中提取的平台长度的相应直方图。

加入乙醇会削弱聚酪氨酸与表面之间的疏水相互作用，从而导致平台力降低以及平台长度减小。这一点在此处的峰值平台长度与峰值平台力的关系图中得到总结。一旦掌握，功能化方案在开发后大约四小时内即可完成。

该技术为物理学和化学领域的研究人员探索聚合物在界面处的粘附与摩擦行为铺平了道路。