调查单分子粘附的原子力谱
February 27th, 2015
提出了一种将大量单分子共价耦合到 AFM 针尖上的方案。提供了确定这些分子在固体载体和生物界面上的粘附力和自由能的程序和示例。
该程序的总体目标是将单个聚合物耦合到 A FM 悬臂尖端，以便多次使用同一分子中的一种进行四次光谱表面解吸实验。这是通过首先等离子体激活尖端表面以形成羟基作为第二步来实现的。悬臂尖端通过向上测试溶液进行氨基硅化，该溶液在尖端表面形成氨基。
第三步是将聚乙二醇分子偶联到氨基上。它们可以防止尖端和基材之间的非特异性相互作用，并用作聚合物的连接分子。最后，聚合物与聚乙二醇分子偶联以形成探针。
测量表明，该程序确实可以将一个相同的聚合物力探头用于完整的实验集，或者同样，数百个力距离曲线。与集成方法相比，单分子实验的主要优点是可以研究罕见的确认和不常见的状态，否则这些状态将隐藏在集成平均中。由于体积小，这些实验可以直接与分子动力学模拟进行比较。
第一步是将探针分子共价连接到悬臂尖端。从新鲜的氮化硅开始。悬臂芯片采用弹簧常数为每纳米 10 至 100 皮牛顿的芯片。
用镊子将它们放在干净的载玻片或培养皿上。接下来，将载玻片和芯片放入 100 瓦等离子室中，然后排空腔室并用 0.25 毫巴和 20 瓦的氧气冲洗 15 分钟。在接下来的步骤中，使用通风橱以避免在等离子体处理过程中吸入有机蒸气。
准备在玻璃培养皿中对悬臂进行氨基硅化，放入 2.5 ml UP 测试溶液。此外，修理含有丙酮的容器。等离子体处理完成后立即取回悬臂。
继续将每个悬臂浸入丙酮中一秒钟，然后将其放入 Optus 溶液中。在继续之前，将悬臂在室温下孵育 15 分钟。当悬臂孵育时，开始准备聚乙二醇化，以尽量减少水和空气对组件的影响。
从先前制备的 eph 管开始，一个含有 m peg、NHS 和另一个染料。NHS 挂钩。确定每个试管内容物的重量。
接下来，使用含有 EG NHS 的试管并准备添加氯仿。倒入氯仿以达到 25 毫摩尔的最终浓度和足够的溶液以在后续步骤中覆盖悬臂。将试管放在涡旋混合器上，确保粉末溶解。
将装有 EG NHS 的试管放在一边，以便与饮食一起工作。NHS 挂钩。加入氯仿使其达到 0.25 毫摩尔的最终浓度。
使用涡旋混合器确保粉末溶解。接下来，混合溶液以调整饮食 NHS peg 和甲基 peg NHS 分子之间的比例。此比率通常为 1 比 500。
获得一个带盖子的小玻璃培养皿以限制蒸发，并用混合物填充它作为悬臂。完成孵育。在 APT 测试溶液中，准备两个装有约 10 毫升丙酮的容器和一个装有氯仿的容器，以便冲洗它们。
将它们分别浸入丙酮中两次，浸入氯仿中一次，然后放入聚乙二醇溶液中。盖上培养皿，将悬臂保持在溶液中。1 小时，准备探针分子的共价偶联，在本例中为聚氨基酸 poly de tyrosine。
从溶解到其中的 1 摩尔氢氧化钠的体积开始，使探针分子浓度达到 1 毫克/毫升。对于聚 D 酪氨酸，将氢氧化钠交换为 8 至 8.5 pH 的孔径钠。功能化前的 8 个缓冲液。
当悬臂在聚乙二醇溶液中完成孵育时，准备三个用于冲洗它们的容器和一个装有聚酪氨酸孔的容器。用于冲洗的第八缓冲溶液是 5 毫升氯仿、5 毫升乙醇、5 毫升孔径缓冲液。使用约 300 微升的聚酪氨酸孔缓冲溶液。
取回悬臂，先将每个悬臂浸入氯仿中，然后浸入乙醇中，然后浸入八孔缓冲液中。在将它们放入聚酪氨酸孔径 8 缓冲溶液中之前。准备好 1 小时后让悬臂芯片孵育 1 小时，一个容器中加入约 5 毫升的 bate 缓冲液，另一个容器中加入 5 毫升用于冲洗悬臂的超纯水，也有 20 毫升的超纯水来储存它们。
获取悬臂并将每个悬臂浸入 Boite 缓冲液中，然后用超纯水冲洗。然后将其浸入超纯水中储存。悬臂现在可用于数据采集。
一旦 A FM 尖端功能化并准备好并安装表面，即可开始 FM 数据采集的步骤。首先，将功能化的悬臂放入适用于液体测量的 A FM 悬臂支架中。接下来，将悬臂支架连接到 A FM 头。
继续将水倒入流体池中，使悬臂和表面浸入水中。然后降低液体池上的 A FM 头。让系统平衡至少半小时。
e 平衡后。将悬臂放置在远离表面的位置，然后记录热噪声光谱需要 10 个或更多光谱，以获得足够的信噪比来排除表面阻尼效应。接下来，小心地接近表面以测量反向光学杆灵敏度。
这包括将悬臂尖端推向坚硬的表面，以记录力与压电行程的距离。测量接触过程中的斜率并将其反转以确定反光学杆灵敏度。下一个工作，逆光杆灵敏度和热噪声谱通过将谐波振荡器拟合到热噪声谱来确定悬臂的弹簧常数。
现在为数据收集设置适当的参数。在数据收集结束时记录每个实验条件的大量强制距离曲线。再次确定灵敏度和弹簧常数，以检查系统的一致性和稳定性。
这个红色强制距离轨迹的例子来自聚酪氨酸从甲基自组装的单层不纯水中缩回。力单步下降到零表示单个分子的分离。S 形拟合显示为黑色。
提取的平台长度和高原力用箭头表示。悬臂的伸展缩回速度为每秒 0.5 微米，在表面的停留时间为 1 秒。用于测量的不同液体环境会导致提取的平台力发生变化。
这些直方图反映了提取的平台力，用于纯水和水中测量。乙醇混合物，每种溶液至少记录了 300 条力距离轨迹，其中 1 条力距离轨迹位于同一单一聚合物中。这里显示了纯水和水乙醇混合物中提取的平台长度的类似直方图。
乙醇的添加削弱了聚酪氨酸与表面之间的疏水相互作用，导致平台力降低和平台长度减少。这总结在这张峰值平台长度与峰值平台力的图版中。一旦掌握，功能化方案可以在开发后约 4 小时内完成。
这项技术为物理和化学领域的研究人员探索聚合物在界面处的粘附性铺平了道路。
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概述
该协议详细说明了将单聚合物偶联到原子力显微镜（AFM）杠杆尖端，用于光谱表面解吸实验。它概述了准备尖端并连接聚乙二醇分子的必要步骤，这些分子作为聚合物的连接器。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 表面化学
- 纳米技术
背景
- 原子力显微镜（AFM）用于表面分析。
- 分子的共价偶联增强了测量的特异性。
- 聚乙二醇（PEG）常用于减少非特异性相互作用。
- 理解粘附力对材料科学和生物学中的各种应用至关重要。
研究目的
- 开发一种将单分子附着到AFM尖端的可靠方法。
- 为同一分子进行重复的光谱实验提供便利。
- 提高固体支撑上粘附力测量的准确性。
使用的方法
- 等离子体活化AFM尖端表面以引入羟基。
- 尖端的氨基硅烷化以创建氨基。
- 聚乙二醇分子与氨基的偶联。
- 聚合物与PEG分子的结合以形成功能性探针。
主要结果
- 成功地将聚合物附着到AFM尖端。
- 使用PEG连接器实现了非特异性相互作用的减少。
- 有效地进行了粘附力和自由能测量。
- 该方法允许使用相同的分子设置进行多次实验。
结论
- 该协议为AFM尖端分子偶联提供了一种通用的方法。
- 它增强了表面相互作用研究的可靠性。
- 这种方法可以应用于各种类型的分子和表面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single molecule atomic force spectroscopy enables direct quantification of molecular adhesion forces at bio-interfaces, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-resolution, quantitative data on molecular interactions, informing target validation and predictive confidence for biopharma R&D portfolios. The ability to isolate and repeatedly measure individual molecular events advances the reliability of early-stage decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of molecular adhesion, clarifying interaction mechanisms at the single-molecule level.
- Supports functional target validation by distinguishing specific from nonspecific binding events.
- Provides quantitative force and energy data to inform predictive models and triage targets.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of passivated, functionalized probes for reproducible single-molecule assays.
- Enables generation of hundreds of force-distance curves per probe, supporting robust assay standardization.
- Delivers quantitative outputs (adhesion force, length, free energy) for reliable compound or surface evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular interaction data with disease-relevant bio-interfaces for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic insight into molecular adhesion under physiologically relevant conditions.
- Enables comparison of molecular behavior across different solvent environments and surfaces.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through assay development and preclinical model selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying specific molecular interactions and adhesion mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates force-distance curves and statistical distributions for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Links molecular adhesion data to bio-interface relevance, supporting biomarker alignment when applicable.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to diverse molecules and surfaces for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable single-molecule measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution molecular data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on quantitative adhesion metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and single-molecule force spectroscopy.
- Demands access to specialized instrumentation and analytical infrastructure for data acquisition and analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of probe functionalization and measurement protocols.
- Adaptation may be needed for different molecular systems or surface chemistries.
- Practical limitations include throughput and the need for careful control of nonspecific interactions.
