Name: 调查单分子粘附的原子力谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习利用原子力显微镜进行单分子粘附力谱分析，通过等离子体活化、氨基硅烷化和聚乙二醇连接技术制备功能化探针。该方法可实现同一聚合物的多次重复测量，提高粘附力与自由能测量的准确性，适用于生物物理学和表面化学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者感谢德国研究基金会（DFG，项目编号 Hu 997/2-2）提供的经费支持。FS 感谢汉斯·赛德尔基金会（HSS）的支持。SKr 在博士生项目“复杂界面材料科学”框架下得到了巴伐利亚精英网络的资助。SKi 感谢 SFB 863 提供的经费支持。

注意：有关包含制备、数据采集和数据分析步骤的流程概述，请参见图2。
1. 试剂配制
注意：所有化学品均需谨慎操作，因此应穿戴实验服、手套和护目设备。所有操作必须在实验室通风橱中进行。特别是使用氯仿时，应佩戴专用手套。
<ol>
	<li>使用含水量低的化学试剂，例如干燥的氯仿，并尽快使用，干燥储存时间不超过一周。将这两种试剂在 -20 °C 条件下保存于氮气或氩气环境中，因为 APTES ((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)（见表 1）和 PEG（聚乙二醇）具有吸湿性，且 PEG 在空气中易发生氧化。</li>
	<li>为避免母液频繁暴露于空气中的氧气和湿气，建议分装成小份 aliquot，理想情况下在充满氮气的手套箱系统中进行操作。</li>
</ol>
2. 仪器设置
注意：为避免可能的交叉污染，每一步骤均应使用新鲜且洁净的容器。
<ol>
	<li>将玻璃器皿和镊子置于洗涤剂溶液中，在60 °C超声浴中超声清洗30分钟。</li>
	<li>用超纯水将步骤2.1中的器械彻底冲洗并超声清洗两次。</li>
	<li>将步骤2.1中的器械置于RCA溶液（超纯水、过氧化氢和氨水（5:1:1））中，在烘箱中加热至75 °C，保持45分钟，随后用超纯水冲洗。</li>
	<li>最后，在干燥氮气流下或烘箱中（100 °C，3小时）干燥玻璃器皿和镊子。</li>
</ol>
3. 尖端功能化
注意：使用镊子、容器， 等等。 由不锈钢、PTFE、玻璃或任何在有机溶液中化学性质稳定的材料制成（如适用）。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。所需孵育溶液的量取决于悬臂芯片的数量。确保悬臂始终浸没在相应的溶液中。
注意：使用通风橱以避免吸入有机蒸气。
<ol>
	<li>悬臂表面羟基（OH-基团）的形成（“活化”）（约0.5小时）：
	<ol>
		<li>使用镊子将新的悬臂芯片（材料：SiN，弹簧常数：10–100 pN/nm）放置于洁净的玻璃载片上，并放入等离子体腔室（100 W）中。</li>
		<li>抽真空至腔室压力约为0.1 mbar。</li>
		<li>向腔室内充入氧气，随后再次抽真空。</li>
		<li>启动等离子体处理（功率：20%，持续时间：15分钟，处理压力：0.25 mbar）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>悬臂的氨基硅烷化（约1小时）：
	<ol>
		<li>在玻璃培养皿中配制2.5 ml APTES溶液（见表1）——建议在等离子体处理过程中进行此步骤。</li>
		<li>等离子体处理结束后，立即将每片悬臂在丙酮中浸渍1秒，随后立即转移至APTES溶液中。</li>
		<li>在室温下孵育15分钟。</li>
		<li>用10 ml丙酮小心冲洗悬臂芯片两次，再用10 ml氯仿冲洗一次。</li>
		<li>可选的最后步骤：将上一步处理后的悬臂芯片置于洁净的玻璃载片上，在70 °C下烘烤30分钟。需注意，表面活化亦有其他替代策略，例如，紫外光处理12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚乙二醇化（PEGylation，约2小时）： 
	注意：请在进行氨基硅烷化的同时执行步骤3.3.1–3.3.4。NHS基团和马来酰亚胺基团在水性环境中易发生水解，而PEG本身在空气中易被氧化。因此，操作时间（尤其是各步骤之间的间隔）是关键参数。更多详细信息请参见文献13。
	<ol>
		<li>配制氯仿溶液（见表1）。</li>
		<li>为避免冷凝，打开分装管并称取适量PEG粉末前，应先将粉末升温至室温。</li>
		<li>为实现与氨基连接的聚合物或脂质的偶联，分别将NHS-PEG-NHS（6 kDa）和甲基-PEG-NHS（5 kDa）溶于氯仿溶液中，涡旋振荡至完全溶解。具体浓度参见表1。
		<ol>
			<li>替代方案：为实现与巯基连接的聚合物偶联，可分别将Mal-NHS-PEG和甲基-PEG-NHS溶于氯仿溶液中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据需要混合溶液，以调节NHS或马来酰亚胺封端的PEG分子与甲基封端的PEG分子之间的特定摩尔比（通常为1:500）。需注意，最佳比例需通过一系列制备-实验循环进行迭代确定。</li>
		<li>将悬臂芯片在PEG溶液中孵育1小时，孵育环境需为氯仿饱和气氛，以防止氯仿挥发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针分子偶联（>1小时）： 
	注意：在以下3.4.1–3.4.3中，描述了三种不同探针分子共价偶联至原子力显微镜（AFM）针尖的示例。每种分子均需调整相应实验方案。另需注意，示例1和示例3采用NHS化学法，而示例2中则通过马来酰亚胺化学法将巯基功能化的聚合物PI-g-PS偶联至PEG。详细信息请参见文献14。
	<ol>
		<li>针对多氨基酸聚合物聚-D-酪氨酸（40–100 kDa）
		<ol>
			<li>将聚酪氨酸偶联的探针分子溶解于1 M NaOH中，调节浓度至1 mg/ml。</li>
			<li>在功能化前，立即使用旋转脱盐柱（7 kDa MWCO）将NaOH置换为硼酸钠缓冲液（pH 8.1）。</li>
			<li>依次用5 ml氯仿、5 ml乙醇和5 ml硼酸缓冲液冲洗悬臂。</li>
			<li>将悬臂芯片在聚酪氨酸硼酸缓冲液中孵育1小时，随后用硼酸缓冲液和超纯水冲洗。孵育后保存于超纯水中，直至进行测量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>针对具有接枝侧链（聚苯乙烯，88 kDa）的线性主链聚合物（聚异戊二烯，119 kDa）14
		<ol>
			<li>将PI-g-PS溶解于无水氯仿中，调节偶联溶液浓度至4 mg/ml。</li>
			<li>用5 ml氯仿冲洗悬臂，随后在偶联溶液中孵育至少1小时。</li>
			<li>再次用5 ml氯仿冲洗，并将悬臂保存于氯仿中，且置于氯仿饱和环境中（以防止氯仿挥发），直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>针对脂质POPE
		<ol>
			<li>将POPE溶解于无水氯仿中，调节浓度至20 mM。</li>
			<li>在将悬臂于脂质溶液中孵育1小时之前，先用5 ml乙醇和5 ml超纯水冲洗悬臂。</li>
			<li>孵育后，依次用5 ml氯仿、5 ml乙醇和5 ml温热的超纯水冲洗悬臂（顺序不可更改），以去除未结合的探针分子并清除氯仿残留。功能化后的探针应立即使用；或可选择保存于氯仿中，待需要时取出。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="AFM探针功能化示意图：等离子处理、硅烷化、PEG化、探针偶联。" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. (A) 以NHS化学法为例的探针功能化过程示意图。(B) 通过氨基将探针分子连接至探针所采用的化学键合方式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 表面准备
<ol>
	<li>自组装单分子层（SAM） 
	注意：在第一个示例中，选择自组装单分子层作为表面。详细信息请参见文献15。
	<ol>
		<li>使用洗涤剂溶液清洗载玻片，随后在超声波水浴中用超纯水清洗两次，每次30分钟。然后，作为额外的清洗步骤，将载玻片置于RCA溶液中（见步骤2.3），在75 °C下处理15分钟。</li>
		<li>在真空镀膜仪中，将载玻片镀上10 nm铬镍层和100 nm金层。随后存放在冰箱中，并在进行下一步操作前立即用RCA溶液再次清洗。</li>
		<li>将上一步的载玻片在2 mM 1-十二硫醇/乙醇溶液中孵育12小时。巯基与金表面结合，形成疏水性自组装单分子层。用乙醇和超纯水冲洗载玻片，然后用氮气流吹干。使用配备CCD相机的接触角测量仪，通过静态接触角测量确认所制备表面的疏水性10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氢终端金刚石 
	注意：在第二个示例中，选择氢终端金刚石作为表面。表面制备方法如先前所述16。</li>
	<li>支撑脂双层 
	注意：在最后一个示例中，使用支撑脂双层（SLB）作为表面。为获得此类表面，通过挤出法制备含有磷脂POPC的大单层囊泡（LUVs）溶液（0.1 mg/ml）。然后将50 µl LUV溶液滴加到新鲜裂解的云母片上（A = 1 cm²），孵育30分钟。最后用20 ml超纯水冲洗溶液。有关SLB制备的详细描述，请参见文献17,18。</li>
</ol>
5. 数据采集
注意：实验中应使用能够在液体环境中进行测量的原子力显微镜（AFM）。数据采集与数据分析流程适用于任何型号的原子力显微镜。此外，在某些实验中，若能控制液体池内的温度将更具优势。悬臂梁的偏转通过激光束偏转法19进行检测。弹簧常数采用热噪声法20测定。
<ol>
	<li>将功能化悬臂梁插入适用于液体环境中测量的原子力显微镜悬臂梁支架中。</li>
	<li>将待取样的表面（制备方法见上文）放入原子力显微镜（AFM）中，并用液体覆盖。此时，悬臂和表面均应浸入液体中，且悬臂针尖朝向表面。请注意，在多数情况下，一滴液体已足够。无论如何，应避免液体蒸发。 例如， 通过使用封闭式液体池。</li>
	<li>如适用，调节控制器上的目标温度。</li>
	<li>让系统平衡至少半小时。</li>
	<li>将悬臂远离表面，记录其热噪声谱，以排除任何表面阻尼效应。注意，通常需要累积10个或更多谱图才能获得足够的信噪比。</li>
	<li>接近表面。注意，为了保持针尖几何形状和针尖功能化的完整性，必须小心进行接近过程。例如，可通过间歇接触模式实现这一操作。</li>
	<li>测定以 nm/volt 为单位的倒光学杠杆灵敏度（InvOLS）。通过将悬臂针尖推压至硬质表面来完成该测量。
	<ol>
		<li>通过测量压电陶瓷移动距离与光电二极管电压变化之间的斜率来确定InvOLS。对悬臂梁尖端与表面接触部分的力-距离曲线进行直线拟合。在涉及软表面（如脂双层）的实验中，应在未被脂双层覆盖的区域（“缺陷位点”）执行此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将简谐振子模型拟合到热噪声谱来确定弹簧常数（pN/nm）。使用自动化软件功能进行弹簧常数测定；若无，则参考相关文献 20.</li>
	<li>开始实验。
	<ol>
		<li>在每种实验条件下记录大量力-距离曲线。通常采用以下实验参数值：采样率为 5 kHz，针尖速度为 1 µm/sec，回缩距离 1 µm. 
		注意：有时，根据所研究实验的动力学特性，可能需要让针尖与表面接触并保持一定时间（“停留时间”）。 
		注意：本实验的具体参数可能与上述数值有显著差异。</li>
		<li>在长期测量过程中，通过调整光电二极管的位置，定期将激光在光电二极管上的位置归零。</li>
		<li>可选：每次力曲线测量后，将原子力显微镜探针重新定位至另一个 x-y 位置。</li>
		<li>实验结束时，再次测定灵敏度和弹簧常数，以检验系统的稳定性和一致性。 
		注意：比较实验前后弹簧常数和灵敏度也是一种确保系统特性及探针特性在实验过程中保持不变的方法。如果弹簧常数的差异不大（&lt;=15%）时，可以取平均值，因为弹簧常数测定的固有不确定性也约为15%。当差异较大时，建议首先找出并消除表观弹簧常数变化的原因，然后再继续后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据准备
注意：本节描述了通常独立于特定实验类型的通用数据预处理步骤，包括将单位转换为牛顿（newton）和纳米（nanometer），以及对数据进行校正。各类实验特有的数据分析将在下文相应的代表性示例部分中简要介绍。
<ol>
	<li>通常通过自行编写的算法自动执行所有数据准备和分析步骤，例如，基于软件 IGOR Pro 6。</li>
	<li>将原始偏转信号（Defl）[V] 乘以 InvOLS [nm/V] 和弹簧常数 [nN/nm]，从而转换为力。</li>
	<li>对力进行偏移，使探针远离表面时悬臂所受的力（未加载的悬臂）为 0 nN。</li>
	<li>计算实际针尖位置（相对于表面测量时也称为分离距离）z*，该值考虑了悬臂的弯曲： 
	<img alt="静力平衡方程；公式： z*=z−F/k；教学用途。" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>对 z* 进行偏移，使得 z* = 0 对应于表面的 z 位置。 
	注：此处 F 为作用在针尖上并导致悬臂弯曲的力（由步骤 6.2 确定），z 为测得的 z 传感器位置（由仪器直接给出），k 代表弹簧常数（由步骤 5.8 确定）。</li>
</ol>
<img alt="悬臂梁表面预处理流程图，步骤包括：活化、硅烷化、PEG化、数据分析。" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 流程示意图，展示样品制备、数据采集和数据分析过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<ol><li>Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Single+Membrane+Proteins+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).</li>
<li>Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+imaging+of+walking+myosin+V+by+high-speed+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.</a> Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).</li>
<li>Magonov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+in+Analysis+of+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers.</a> Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).</li>
<li>Li, H., Linke, W. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+of+the+giant+muscle+protein+titin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering of the giant muscle protein titin.</a> Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).</li>
<li>Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA mechanics.</a> Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).</li>
<li>Zhang, W., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+mechanochemistry+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Single molecule mechanochemistry of macromolecules.</a> Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Physical Review Letters. 94 (4), 048301(2005).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lipid+Extraction+-+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid+Ordered+and+Liquid+Disordered+Phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases.</a> Biophysical journal. 107 (5), (2014).</li>
<li>Pirzer, T., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+mechanism+of+polypeptides+and+their+location+at+hydrophobic+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces.</a> Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).</li>
<li>Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+measurements+with+the+atomic+force+microscope%3A+Technique%2C+interpretation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.</a> Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+NANO%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold.</a> ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+G+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. New York. (1996).</li>
<li>Kienle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+architecture+on+single+polymer+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular architecture on single polymer adhesion.</a> Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).</li>
<li>Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+alkanethiols+on+gold%3A+comparisons+of+monolayers+containing+mixtures+of+short-+and+long-chain+constituents+with+methyl+and+hydroxymethyl+terminal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups.</a> Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).</li>
<li>Dankerl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond+Transistor+Array+for+Extracellular+Recording+From+Electrogenic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells.</a> Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).</li>
<li>Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayer+formation+by+vesicle+fusion%3A+the+interaction+of+phospholipid+vesicles+with+surfaces+and+the+effect+of+gramicidin+on+bilayer+properties+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy.</a> Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nanomechanical+Properties+of+Lipid+Membranes+are+Significantly+Influenced+by+the+Presence+of+Ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).</li>
<li>Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+the+optical+beam+deflection+technique+for+use+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy.</a> Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868(1993).</li>
<li>Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+desorption+kinetics+from+single+molecule+force+spectroscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).</li>
<li>Li, I. T. S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+free+energy+governs+single+polystyrene+chain+collapse+in+water+and+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory%2C+analysis%2C+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lipid+Extraction%3A+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases.</a> Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).</li>
<li>Horinek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+adsorption+on+a+hydrophobic+surface+results+from+an+interplay+of+solvation%2C+surface%2C+and+intrapeptide+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).</li>
<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

在过去的几十年中，单分子实验为分子机制提供了前所未有的见解，并已成为生命科学及其他领域中一种极为宝贵的研究方法。为了从单分子力谱（SMFS）实验中获得良好且具有意义的统计结果，理想情况下应在整个实验过程中使用同一个分子。与分子群体实验不同，SMFS实验能够检测到罕见事件和隐藏的分子状态。单分子实验的另一个优势在于，它们可以通过分子动力学模拟进行建模24,25。
上述悬臂梁功能化方案是此前已发表方法的改进版本26–28。在活化和硅烷化之后，原子力显微镜（AFM）悬臂梁通过两种不同类型的聚乙二醇（PEG）分子（连接分子）的混合物进行功能化。
第一种连接子-PEG以惰性甲基基团终止（“甲基-PEG”），第二种则以氨基反应性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团（或巯基反应性的马来酰亚胺基团）终止，后续探针分子将与之偶联（“NHS-PEG”、“Mal-PEG”）。探针尖端功能化的示意图见图1。PEG的...

在过去的30年中，原子力显微镜（AFM）已成为研究生物体系的一种重要成像技术 1,2 和合成的 3 材料和表面，因为它能在三维空间中提供分子级别的空间分辨率，并可在多种溶剂环境中操作。此外，原子力显微镜-单分子力谱（AFM-SMFS）能够测量从皮牛顿（pN）到微牛顿（µN）范围的力，为研究蛋白质折叠等过程提供了前所未有的洞察 4,5，聚合物物理 6–8 ，以及单分子-表面相互作用9–12研究单个分子而非分子集合的 rationale 在于避免平均效应，这种效应常常会掩盖稀有事件或隐藏的分子状态。此外，大量分子参数（如轮廓长度、库恩长度、黏附自由能） 等等。 可以获得。这将在下文的示例中详细说明。在典型的原子力显微镜单分子力谱（AFM-SMFS）实验中，探针分子通过连接分子固定在非常尖锐的探针尖端上。该尖端位于一个可弯曲悬臂的末端。当尖端与表面接触时，探针分子将与该表面发生相互作用。通过监测尖端回撤过程中悬臂的偏转，可测定将分子从表面解离所需的力，进而获得其自由能。为了获得有意义的统计结果，必须采集大量所谓的力-距离曲线。此外，为了实现真正的单分子实验（即在整个实验过程中使用同一探针分子时，应将探针分子共价偶联至原子力显微镜（AFM）探针尖端。本文提供了一种通过共价键将单个分子固定于悬臂梁上的实验方案。该单个分子可通过氨基或巯基与AFM探针尖端连接。偶联过程可在多种溶剂（包括有机溶剂和水相溶剂）中进行，以适应所用聚合物的溶解特性。
第一部分描述了一种通过连接分子将单个分子（“探针分子”）共价连接到原子力显微镜（AFM）针尖的通用实验方案。该过程采用有机NHS或马来酰亚胺化学方法13。文中同时提供了三种示例分子的详细操作步骤，并介绍了数据采集与数据分析流程，以及进一步阅读的参考文献。三种示例分子分别为：（线性）聚合物酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS和脂质POPE。方案中还包括若干微小的调整步骤，例如用于共价连接半胱氨酸的方法。此外，还专门设置一节介绍不同表面的制备方法，如金刚石表面、CH3-自组装单分子层以及脂双层。这些界面已被证实是良好的参照体系和典型示例。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III 碱性液体浓缩液（洗涤剂溶液）</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA（超纯水、过氧化氢（35%）、氨水（32%）；5:1:1（v/v/v））</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond 试剂 / APTES（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干燥丙酮（&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干燥氯仿（&gt; 99.9%）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠（&gt;&amp;nbsp;99.5%）</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单功能 &amp;alpha;-甲氧基-&amp;omega;-NHS PEG，5 kDa，&amp;ldquo;甲基-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异双功能 &amp;alpha;,&amp;omega;-双-NHS PEG，6&amp;nbsp;kDa，&amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异双功能 &amp;alpha;-马来酰亚胺己酸-&amp;omega;-NHS PEG，5 kDa，&amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>探针分子（聚合物、脂质、&lt;em&gt;等&lt;/em&gt;）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>足量带嘴玻璃结晶皿（10&amp;nbsp;ml）、玻璃培养皿（500 &amp;micro;l）和玻璃盖</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>实验室烘箱型号 UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温控超声仪</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子体系统 &quot;Femto&quot;，100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>每种有机溶剂各配备一支独立的玻璃注射器</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（0.5 ml 或 1.5 ml）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器：10–100 &amp;micro;l、50–200 &amp;micro;l 和 100–1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备温控液体池的原子力显微镜（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; MFP-3D 配 BioHeater）</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柔软的氮化硅（SiN）悬臂梁，通常由氮化硅制成（弹性系数小于 100 pN/nm，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; MLCT）</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过原子力谱学研究单分子粘附

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

原子力谱学是研究表面和界面分子的理想工具。本文介绍了一种将多种单分子共价连接到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案。同时对AFM探针进行钝化处理，以防止探针与基底之间发生非特异性相互作用，这是研究连接在AFM探针上的单分子的前提条件。简要介绍了在固体表面和生物界面测定这些分子的黏附力、黏附长度和自由能的分析方法，并提供了进一步阅读的外部参考文献。示例分子包括聚氨基酸聚酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS以及磷脂POPE（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺）。这些分子在不同溶剂条件下，从诸如CH3-自组装单层膜、氢终止金刚石以及支撑脂双层等不同表面被解吸。最后讨论了力谱单分子实验的优势，包括判断实验中是否真正研究了单个分子的方法。

下文展示了上述示例分子的实验结果，这些分子包括聚氨基酸聚酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS以及磷脂POPE。首先，针对每个示例，提供了数据采集和数据处理的实验特异性细节。随后，展示了这些分子从不同表面（CH3-自组装单分子层、氢终止金刚石和脂双层）解吸的典型实验结果。文中介绍了黏附力、黏附长度和自由能的测定方法。
示例1：聚酪氨酸从自组装单分子层的解吸
在不同乙醇含量的溶液中，测定了聚酪氨酸从疏水性自组装单分子层（SAM）上的解吸行为。在每种溶液中，按照前述方法测定悬臂梁InvOLS及弹簧常数，并针对每种溶液至少记录300条力-距离曲线。同一实验组的所有实验均在同一天使用同一个悬臂梁完成，以确保测量的是同一条单一的聚氨基酸链。悬臂梁的伸展/ retract速度为0.5 µm/sec，表面停留时间为1秒。力-距离曲线显示出恒定力的平台区域。每个平台区域均用S型曲线进行拟合，并确定平台力及平台长度，然后将其绘制成直方图。直方图采用高斯函数拟合，提取分布的峰值及...

本文介绍了一种将多种单分子共价偶联到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案，并提供了测定这些分子在固体载体及生物界面黏附力和自由能的步骤与实例。

原子力谱学是研究表面和界面分子的理想工具。一种可耦合多种单分子的实验方案……

本实验的总体目标是将单个聚合物连接到原子力显微镜（AFM）悬臂针尖上，从而对同一分子进行多次、重复的四种光谱表面解吸实验。该目标通过以下步骤实现：首先对针尖表面进行等离子体活化，以形成羟基；第二步，利用向上浸泡法将悬臂针尖进行氨基硅烷化处理，使针尖表面生成氨基。第三步是将聚乙二醇分子与氨基连接。它们可防止探针尖端与基底之间发生非特异性相互作用，并作为聚合物的连接分子。最后，将聚合物共价连接到聚乙二醇分子上，形成探针。测量结果表明，该方法确实能够使用同一个聚合物力探针完成一整套实验，或者同样地，获取数百条力-距离曲线。单分子实验相较于群体方法的主要优势在于，可以研究那些罕见的构象和不常出现的状态，而这些状态在群体平均化处理中通常会被掩盖。由于其尺寸极小，这些实验结果可直接与分子动力学模拟进行比较。第一步是将探针分子共价连接到悬臂探针尖端。使用新鲜的氮化硅悬臂芯片，选择弹簧常数为10至100皮牛/纳米的芯片。使用镊子将它们放置在干净的玻璃载片或培养皿上。接下来，将载有芯片的载片放入100瓦的等离子体腔室中，在腔室抽真空后，通入氧气并以0.25毫巴压力和20瓦功率处理15分钟。在后续步骤中，应使用通风橱，以避免在等离子体处理过程中吸入有机蒸气。在玻璃培养皿中准备用于悬臂梁的氨基硅烷化，加入2.5毫升向上测试溶液。此外，准备一个盛有丙酮的容器。等离子处理一结束，立即取出悬臂梁。将每个悬臂依次浸入丙酮中1秒，然后放入Optus溶液中。室温下孵育悬臂15分钟后再进行后续操作。在悬臂孵育的同时，开始准备进行聚乙二醇化修饰，以尽量减少水分和空气对组分的影响。从预先准备好的离心管开始，其中一管含有 m peg 和 NHS，另一管含有染料。NHS Peg。测定每管中内容物的重量。接下来，取含有 EG NHS 的离心管，准备加入氯仿。加入氯仿，使终浓度为 25 毫摩尔每升，并确保溶液量足以在后续步骤中浸没悬臂。将离心管置于涡旋振荡器上，以确保粉末充分溶解。将装有 EG NHS 的离心管置于一旁，用于后续与饮食相关的操作。NHS peg。加入氯仿，使其终浓度达到 0.25 毫摩尔。使用涡旋混合器确保粉末完全溶解。接着混合溶液，以调节饮食中NHS-peg与甲基-peg-NHS分子之间的比例。该比例通常为1:500。取一个带盖的小型玻璃培养皿以减少蒸发，并将混合物填充至悬臂处。完成孵育。在 APT 测试溶液中，准备两个装有约 10 毫升丙酮的容器和一个装有氯仿的容器，用于冲洗。将每个探针依次浸入丙酮两次，再浸入氯仿一次，然后将其放入聚乙二醇溶液中。盖上培养皿，使悬臂梁保持在溶液中。在此期间，用一小时时间准备探针分子（本实验中为聚氨基酸聚脱酪氨酸）的共价偶联。首先取一摩尔氢氧化钠溶液，将探针分子溶解至浓度为一毫克每毫升。对于聚D-酪氨酸，将氢氧化钠替换为pH 8至8.5的硼酸钠缓冲液。在

investigating-single-molecule-adhesion-by-atomic-force-spectroscopy

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

调查单分子粘附的原子力谱

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。...

黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

纤维素体是用于降解纤维素的多酶复合物。本研究采用基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based...

利用基于原子力显微镜的单分子力谱研究纤维素体的受体-配体系统

胶体探针纳米显微技术可用于多个领域，以深入了解胶体体系的物理稳定性和凝集动力学，并借助生物系统辅助药物发现与制剂科学研究。本文所述方法为研究此类体系提供了定性与定量的手段。...

利用胶体探针纳米显微技术对颗粒-颗粒相互作用进行定量与定性分析

本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）通过单分子力谱测量技术，研究明确定义的无机表面与肽或氨基酸之间相互作用力的实验方案。该测量所获得的信息对于深入理解肽-无机材料界面具有重要意义。...

利用单分子力谱研究氨基酸和肽与无机材料相互作用的机制

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。...

使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

本方案描述了使用异双功能硅烷偶联剂将蛋白质共价固定在二氧化硅表面的方法，该表面专为基于原子力显微镜的单分子力谱技术而设计，并以肺炎链球菌（S.

用于单分子力谱的蛋白质共价固定

本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。...

OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

将探针分子共价连接到原子力显微镜（AFM）悬臂尖端是研究其物理性质的关键技术。通过基于AFM的单分子力谱法，可高度可重复地测定聚合物的拉伸力、脱附力及其长度。...

用于基于原子力显微镜的力谱单分子共价连接

集成力谱技术（EFS）是一种在生物物理和生物传感领域中用于机械解折叠及实时检测一组生物分子结构的可靠技术。...

通过剪切力进行的集成力谱学

我们描述了一种制备具有最小流体动力学尺寸的胶体量子点的方法，用于单分子荧光成像。与传统量子点相比，这些纳米粒子的尺寸与球状蛋白质相似，并在单分子亮度、抗光降解稳定性以及抵抗与蛋白质和细胞的非特异性结合方面进行了优化。...

用于单分子成像的紧凑型量子点

学习利用原子力显微镜进行单分子粘附力谱分析，通过等离子体活化、氨基硅烷化和聚乙二醇连接技术制备功能化探针。该方法可实现同一聚合物的多次重复测量，提高粘附力与自由能测量的准确性，适用于生物物理学和表面化学研究。

通过原子力谱学研究单分子粘附

探索更多视频