Name: 基因表达的变化大鼠海马后，前丘脑核脑深部刺激分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习前丘脑核脑深部刺激技术，分析大鼠海马区BDNF和GABRD基因表达变化，探索癫痫治疗的分子机制与神经保护途径。该方法为神经调控研究提供可靠的实验方案。

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我们感谢 NREF 基金会的支持。

注意：伦理声明：本文所述所有操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）动物研究指南（《实验动物护理与使用指南》）的要求，并已获得哈佛医学院动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 术前准备
<ol>
	<li>确保所有外科手术器械均通过高压灭菌或根据需要使用消毒溶液和/或乙醇进行清洁消毒。尽可能使用无菌一次性设备，如手术刀、针头和注射器。</li>
	<li>用外科手术巾覆盖工作台面，并确保配备有生物危害废物处理设施。</li>
	<li>称量大鼠体重并计算麻醉剂量。使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮 75 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）对大鼠进行麻醉。 
	注意：体重在 200–250 g 之间的大鼠最适合固定于立体定位仪中，并可实现对丘脑前核（ATN）的精确定位。也可使用异氟烷作为麻醉剂。</li>
	<li>将两个无菌电极（通过高压灭菌或环氧乙烷灭菌）安装并固定在立体定位手术仪的电极夹持器 &#160;(图 2) 上，并借助显微镜（10–40 倍放大），检查电极尖端是否对齐。将两个电极固定在相距 3.0 mm 的位置。 
	注意：操作时应避免电极尖端接触硬物表面，以防损坏。</li>
</ol>
2. DBS 手术
<ol>
	<li>向动物腹腔内注射氯胺酮/赛拉嗪混合物，并通过检查趾夹反射、呼吸频率、呼吸深度及呼吸节律确认动物已达到外科麻醉水平。剪除将要切开的头皮区域的毛发，并使用聚维酮碘与酒精或无菌生理盐水交替各擦洗三次对头皮进行消毒。将动物固定并安置于立体定位仪上。</li>
	<li>使用循环温水垫&#160;以维持动物体温在最佳水平。&#160;为动物的眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止过度干燥。&#160;</li>
	<li>使用以下立体定位坐标靶向丘脑前核（ATN）：前后向 -1.6 mm，内外向 1.5 mm，背腹向 5.2 mm1. 
	注意：立体定位坐标基于 Paxinos 和 Watson（6th 第X版 大鼠脑图谱36.</li>
	<li>沿矢状方向切开头皮以暴露颅骨。使用一对牵开器固定切开的头皮，充分暴露颅骨。用无菌生理盐水冲洗切口。若切口过湿，可用无菌棉签蘸干。定位前囟点，并用黑色标记笔做标记。为引导钻孔位置，在矢状缝两侧约1.5 mm处及冠状缝后方1.6 mm处再做两个标记。</li>
	<li>使用手持钻头制作骨窗。用乙醇对钻头尖端进行消毒，确保其无菌。钻孔时，将钻头与颅骨表面保持约45°角。钻孔过程中应频繁交替操作两个骨窗位置，以避免任一骨窗区域产生过多热量。</li>
	<li>继续钻孔直至暴露硬脑膜。使用针尖弯曲呈“L”形的针头，清除可能阻碍电极插入的碎骨片。用弯针清除骨碎片时，注意避免损伤下方的硬脑膜和/或脑组织。 
	注意：也可使用钝针或精细钝头镊子。</li>
	<li>将双电极组件固定在立体定位仪旋转手柄上，并将手柄固定于90°角度。利用立体定位仪的调节装置，将左侧电极精确定位于前囟正上方。</li>
	<li>使用立体定位仪的内外侧位置调节装置，将左侧电极精确向bregma左侧移动1.5 mm，使两个电极沿冠状缝完美对齐，并在bregma处内外侧间距为1.5 mm。</li>
	<li>使用前后向立体定位调节，将电极移动至冠状缝后方1.6 mm处。</li>
	<li>使用背腹向调节装置降低电极，首先检查颅骨钻孔位置是否准确，确保电极能够顺利插入，且不接触钻孔的粗糙边缘。若位置正确，将电极插入至颅骨表面以下5.2 mm深度。</li>
	<li>通过导线将电极连接至刺激器，参数设置为130 Hz、2.5 V、脉宽90 µsec1.</li>
	<li>以高频刺激持续一小时（或根据实验设计所需的特定时长）。在刺激过程中，需定期通过足趾夹捏检查是否无肢体回缩反应，以确认麻醉深度适当。根据需要，以初始麻醉剂量约一半的剂量追加麻醉药物。检查麻醉深度时避免污染无菌手套，必要时及时更换。根据实验需求选择单侧或双侧刺激。设置对照组，例如低频刺激（用于 例如10 Hz）以及未刺激动物（仅插入电极但不进行后续刺激）。</li>
	<li>刺激结束后，小心移除电极，并用3-0缝线或无菌外科缝钉闭合切口。</li>
	<li>皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）以进行镇痛。监测动物直至其恢复至正常活动状态，随后将其送回饲养设施。</li>
	<li>根据实验设计设定的一段时间后（对于 例如在DBS手术后0、3、6或12小时，通过过量麻醉处死动物。确认生命体征消失后，将动物断头。</li>
	<li>使用剪刀去除皮肤后，解剖取出脑组织。用解剖剪沿矢状缝切开颅骨。在颅骨两侧外侧各做约一英寸长的两个切口。用镊子提起颅顶部分被切断的骨片，暴露脑组织。</li>
	<li>使用精细剪刀或镊子将脑组织从颅骨中取出，并转移至含有冰冷 PBS 的培养皿中，置于冰上。 
	注意：在通过颅骨进行切口时，需小心避免损伤脑组织。</li>
</ol>
3. 海马体分离
注意：本节后续所有步骤均需在冰上进行。
<ol>
	<li>将脑组织置于冰上预冷的丙烯酸脑组织切片矩阵中。使用剃刀刀片，从脑组织最前端向前约7-8 mm处进行冠状切面切割。在第一刀切口的后方再进行第二次冠状切面切割，以移除一块厚度约为5 mm的脑片。</li>
	<li>将脑片转移至含有冰冻PBS的培养皿中。使用剃刀刀片将两个半球部分切开，并注意记录左、右半球各自对应的侧别。在进行单侧刺激实验时，此步骤尤为重要。</li>
	<li>使用精细镊子和剪刀小心分离海马组织。</li>
	<li>将海马组织在干冰上速冻，并保存于-20 °C冰箱中，直至进行后续RNA提取步骤。 
	注意：如需长期保存，建议将组织存放在-80 °C冰箱中。</li>
</ol>
4. RNA 提取与定量 PCR
<ol>
	<li>在准备匀浆前，确保组织始终在干冰上保持冷冻状态。</li>
	<li>注意：此步骤需在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>向装有海马组织的1.5 ml离心管中加入1 ml Trizol试剂，首先通过反复吹打使组织破碎成较小碎片，进行初步匀浆。随后使用25 G针头抽吸组织液数次，进一步匀浆，直至肉眼不可见未破碎组织。所有匀浆操作均需在冰上进行。</li>
		<li>匀浆完成后，将细胞悬液在室温下静置5分钟，以促进细胞裂解。 
		注意：此后细胞悬液可快速冷冻，并于-70 °C保存，待后续处理时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入0.2 ml氯仿，涡旋振荡20秒混匀，室温静置15分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。离心后小心取出离心管，避免扰动所形成的三层分离相。 
	注意：下层（红色）相含有蛋白质，中间浑浊相含有DNA，上层透明相含有RNA。</li>
	<li>将上层透明相（RNA相）转移至新的1.5 ml离心管中（通常可获得约500 µl含RNA的液体）。向其中加入0.5 ml异丙醇，涡旋混匀。再加入2–3 µl甘油原（20 mg/ml）作为RNA的载体。将样品在室温下静置10分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以12,000 × g离心1小时。确保离心后可在管底观察到RNA沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，向RNA沉淀中加入1 ml 75%乙醇（用无核酸酶水配制）进行洗涤。反复倒置离心管，直至沉淀从管底脱落并悬浮于溶液中。在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟。 
	注意：含RNA沉淀的75%乙醇溶液可在-20 °C保存，待后续步骤使用。</li>
	<li>将离心管敞口置于室温下静置5分钟，使RNA沉淀自然风干。注意避免过度干燥，以免影响后续步骤中RNA在水中的溶解。</li>
</ol>
5. 从RNA制备物中去除DNA
<ol>
	<li>向RNA沉淀中加入9 µl无核酸酶的水，轻轻涡旋试管，确保沉淀完全溶解后再进行下一步操作。随后加入1 µl 10x DNase I缓冲液和1 µl重组DNase（来自DNase I试剂盒），通过轻轻弹击试管混匀，短暂离心，然后在37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>向样品中加入2 µl DNase失活试剂（来自DNase I试剂盒），室温孵育2分钟，并通过轻轻弹击试管频繁混匀。在12,000 × g离心10分钟，将约10 µl澄清上清液转移至新的1.5 ml离心管中。</li>
	<li>使用Nanodrop或分光光度计测定RNA浓度。</li>
</ol>
6. 从RNA合成cDNA
<ol>
	<li>加入含有 1 µg RNA 的相应体积，并用无核酸酶水将总体积补至 8 µl。随后加入 1 µl 10 mM dNTP 混合液和 1 µl Superscript 第一链合成试剂盒中的随机六聚体引物。轻轻混匀后，在水浴或预设程序的热循环仪中于 65 °C 孵育 5 分钟。</li>
	<li>配制如下试剂的预混液：2 µl 10x RT 缓冲液、4 µl 25 M MgCl2、2 µl 0.1 M DTT 和 1 µl RNA酶抑制剂（RNAse OUT，40 U/µl）。 
	注意：上述体积为单个反应所需量，用户需根据实验需求按比例放大。</li>
	<li>将含 RNA 的样品从 65 °C 取出后，室温静置 1 分钟。加入 9 µl 预混液，室温孵育 2 分钟。然后加入 1 µl Superscript II 逆转录酶（50 U/µl），再于室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>将样品于 42 °C 孵育 50 分钟，以完成逆转录反应。</li>
	<li>将样品于 70 °C 孵育 15 分钟以终止反应。</li>
	<li>短暂将样品置于冰上，加入 1 µl RNA酶H（2 U/µl），然后于 37 °C 孵育 20 分钟。</li>
	<li>将离心管短暂离心（3,000 x g），以收集管壁冷凝液。 
	注意：所得即为用于定量 PCR 的 cDNA。cDNA 可暂时储存于 -20 °C 冰箱中，待进行 PCR 时使用。也可在进行 PCR 前用无核酸酶水稀释 cDNA。</li>
</ol>
7. 定量 PCR
<ol>
	<li>配制主混合液，包含以下试剂（所列体积为每反应所需）：6.3 µl 的 2x Sybr Green Mix、0.6 µl 正向引物（10 µM）、0.6 µl 反向引物（10 µM）以及 0.5 µl 无核酸酶水。 
	注意：引物设计采用 NCBI 核苷酸序列页面中针对目标基因的“Pick Primers”功能完成。</li>
	<li>向 96 孔 PCR 板的每个孔中加入 10 µl 主混合液。向含有主混合液的孔中加入 2.5 µl 之前制备的 cDNA。确保每个样本设置三个重复的 PCR 反应。</li>
	<li>完成主混合液和 cDNA 的添加后，使用光学粘性封膜覆盖 PCR 板以密封各孔。将 PCR 板在台式离心机中短暂离心，500 × g 离心 5 分钟，使所有液体沉降至孔底。</li>
	<li>将 PCR 板放入预设程序的 RT-PCR 仪器中。使用 表 1 中提供的 PCR 参数进行扩增。</li>
	<li>数据分析：利用 qPCR 输出的 Ct 值进行后续计算。除目标基因外，还需设置内参基因 18S rRNA（用于确保上样量一致）和 β-actin（阴性对照）的 PCR 反应。根据 ΔΔCt 法计算相对表达倍数变化37。</li>
</ol>

作者无披露信息。

继贝纳比德的开创性工作之后 等 在使用脑深部电刺激治疗帕金森病和原发性震颤的过程中，过去十年间，DBS 手术技术已受到广泛关注，并被研究用于治疗多种神经系统疾病6,10,43目前，多个研究团队正在针对脑神经回路中的不同神经解剖学区域开展脑深部电刺激（DBS）研究，以应对主要的神经性疾病，这些研究处于临床试验的不同阶段。刺激丘脑底核（STN）或苍白球内侧部（GPi）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗帕金森病的运动障碍10SANTE 临床试验表明，接受丘脑前核高频刺激的癫痫患者呈现出良好的治疗趋势31双侧穹窿深部脑刺激的I期临床试验结果显示，认知功能下降速度减缓，阿尔茨海默病中观察到的葡萄糖低代谢摄取现象出现逆转，同时记忆相关神经环路被激活8,44此外，近年来神经外科医生已开展深部脑刺激（DBS）临床试验，用于治疗强迫症（OCD）、难治性抑郁症、抽动秽语综合征（Tourette syndrome）和成瘾等神经精神疾病。10,45-55.
除了...

深部脑刺激作为一种神经外科技术的发展历史可追溯至19世纪70年代，当时人们开始探索通过电刺激脑回路的可能性2。自20世纪60年代起，慢性高频刺激开始被用于治疗神经性疾病3。到了20世纪90年代，随着慢性植入式深部脑刺激电极的出现4-6，接受深部脑刺激治疗的神经性疾病种类持续增加。深部脑刺激在美国首次被用于治疗原发性震颤6。如今，该手术已广泛应用于目前无法通过药物干预有效治疗的多种神经性疾病。目前，深部脑刺激已被用于治疗帕金森病和肌张力障碍等运动障碍疾病7-9。阿尔茨海默病型痴呆、亨廷顿病、癫痫、慢性疼痛以及神经精神类疾病，如抑郁症、强迫症（OCD）、抽动秽语综合征（Tourette’s syndrome）和成瘾等，也均属于可采用深部脑刺激治疗的疾病范畴10-12。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）仅正式批准深部脑刺激用于治疗帕金森病、肌张力障碍和原发性震颤，但针对上述其他疾病的深部脑刺激应用目前正处于不同阶段的实验室与临床研究中，为患者带来了广阔前景13,14。
临床上，DBS 手术分为两个阶段进行。第一阶段是通过影像定位、CT、MRI 以及微电极记录相结合的方法，将 DBS 电极精确地植入目标解剖位置。第二阶段是在患者上胸部植入脉冲发生器，并将延伸导线从头皮连接至脉冲发生器。根据不同的神经系统疾病，目前已标准化多种脉冲发生器的编程方案，用于输送目标电压。最终电压通过逐步调整的方式确定，以期在最低电压下获得最佳的临床疗效15。然而，在我们的研究中，与临床使用的慢性 DBS 植入不同，为了简化实验设计，我们在动物模型中采用了一次性高频刺激（持续 1 小时）的方法。
本课题组的研究重点之一是探索脑深部电刺激（DBS）手术在治疗难治性癫痫中的应用。已有大量研究采用立体定向外科技术结合高频刺激，作为治疗药物难治性癫痫的有效手段，此类癫痫约占所有癫痫病例的30%10,16,17。过去曾尝试以小脑皮层及深部小脑核团为刺激靶点来治疗癫痫10,18,19。此外，也进行过针对海马的刺激治疗，但疗效不一20,21。其他被研究过的癫痫DBS靶点还包括大脑皮层、丘脑、丘脑底核和迷走神经8。然而，近年来多项研究结果表明，丘脑前核（anterior thalamic nucleus, ATN）已成为治疗癫痫最常用的DBS靶点10,22。基于对神经解剖回路的认识以及动物模型的研究发现，多项研究聚焦于ATN深部脑刺激在治疗癫痫中的治疗作用23-26。ATN是边缘系统回路的一部分，位于影响癫痫发作频率的脑区。Hamani et al. 在匹罗卡品诱导的癫痫模型中验证了ATN-DBS的有效性，发现双侧ATN刺激可延长匹罗卡品诱导的癫痫发作及癫痫持续状态的潜伏期24。此外，在戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）癫痫模型中，ATN的高频刺激被证实可降低癫痫发作频率25,27-29。Lee et al. 报道，在慢性深部脑刺激治疗难治性部分性癫痫时，癫痫发作频率平均减少约75%30。
一项针对难治性癫痫的近期临床研究显示，以丘脑前核（ATN）为靶点的深部脑刺激（DBS）手术取得了令人鼓舞的结果22。一项纳入110例接受双侧ATN-DBS治疗难治性癫痫患者的多中心随机临床试验（SANTE试验）表明，癫痫发作频率下降约40%31。该研究结果还提示，DBS术后2-3个月才观察到最佳抗癫痫效应，具有延迟性。Toda等的后续研究进一步证实了这些发现，他们在动物模型中证明DBS术后较晚时期（第3-5天）发生神经发生1。此外，Encinas 等报道了在成年小鼠齿状回中，经ATN高频刺激后可诱导海马神经发生32。既往研究33-35报道，在某些癫痫病例（如慢性颞叶癫痫）中海马神经发生减少，并与学习障碍、记忆损害及自发性反复运动性癫痫发作相关。此外，在动物模型中，慢性癫痫海马组织中的神经干细胞前体因子（如FGF2和IGF-1）表达降低33。鉴于上述发现，诸如DBS等能够增强齿状回神经发生的干预策略，为相关研究提供了令人期待的方向。这些发现促使我们进一步深入探究DBS治疗癫痫后神经发生的潜在机制。我们曾对ATN进行单侧（数据未报道）及双侧（代表性结果中展示）刺激，并在大鼠齿状回中观察到神经营养因子（BDNF）表达升高。我们目前的假说是，BDNF表达启动了一项基因表达级联反应，最终导致神经发生，从而介导DBS手术的抗癫痫效应。本文中，我们介绍了以大鼠ATN为靶点的DBS手术方法，以及后续的基因表达分析流程，作为一种研究DBS治疗益处潜在机制的可行策略。

<table><tbody><tr><td>深部脑刺激手术</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>钻具&amp;nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, 7.2 V</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-803-6637</td><td>属三级管制药品，须依照机构规定进行采购、使用和储存</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-850-2280</td><td>属三级管制药品，须依照机构规定进行采购、使用和储存</td></tr><tr><td>外科缝合钉</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>缝线（3-0）&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 ml，29½ G）</td><td>BD</td><td>329464</td><td>无菌，用于腹腔注射麻醉药</td></tr><tr><td>注射器（3 ml，25 G）</td><td>BD</td><td>309570</td><td>无菌，用于皮下注射镇痛药</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD</td><td>305761</td><td>无菌，用于清除骨孔中的碎骨片</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25309B</td><td>用于常规消毒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>眼润滑剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>刺激器</td><td>Medtronic</td><td>Model 3628</td><td></td></tr><tr><td>DBS电极</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>电极为铂金材质，同心圆型，双极结构</td></tr><tr><td>聚维酮碘（碘伏）&amp;nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>一次性棉签棒，用于切口前头皮消毒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;脑组织解剖与海马组织分离</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸啮齿类脑组织切片模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>175-300</td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>断头剪</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>用于断头操作，确保剪刀保持清洁并处于良好工作状态</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Codman Classic</td><td>34-4098</td><td>用于从颅骨中取出脑组织</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72957-06</td><td>用于从颅骨中取出脑组织及解剖过程中的组织操作</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;RNA提取与cDNA制备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol试剂</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>操作时必须在通风橱中进行，并佩戴护目镜；避免接触皮肤</td></tr><tr><td>注射器（3 ml，25 G）</td><td>BD</td><td>309570</td><td>用于组织匀浆</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>操作时必须在通风橱中进行，并佩戴护目镜；避免接触皮肤</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>DNase I试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript第一链合成试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;定量PCR</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>定制寡核苷酸</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>PCR板（96孔）</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>光学密封膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

丘脑前核深部脑刺激后大鼠海马区基因表达变化的分析

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

脑深部电刺激（DBS）手术通过靶向大脑多个区域（如基底神经节、丘脑和丘脑下核区域），已成为治疗多种药物难治性运动障碍的有效手段。近年来，DBS手术的应用范围已逐步拓展至病态性肥胖、抑郁症及强迫症等其他疾病领域。尽管适应证不断扩展，目前对DBS手术产生治疗效应的潜在生理机制仍知之甚少。研究这一问题的一种方法是对接受电刺激的神经元进行基因表达分析。既往研究表明，在大鼠中通过DBS靶向丘脑前核（anterior nucleus of the thalamus）可诱导齿状回的神经发生1。临床上，靶向ATN的DBS手术已广泛用于治疗耐药性癫痫。因此，探索电刺激ATN所诱导的转录水平变化对我们具有重要意义。本文中，我们描述了在成年雄性Wistar大鼠中实施立体定向引导下靶向ATN的DBS手术的技术方法，并阐述了后续的组织解剖、RNA提取、cDNA制备以及定量RT-PCR检测基因表达变化的操作步骤。该方法可被应用于或经修改后用于刺激基底神经节及其他临床上常靶向的大脑区域。本文所述的基因表达研究采用候选靶基因策略，以发现可能介导DBS作用机制的关键分子因子。

图1A 和 图1B 显示了BDNF和GABRD相对于对照基因β-actin的相对表达水平。BDNF是一种神经营养因子，常与多种神经疾病中的神经保护作用相关38-41。因此，分析在刺激前丘脑核（ATN）后BDNF的表达谱具有重要意义，因为ATN刺激可为癫痫患者带来治疗益处。在 图1A 中，展示了深部脑刺激（DBS）术后各指定时间点BDNF的基因表达谱，结果显示在DBS手术后即刻（0小时）BDNF表达即上调，并在刺激后3小时达到峰值（比未刺激组高3倍）。该结果提示，BDNF表达的增强及其介导的神经保护作用可能有助于DBS的治疗效果。另一个基因GABRD（图1B）也通过qPCR方法进行了检测。GABRD是一种GABA受体，是抗癫痫药物研发的潜在靶点之一42。GABRD的表达谱同样显示，在DBS刺激后3小时，刺激组动物的表达水平高于未刺激对照组动物。鉴于GABA激动剂已被用作有效的癫痫发作抑制剂，观察到DBS后GABRD表达增强的现象引人关注，提示GABA可能在DBS...

深部脑刺激（DBS）手术治疗作用背后的机制仍需进一步研究。本文所述方法介绍了一种实验性方法，通过分析可能促进DBS术后神经发生的候选基因的基因表达谱，来探讨DBS所触发的细胞事件。

脑深部电刺激（DBS）手术通过靶向基底神经节、丘脑及丘脑下区等脑区，是一种有效的……

本实验的总体目标是对大鼠丘脑前核进行深部脑刺激，并研究其海马组织中基因表达的变化。首先对动物实施麻醉，随后进行手术准备。在头皮上做切口并暴露颅骨。然后在相对于bgma的正确位置钻出骨孔。插入DBS电极并进行刺激。最后，处死动物并解剖脑组织。为分离海马体，对组织进行RNA提取，并进行cDNA合成和定量PCR检测。最终结果表明，深部脑刺激可影响大鼠海马体中的基因表达。该方法有助于解答脑深部电刺激手术中的关键问题，例如脑深部电刺激手术治疗作用的分子机制是什么？该技术的意义不仅延伸至癫痫的治疗，还涵盖其他神经系统疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病和肌张力障碍。由于脑深部电刺激（DPS）正成为治疗多种神经功能障碍的外科手段，在手术准备阶段，应使用手术垫覆盖工作台，并确保配备有生物危害废物处理设施。称重大鼠，并根据文本方案计算麻醉剂量。将两个电极安装并固定在立体定位手术架的电极夹持器上，使用显微镜检查电极尖端是否对齐。将电极固定在相距三毫米的位置，注意避免电极尖端接触硬质表面。注射氯胺酮和赛拉嗪。将腹腔内注射的麻醉剂混匀后给予动物，并通过检查趾夹反射、呼吸频率以及呼吸的深度和规律性，确认动物已达到外科麻醉水平。将动物固定并置于立体定位仪上。在动物眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防角膜过度干燥，并使用碘伏和酒精或无菌生理盐水交替擦拭三次，对头皮进行消毒。将动物置于循环温水垫上，或使用加热灯以维持动物体温在最佳水平。根据Paxos和Watson大鼠脑图谱，使用以下立体定位坐标靶向丘脑前核或NT（前-后：-1.6毫米；内-外：1.5毫米；背-腹：5.2毫米）。接着，在头皮上做矢状切口以暴露颅骨。使用一对牵开器固定切开的头皮，以充分暴露颅骨。然后用浸有乙醇的无菌棉签清洁切口区域，清晰显露颅骨缝。定位bgma，并用黑色标记笔标记，以确定钻孔的位置。在矢状缝两侧外侧约 1.5 毫米处以及冠状缝后方 1.6 毫米处再做两个标记。现在开始制作两个钻孔，先用乙醇消毒钻头尖端。以45度角持钻头进行钻孔，频繁在两个孔之间切换，以避免任一钻孔中心产生过多热量。持续钻孔直至暴露硬脑膜。使用尖端弯成L形的针头，清除可能阻碍电极插入的任何碎骨片。在移除骨碎片时需注意避免损伤下方的硬脑膜和/或脑组织。将双电极组件固定在立体定位仪的旋转手柄上，并将手柄固定在90度角位置。通过调节立体定位仪，将左侧电极精确置于bgma正上方。利用立体定位调整介质。通过外侧定位，将左侧电极精确向左移动1.5毫米至bgma左侧，使现在有两个电极沿冠状缝完美对齐，但相距1.5毫米，在bgma处呈外侧-内侧分布。然后通过前后向立体定位调节，将电极移至冠状缝后方1.6毫米处。接着通过背腹向调节， lowering 电极以首先检查钻孔位置是否正确，确保电极能够顺利插入，且不接触钻孔粗糙的边缘。若位置正确，则将电极插入至颅骨表面下5.2毫米深度。通过导线将电极连接至刺激器，设置参数为130赫兹、2.5伏特、脉冲宽度90微秒。在所需时间段内给予高频刺激。可进行单侧或双侧刺激。刺激结束后，小心移除电极，使用三根零号缝线或无菌外科缝合钉闭合切口，皮下注射布托啡诺，并监测动物直至其恢复至正常活动状态，然后将其送回饲养设施。将脑组织置于冰上预冷的丙烯酸脑组织切片模具中，使用剃刀片从脑组织最前缘约七到八毫米处进行冠状切片。在第一次切口的内侧和后侧再进行一次切割，以便切下一片约五毫米厚的脑组织切片。使用刀片将脑组织切片转移至含有冰冻 PBS 的培养皿中，分离两个半球状组织部分，并注意记录哪一部分对应左侧和右侧。使用精细镊子和剪刀，小心分离海马组织，将组织在干冰上速冻，并在 -20 °C 下保存，直至进行后续 RNA 操作。根据此处所示文本方案进行操作，图中显示了在指定时间点 BDNF 相对于对照基因 β-actin 的相对表达水平。脑深部电刺激术后。在DBS手术后立即观察到BDNF表达上调，并在刺激后3小时达到表达峰值。该观察结果提示，BDNF表达增强及其带来的神经保护作用可能有助于DBS对癫痫患者的治疗获益。该图显示了GABA受体G-A-B-R-D的表达情况，在DBS刺激后3小时，与未刺激的对照组动物相比，刺激组动物中G-A-B-R-D的表达增强。考虑到GABA激动剂被用作有效的癫痫发作抑制剂，观察到DBS后G-A-B-R-D表达增强，提示GABA可能参与了DBS的抗癫痫作用。按照本实验方案进行操作。其他方法如蛋白质印迹、染色质免疫沉淀以及许多其他标准的分子生物学检测也可进行。这有助于回答有关蛋白质表达变化、翻译后修饰、特定基因启动子区域转录因子占据情况等问题。观看本视频后，您应能充分理解如何在大鼠中实施深部脑刺激手术。分离海马组织并分析其基因表达变化。

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基因表达的变化大鼠海马后，前丘脑核脑深部刺激分析

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利用体内FDG-PET评估大鼠急性深部脑刺激诱导的代谢神经调节作用

来源：Selvakumar, T., et al., 丘脑前核深部脑刺激后大鼠海马基因表达变化的分析。 J. Vis. Exp.

深部脑刺激对大鼠模型海马神经元活动的影响

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学习前丘脑核脑深部刺激技术，分析大鼠海马区BDNF和GABRD基因表达变化，探索癫痫治疗的分子机制与神经保护途径。该方法为神经调控研究提供可靠的实验方案。

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