Name: 基于ES-Cell的编程组合MYH6启动子，选择小鼠心脏起搏器细胞聚集一代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习利用小鼠多能干细胞通过抗生素筛选和悬滴培养法高效生成高纯度窦房结起搏细胞。该方法可产生超过80%纯度的功能性起搏细胞，用于心脏节律研究和药物测试。

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1. 开始前的建议
<ol>
	<li>请勿使用支原体污染的PSCs，因为它们无法正常分化为窦房结细胞。在开始本方案前，需使用PCR试剂盒检测支原体污染，该方法可实现快速、高灵敏度的支原体检测，并请遵循试剂盒制造商的说明书操作。</li>
	<li>对于每个培养皿（步骤2.3.4），在37 °C条件下，用7 ml无菌的0.1%冷水鱼皮明胶对一个10 cm2的细胞培养皿包被1小时。去除明胶后，在无菌操作台内无菌条件下让培养皿干燥。</li>
	<li>在启动分化方案之前，需准备一种双转染的稳定小鼠胚胎干细胞系克隆，其具备以下特征：i) 使用哺乳动物表达载体实现TBX3的组成型过表达；ii) G418抗性基因受Myh6启动子调控5。</li>
	<li>未分化的PSCs细胞应在标准条件下与经辐照处理的饲养层细胞共培养，具体方法见文献1所述。</li>
</ol>
2. 分化步骤
<ol>
	<li>分化前两天——将 PSCs 从饲养层细胞中分离
	<ol>
		<li>吸弃培养基，用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入7 ml IV型胶原酶溶液，于37 °C孵育10分钟。将一个无菌的40 µm滤膜置于50 ml离心管中。</li>
		<li>用移液器将胶原酶溶液上下吹打5次，轻轻冲洗PSC集落（注意避免去除饲养层细胞）。</li>
		<li>将细胞悬液转移至40 µm滤器中，用8 ml PBS冲洗滤器三次。翻转滤器，将其倒置于培养皿中。通过移液枪向滤器底部加入10 ml PBS，以去除PSC细胞集落。</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在300 x g下离心5分钟。</li>
		<li>移除 PBS，加入 1 ml Accutase 重悬细胞，于 37 °C 孵育 5 min。</li>
		<li>加入10 ml PBS，用移液器上下吹打细胞悬液5次混匀，然后在300 x g离心5分钟。</li>
		<li>吸除 PBS，将细胞重悬于 10 ml 培养基中，并测定细胞数量。</li>
		<li>接种15,000个细胞/cm²2 在75 cm处2 滤瓶，并在37 °C、5% CO2条件下培养2天。2天后，培养瓶中的细胞应达到50-70%融合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第0天 - 分化开始
	<ol>
		<li>吸去培养基，用 10 ml PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>吸去 PBS，加入 2 ml Accutase，于 37 °C 孵育 5 分钟。将一个无菌的 40 µm 滤器置于 50 ml 离心管中。</li>
		<li>加入10 ml PBS，将细胞悬液转移至40 µm滤膜，用10 ml PBS冲洗滤膜，离心滤过液5分钟，300 x g。</li>
		<li>将细胞重悬于10 ml分化培养基中，并测定细胞数量。</li>
		<li>用分化培养基将细胞悬液稀释至终浓度为20,000个细胞/ml。</li>
		<li>用移液器向方形培养皿中加入20 ml水和5 ml悬滴（HD）溶液，以防止悬滴干燥。 
		注意：对于每块含有iSABs的24孔板（参见第2.8.6.4/2.8.7节），需准备16个培养皿。</li>
		<li>用移液器吸取最多 50 ml 细胞悬液至托盘中。</li>
		<li>将培养皿盖翻转。使用12通道移液器，将180个含有20 µl（每孔400个细胞）细胞悬液的孔加入到盖子上。</li>
		<li>小心地将盖子翻转并放置到培养皿上。 
		注意：旋转盖子的速度非常关键。如果旋转速度过慢或过快，细胞悬液的表面张力将不足以使悬滴保留在盖子上。在首次制备悬滴前，建议先用20 µl培养基液滴练习旋转盖子的操作。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞 2 天2 使其形成拟胚体。 
		注意：在5个培养皿堆叠的顶部放置一个装有水的培养皿，否则上方培养皿中的HD会变干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>小心翻转方形培养皿的皿盖，将来自两个培养皿的胚状体（360个EBs）转移至50 ml离心管中。</li>
		<li>等待10分钟，使EBs沉降至管底（切勿离心EBs）。</li>
		<li>尽可能吸除培养基，将拟胚体重悬于10 ml分化培养基中，转移至10 cm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2-6天 悬浮培养
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下将拟胚体悬浮培养4天2，2天后更换培养基。 
		注意：尽管培养皿未经包被处理（与细胞培养皿不同），胚胎干细胞聚集体（EBs）仍常会贴附于皿底表面。需每天检查培养皿中EBs的贴壁情况，必要时通过轻柔吹打将贴壁的EBs从皿底分离。可选步骤：在悬浮培养期间持续轻度摇动培养皿，注意控制摇床速度，避免EBs在皿中央聚集或漂向皿边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第6天
	<ol>
		<li>将EBs从一个培养皿转移至一个明胶包被的10 cm培养皿中2 细胞培养皿</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第7-12天
	<ol>
		<li>细胞应在8-12天后开始搏动。每天在显微镜下观察细胞的搏动区域。细胞开始形成单层。</li>
		<li>每天更换培养基。 
		注意：更换培养基后，细胞需要 3-4 小时恢复并重新开始搏动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第12至15天 窦房结样细胞的筛选
	<ol>
		<li>细胞开始搏动后三天（约第12至15天），吸除培养基，加入10 ml含有400 µg/ml G418的新鲜分化培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始筛选后的第四天，将细胞层解离。 
	注意：细胞层可能已从表面脱落。
	<ol>
		<li>小心移除培养基，避免吸到细胞层。</li>
		<li>加入10 ml PBS，小心移除PBS，避免吸走细胞层。</li>
		<li>加入10 ml Collagenase IV溶液，将细胞转移至50 ml离心管中，在37 °C孵育5 min。</li>
		<li>用移液器上下吹打悬液10次使其充分混匀，将细胞在37 °C孵育5分钟。应形成由小细胞团簇组成的悬液。若仍有较大块的组织残留，则重复步骤2.8.4两次。</li>
		<li>加入 20 ml PBS，以 300 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>小心吸除 PBS。 
		注意：如果要生成iSABs，请继续进行步骤2.8.7；如果要生成由iSAB衍生的窦房结单细胞，请继续进行步骤2.9。</li>
		<li>将细胞重悬于12 ml含有400 µg/ml G418的分化培养基中，并接种至经明胶包被的24孔板中的6个孔（每孔2 ml）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单个结节细胞的生成
	<ol>
		<li>将第2.8.6步的细胞重悬于5 ml Accutase中，37 °C孵育5 min。</li>
		<li>用移液器上下吹打悬浮液10次使其充分混匀，然后将细胞在37 °C下孵育5分钟。</li>
		<li>加入20 ml PBS，以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于12 ml含400 µg/ml G418的分化培养基中，接种至经明胶包被的24孔板的6个孔内（每孔2 ml）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化后第2天，吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次。每孔加入1 ml分化培养基。</li>
	<li>解离后第4-8天，每隔2天更换一次培养基nd 第10天，解离后可使用iSABs或由iSABs衍生的窦房结单细胞进行进一步分析。</li>
</ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).</li>
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<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+programming+of+pluripotent+stem+cells+towards+distinct+cardiovascular+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types.</a> Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).</li>
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<li>Kleger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+calcium-activated+potassium+channels+induces+cardiogenesis+of+pluripotent+stem+cells+and+enrichment+of+pacemaker-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells.</a> Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).</li>
<li>Bakker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+transcription+factor+TBX3+reprogrammes+mature+cardiac+myocytes+into+pacemaker-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells.</a> Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
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<li>Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+human+potassium+channel+suppresses+cardiac+hyperexcitability+in+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes.</a> J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

获得由干细胞衍生的心脏起搏细胞的能力，可能实现“生物起搏器”意义上的正常心律重建。同样，体外药物筛选也将受益于这类细胞的可获得性。多能干细胞（PSCs）能够分化为哺乳动物体内任何类型的细胞，包括具有起搏细胞特性的心肌细胞8,9,10,11,12,13。然而，通常“拟胚体”内的细胞群体高度异质，这不可避免地要求建立可靠的细胞筛选与分离策略——尤其是对于极为稀少的心脏结节细胞这一细胞类型。已有多种方法被尝试，包括基于外源性和内源性表面标志物的方法14、通过药理学手段施加小分子化合物的方法15,16,17，以及直接重编程策略18,19。此外，还有一些非干细胞来源的方法，旨在通过调控介导肌膜电生理的终末效应分子来模拟生物起搏器功能，而非从头生成完全功能性结节细胞20,21。
然而，这两种方法均未能达到必要的高自发性收缩频率和细胞纯度。相比之下，我们的方案所获得的细胞不仅表现出电振荡，还具有内源性起搏细胞特有的电生理和钙信号特征以及独特的形态学特征7。该技术可能...

“病态窦房结综合征”这一术语概括了多种导致心脏起搏系统功能恶化的疾病。它包括病理性、有症状的窦性心动过缓、窦房传导阻滞、窦性停搏以及心动过速-心动过缓综合征。病态窦房结综合征常伴随多种普通心脏疾病，例如缺血性心脏病、心肌病或心肌炎。目前，该病的治疗主要依赖植入电子起搏器。然而，这种方法伴随诸多风险，如感染和电池故障。总体而言，植入人工起搏器的患者发生并发症的几率仍然很高。此外，与内源性起搏系统不同，这些装置无法对激素刺激产生响应。
未来的一种替代方案可能依赖于“生物起搏器”的开发，其中PSCs可作为合适的细胞来源，同时也将对in vitro药物测试具有重要价值。然而，一个主要问题在于胚胎体（EBs）中窦房结样细胞的出现频率极低——通常不超过约0.5%1。
此前的研究表明，通过过表达特定的早期心血管转录因子，例如中胚层特异性后部基因1（Mesoderm-specific-posterior 1, MesP1）和NK2转录因子相关位点5（NK2 transcription factor related, locus 5, Nkx2.5），可实现向特定心肌细胞亚型的“前向编程”2,3。T-box转录因子Tbx3对于窦房结（sinoatrial node, SAN）的正常大小和功能至关重要，已被证实能够启动起搏器基因程序并调控窦房结的分化4。尽管如此，功能性起搏细胞的比例在整体心肌细胞群体中仍未能超过约40%。
因此，需要增加一个基于 Myh6 启动子的抗生素筛选步骤5 由我们首次引入。这最终导致形成此前未观察到的心肌细胞聚集体（“诱导性窦房体”，iSABs），其搏动频率显著增加（&#62;400 次/分钟 体外首次接近小鼠心脏的水平，且与体外培养的小鼠心脏窦房结细胞相当6在给予异丙肾上腺素的情况下，搏动频率可达550次/分钟。值得注意的是，通过广泛的生理学分析证实，iSABs中功能性起搏细胞的比例超过80%。7近年来，已有多种通过直接重编程生成窦房结细胞的方法19，表面标志物14 或使用小分子进行药物治疗16,17 然而，这些方法均未达到iSABs中所观察到的起搏细胞纯度以及接近小鼠心脏的搏动频率。
此外，在一个 离体 成年小鼠心室切片培养模型在失去自发搏动活性后，iSABs 能够整合至切片组织中，保持自发活性，并强有力地驱动心室切片产生收缩7本文详细描述了这些iSABs的生成方案。

<table><tbody><tr><td>含稳定谷氨酰胺的伊氏液态培养基</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0465</td><td></td></tr><tr><td>不含丙酮酸钠、含稳定谷氨酰胺的DMEM液态培养基</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0435</td><td></td></tr><tr><td>CLS IV型胶原酶，CLS IV</td><td>Biochrom AG</td><td>C4-22</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Biochrom AG</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>优质胎牛血清</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Biochrom AG</td><td>L 0473</td><td></td></tr><tr><td>G 418-BC 液体（即用型溶液），无菌</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2912</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯多通道移液管用试剂储液槽，60 mL，无菌</td><td>Brand</td><td>703409</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience,Inc.</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Xplorer/Xplorer plus 电子移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4861000155</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞滤筛 40 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Greiner BioOne</td><td>663102</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Phoenix Europe GmbH</td><td>LIF-250</td><td></td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>Roth</td><td>PX67.1</td><td></td></tr><tr><td>冷水鱼皮来源明胶</td><td>SigmaAldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>SigmaAldrich</td><td>M3148&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1-硫代甘油</td><td>SigmaAldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板（24孔）</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr></tbody></table>

基于es细胞编程结合myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

病态窦房结综合征的治疗依赖于人工起搏器。人工起搏器存在电池故障、感染等风险，且缺乏对激素的响应能力，整体治疗费用较高。由多能干细胞（PSCs）衍生的“生物起搏器”可能成为一种替代方案，但胚胎体（Embryoid Bodies, EBs）中起搏细胞的典型比例极低。本方案结合了小鼠PSCs的“正向编程”方法 通过 基于Myh6启动子的抗生素筛选与窦房结诱导因子TBX3。这将获得由一致的心肌细胞聚集体组成 &#62;80% 具有生理功能的起搏细胞。这些“诱导性窦房结样结构”（“iSABs”）可自发收缩，其频率达到前所未有的水平（400–500 次/分钟），与从小鼠心脏分离的窦房结细胞相当，并能够驱动小鼠心肌组织的节律性收缩。 离体使用所述方案可生成高纯度的窦房结单细胞，其 例如 可用于 体外 药物检测。此外，根据本方案生成的iSABs可能成为心脏组织工程中的关键步骤。

本方案所述的方法可从多能干细胞（PSCs）诱导生成跳动频率约为450次/分钟的诱导性起搏样细胞团（iSABs）（见视频），该频率接近小鼠心脏的跳动频率。在将iSABs解离后（步骤2.8.8），观察到的单个细胞呈现出窦房结细胞典型的形态特征（如纺锤形和蜘蛛状细胞），如图1所示。这些细胞高表达已知对窦房结功能至关重要的多种蛋白，包括超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（Hcn4）、连接蛋白45（Cx45）、连接蛋白30.2（Cx30.2）以及Myh6（图2A–C）。经药物处理后，iSAB来源的细胞表现出预期的反应行为：与窦房结细胞类似，起搏电流（funny current）通道阻断剂ZD7288（图3A）以及毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱（carbachol）（图3B）均显著降低iSAB来源细胞的跳动频率；而β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素则导致跳动频率升高（图3C）。
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本方案描述了如何从小鼠多能干细胞（PSC）生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3（TBX3）并结合心肌肌球蛋白重链（Myh6）启动子驱动的抗生素筛选，可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”（iSABs）中起搏细胞比例超过80%，表现出显著增高的搏动频率，并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.

基于ES细胞编程结合Myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成

“病态窦房结综合征”的治疗依赖于人工起搏器。此类装置存在电池失效和感染等风险。此外，……

本实验的总体目标是获得高纯度的窦房结细胞。首先通过改变培养基并制备悬滴，诱导细胞分化，形成特定大小的胚胎体。随后，将胚胎体接种于明胶包被的培养皿中，使其生长形成单层细胞层。随后开始抗生素筛选，只有心肌细胞能够存活。最后，将细胞层解离以获得快速搏动的单个窦房结细胞或小型窦房结样结构。最终，通过活细胞成像显示窦房结细胞具有较高的搏动频率。该方法的主要优势在于能够制备出高纯度的窦房结细胞，例如可用于药物测试。该方法有助于我们解答窦房结疾病领域中的关键问题，因为这些细胞将为我们揭示其潜在的机制。该技术将由我们的博士研究生 Julia Yung 在实验室中进行展示。实验起始于一种 ES 细胞系和多能干细胞，这些干细胞在分化程序开始前两天，按照文本方案所述，与经辐照的饲养细胞共同培养；首先吸除培养基，将 PSCs 从饲养细胞中分离出来。用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。然后加入 7 毫升胶原酶 IV 溶液，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。接着将一个无菌的 40 微米滤膜置于 50 毫升离心管中。然后用移液器将胶原酶溶液上下吹打五次，小心冲洗PSC集落。将细胞悬液转移至滤膜，并用八毫升PBS冲洗滤膜三次。随后将滤膜翻转，倒扣放入培养皿中，并在滤膜底部加入十毫升PBS。为去除PSC集落，现将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。G. 吸除PBS，将细胞重悬于1毫升Accutase中，于37°C孵育5分钟。孵育结束后，加入10毫升PBS。用移液器将细胞悬液上下吹打混匀五次，然后在300 × g条件下离心五分钟。去除PBS后，加入10毫升细胞培养基重悬细胞，测定接种细胞数量，以每平方厘米15,000个细胞的密度接种于75平方厘米的滤瓶中，在37°C、5% CO₂条件下培养两天，至细胞融合度达到50%至70%。根据文本方案收集细胞并重悬于分化培养基中后，向方形培养皿中加入20毫升水和5毫升悬滴（HD）溶液，以防止悬滴干燥。接下来，在托盘中用移液器吸取最多50毫升的细胞悬液。然后将培养皿的盖子翻转，使用12通道移液器将含有20微升细胞悬液的180个HDS分别加入盖子上的孔中。小心地将盖子翻转回来，并将其放回培养皿上。孵育两天后，待细胞形成拟胚体，小心翻转方形培养皿的皿盖，将两个培养皿中得到的拟胚体转移至一个50毫升离心管中。静置10分钟，使拟胚体沉降至管底，然后尽可能吸除上清培养基。加入10毫升分化培养基重悬拟胚体，并将悬液转移至一个10厘米培养皿中。按照文本方案，当细胞在悬浮培养中培养四天后，将 EBS 转移至一个明胶包被的 10 平方厘米细胞培养皿中，并在接下来的 2 至 6 天内于显微镜下培养。在细胞开始搏动后的第三天，观察搏动灶以及细胞层的形成情况，吸除培养基，然后加入 10 毫升新鲜分化培养基，其中含有 400 微克/毫升的 G418。四天后，小心移除培养基，注意不要吸走细胞层。然后加入 10 毫升 PBS 洗涤细胞。小心移除 PBS 后，加入 10 毫升 4 型胶原酶溶液，将细胞转移至 50 毫升离心管中。接着，在 37°C 条件下孵育 5 分钟后，通过移液器上下吹打 10 次剧烈混匀细胞悬液，并将细胞在 37°C 下继续孵育额外 5 分钟。应出现含有小细胞簇的悬浮液。随后加入 20 毫升 PBS，以 300 × g 离心 10 分钟。小心吸除 PBS，若需诱导生成窦房结样结构（sabs），则加入含 400 微克/毫升 G418 的分化培养基 12 毫升，重悬细胞后将 2 毫升细胞悬液分别接种至 24 孔明胶包被板的 6 个孔中，以获得单个结样细胞，而非加入分化培养基。去除 PBS 后，使用 5 mL Accutase 悬浮细胞，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。反复吹打以充分混匀。在 37 °C 下孵育 5 分钟后，混匀细胞悬液。加入 20 毫升 PBS，以 12 毫升分化培养基在 300 × g 条件下离心 5 分钟。重悬细胞后，将细胞悬液以每孔 2 毫升接种至 24 孔明胶包被培养板的 6 个孔中，然后根据文本方案对细胞进行分析。通过本视频展示的方案，可从多能干细胞生成具有起搏功能的窦房结样细胞（isab S），其搏动频率约为每分钟450次，如图中所示为解离后的isab S细胞。观察到的单个细胞呈现出窦房结细胞典型的形态特征，包括纺锤形和蜘蛛状细胞。这些细胞高表达对窦房结功能至关重要的多种蛋白，例如超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）、连接蛋白45（CX45）、连接蛋白30.2（CX30.2）以及MYH6。当使用通道阻滞剂 ZD 7288 或毒蕈碱受体激动剂卡巴可（caracol）处理时，由 isab 获得的细胞表现出显著降低的搏动频率。而β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素（isoprene）则导致搏动频率升高。总体而言，我们的技术将为深入理解心脏起搏功能及其相关疾病奠定基础。观看本视频后，您应充分了解如何从多能干细胞生成完全功能性的窦房结细胞。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

基于ES-Cell的编程组合MYH6启动子，选择小鼠心脏起搏器细胞聚集一代

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。...

通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

本文介绍了一种利用逆转录病毒介导的多顺反子载体递送Gata4、Tbx5和Mef2c来生成诱导心肌样细胞（iCMs）的实验方案。该方案可获得相对均一的重编程细胞群体，且重编程效率和细胞质量得到提升，对今后iCM重编程的研究具有重要价值。...

利用表达最佳比例Gata4、Mef2c和Tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子...

利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本方法的目的是在体外生成心区特异的心脏前体细胞，以研究前体细胞的特化过程和功能特性，并生成心腔特异的心脏细胞用于心脏疾病建模。...

体外生成心脏区域特异性心脏前体细胞

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

学习利用小鼠多能干细胞通过抗生素筛选和悬滴培养法高效生成高纯度窦房结起搏细胞。该方法可产生超过80%纯度的功能性起搏细胞，用于心脏节律研究和药物测试。

基于ES细胞编程结合Myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成

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