基于ES细胞编程结合Myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成
2015年2月17日
本方案描述了如何从小鼠多能干细胞（PSC）生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3（TBX3）并结合心肌肌球蛋白重链（Myh6）启动子驱动的抗生素筛选，可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”（iSABs）中起搏细胞比例超过80%，表现出显著增高的搏动频率，并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.
本实验的总体目标是生成高纯度的窦房结细胞。首先通过改变培养基并制备悬滴，诱导细胞分化，形成特定大小的胚胎体。随后，将胚胎体接种于明胶包被的培养皿中，使其贴壁并形成单层细胞层。
随后开始抗生素筛选，只有心肌细胞能够存活。最后，将细胞层解离以获得快速搏动的单个窦房结细胞或小型窦房结样结构。最终，通过活细胞成像显示窦房结细胞具有较高的搏动频率。
该方法的主要优势在于能够制备出高纯度的窦房结细胞，例如可用于药物测试。该方法有助于我们解答窦房结疾病领域中的关键问题，因为这些细胞将为我们揭示其潜在的机制。该技术将由本实验室的博士研究生 Julia Yung 进行演示，她开发了该方法。实验起始于胚胎干细胞系和多能干细胞，这些细胞在分化程序开始前两天，按照文本方案所述，与经辐照的饲养细胞共同培养；首先吸除培养基，将多能干细胞从饲养细胞中分离出来。
用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。然后加入 7 毫升 IV 型胶原酶溶液，在 37 摄氏度孵育 10 分钟。接着将一个无菌的 40 微米滤膜置于 50 毫升离心管中。
然后用移液器将胶原酶溶液上下吹打五次，小心冲洗PSC集落。将细胞悬液转移至滤膜，并用八毫升PBS冲洗滤膜三次。随后将滤膜翻转，倒扣于培养皿中，并在滤膜底部加入十毫升PBS。
为去除PSC集落，现将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。G. 吸除PBS，将细胞重悬于1毫升Accutase中，于37 °C孵育5分钟。孵育结束后，加入10毫升PBS。
用移液器上下吹打细胞悬液五次，然后以300 × g离心五分钟。吸除PBS后，加入10毫升细胞培养基重悬细胞，测定接种细胞数量，以每平方厘米15,000个细胞的密度接种于75平方厘米的滤瓶中，在37°C、5% CO₂条件下培养两天，至细胞融合度达到50%–70%。按照文本方案收集细胞并重悬于分化培养基后，向方形培养皿中加入20毫升水和5毫升悬滴（hanging drop, HD）溶液，以防止悬滴干燥。
接下来，在托盘中用移液器吸取最多50毫升的细胞悬液。然后将培养皿的盖子翻转，使用12通道移液器将含有20微升细胞悬液的180个HDS分别加入盖子上的孔中。小心地将盖子翻转回来，并将其放回培养皿上。
孵育两天后，待细胞形成拟胚体，小心翻转方形培养皿的皿盖，将两个培养皿中得到的拟胚体转移至一个50毫升离心管中。静置10分钟，使拟胚体沉降至管底，然后尽可能吸除上清培养基。加入10毫升分化培养基重悬拟胚体，并将悬液转移至一个10厘米培养皿中。
按照文本方案，当细胞在悬浮培养中培养四天后，将 EBS 转移至一个明胶包被的 10 平方厘米细胞培养皿中，并在接下来的 2 至 6 天内于显微镜下培养。在细胞开始搏动后的第三天，观察搏动灶以及细胞层的形成情况，吸除培养基，加入 10 毫升新鲜分化培养基，其中含有 400 微克/毫升的 G418。四天后，小心移除培养基，注意不要吸走细胞层。
然后加入 10 毫升 PBS 洗涤细胞。小心移除 PBS 后，加入 10 毫升 4 型胶原酶溶液，将细胞转移至 50 毫升离心管中。接着，在 37°C 下孵育 5 分钟后，通过移液器上下吹打 10 次，剧烈混匀细胞悬液，并将细胞在 37°C 下继续孵育额外 5 分钟。
应出现含有小细胞簇的悬浮液。随后加入 20 毫升 PBS，以 300 × g 离心 10 分钟。小心吸除 PBS，若需诱导生成窦房结样结构（sabs），则加入含 400 微克/毫升 G418 的 12 毫升分化培养基，重悬细胞后将 2 毫升细胞悬液分别接种至 24 孔明胶包被板的 6 个孔中，以获得单个结样细胞，而非添加分化培养基。
吸除 PBS 后，加入 5 mL Accutase 重悬细胞，于 37 °C 孵育 5 分钟。反复吹打以充分混匀。在 37 °C 孵育 5 分钟后，混匀细胞悬液。
加入 20 毫升 PBS，以 12 毫升分化培养基在 300 × g 条件下离心 5 分钟。重悬细胞，每孔接种 2 毫升至 24 孔明胶包被板的 6 个孔中，然后根据文本方案对细胞进行分析。
通过本视频展示的方案，可从多能干细胞生成具有起搏功能的窦房结样细胞（isab S），其搏动频率约为每分钟450次，如图中窦房结样细胞解离后所示。观察到的单个细胞呈现出窦房结细胞典型的形态特征，包括纺锤形和蜘蛛状细胞。这些细胞高表达对窦房结功能至关重要的多种蛋白，例如超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）、连接蛋白45（CX45）、连接蛋白30.2（CX30.2）以及MYH6。
当使用通道阻滞剂 ZD 7288 或毒蕈碱受体激动剂 carbachol 处理时，由 isab 获得的细胞表现出显著降低的搏动频率。而β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素则导致搏动频率升高。总体而言，我们的技术将为深入理解心脏起搏功能及其相关疾病奠定基础。
观看本视频后，您应充分了解如何从多能干细胞生成完全功能性的窦房结细胞。
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概述
本方案描述了从小鼠多能干细胞中生成高纯度窦房结细胞的方法。该过程包括诱导分化、形成胚胎小体，以及通过抗生素处理筛选心肌细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏生物学
- 干细胞研究
- 细胞分化
背景
- 窦房结组织对心脏节律调节至关重要。
- 多能干细胞可分化为多种细胞类型。
- 抗生素筛选可提高目标细胞类型的纯度。
- 活细胞成像对于评估细胞功能至关重要。
研究目的
- 从PSC生成具有功能性的窦房结组织。
- 获得高纯度的起搏细胞。
- 证明这些细胞在体外刺激心肌组织产生节律的能力。
使用的方法
- 通过培养基修饰诱导细胞分化。
- 利用悬滴法形成胚胎体。
- 将胚胎体接种于明胶包被的培养皿中。
- 抗生素筛选以分离心肌细胞。
主要结果
- 生成含有超过80%起搏细胞的“诱导性窦房结样结构”。
- 观察到所生成细胞的搏动频率增加。
- 证实iSABs具有在体外起搏心肌组织的能力。
结论
- 该方案可成功生成高纯度的窦房结细胞。
- 细胞的高纯度和功能性对心脏研究至关重要。
- 该方法可推动心脏组织工程领域的研究进展。
常见问题
行业重要性概述
生成高纯度的小鼠起搏细胞聚集体，解决了心脏疾病建模和药物安全性筛选中的一个关键瓶颈。该方案能够规模化生产具有生理性搏动频率的功能性窦房结细胞，有助于对离子通道及自主神经调节剂的作用机制进行去风险化研究。这使得该方法成为心血管药物发现流程中临床前靶点验证和先导化合物优化的转化研究工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在受控条件下研究起搏细胞特异性离子通道及信号通路。
- 操作价值：提供可再生的、纯度超过80%的窦房结细胞，用于一致性的靶点结合检测。
- 预测价值：支持在体外对药物候选物在类原生起搏功能上的有效性进行功能验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成具有电活性的细胞聚集体，可重现窦房结的自律性和药物反应性。
- 操作价值：获得对变时性药物（如异丙肾上腺素、卡巴胆碱）有响应的细胞，可用于剂量-反应谱型分析。
- 检测适用性：支持基于活细胞成像的搏动频率检测，作为定量、实时的功能性指标。
转化与临床前研究
- 转化连续性：连接干细胞来源的起搏细胞生成与离体心肌起搏，验证其生理相关性。
- 临床前模型应用价值：支持窦房结功能障碍的疾病建模，以及基因或细胞治疗策略的评估。
- 机制性风险降低：通过在具有人类相关性的替代系统中进行自主神经和肾上腺素能刺激，评估致心律失常风险。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段的工作流程，可在进入临床前研究之前，通过功能性起搏细胞检测实现靶点验证和先导化合物的鉴定。
- 发现生物学：促进对窦房结特异性基因调控及电生理机制的假设验证。
- 筛选：提供标准化、可重复的细胞制备，用于离子通道和G蛋白偶联受体（GPCR）调节剂的分析表征。
- 分析：以搏动频率作为动态、实时的读出指标，用于评估化合物的变时性效应及自主神经调节作用。
- 转化研究：展示离体心肌起搏能力，支持向组织水平功能的外推。
- 企业级复用：建立可扩展的、基于分化的平台，用于持续开展心脏安全性和有效性筛选项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供高纯度、符合生理相关性的模型，减少起搏细胞功能机制上的模糊性。
- 操作价值：通过明确的分化与筛选步骤确保实验可重复性，实现跨实验室的标准化。
- 战略价值：通过早期获得针对调节心律化合物的功能性数据，改善候选药物的立项或终止决策。
- 项目组合影响：基于窦房结安全性与有效性特征，实现对候选化合物的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备干细胞培养、拟胚体形成以及基于抗生素筛选的专业技术。
- 依赖于明胶包被的培养表面、悬滴系统以及活细胞成像基础设施。
- 为获得稳定的心搏起搏细胞产量，需对分化培养基、G418浓度及处理时间进行标准化。
- 将小鼠实验方案应用于人类干细胞模型时，需考虑相应的适应性调整。
- 该方法的局限性在于需要进行离体验证，以确认起搏功能不仅存在于单细胞表型，还具备组织水平的起搏能力。
