基于ES-Cell的编程组合MYH6启动子，选择小鼠心脏起搏器细胞聚集一代

该程序的总体目标是产生高纯度的窦结节细胞。这是通过首先通过修饰培养基并制备悬滴来诱导细胞分化来实现的，从而形成确定大小的胚胎体。接下来，将胚胎体放在涂有明胶的培养皿上，以便它们形成细胞层。

然后开始抗生素选择，只有心肌细胞存活。最后，解离细胞层以获得快速跳动的单个窦房结细胞或小的窦房结体。最终，活细胞成像用于显示窦结细胞的高跳动频率。

这种方法的主要优点是您可以产生高纯度的窦结细胞，例如，用于药物测试。该方法可以帮助我们回答窦房结疾病的关键问题，因为细胞会让我们深入了解潜在的机制。该技术将由我们的博士生 Julia Yung 在实验室中介绍，她开发了该方法，从文本方案中概述的 ES 细胞系和多能干细胞开始，如文本方案中所述，在分化程序前两天通过首先吸出培养基从饲养细胞中去除 PSC。

使用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。然后加入 7 毫升胶原酶 4 溶液，将细胞在 10 摄氏度下孵育 37 分钟。接下来，将无菌 40 微米过滤器放入 50 毫升试管中。

然后通过上下移液胶原酶溶液五次，小心地冲洗 PSC 菌落。将细胞悬液转移到过滤器中，并使用 8 毫升 PBS 冲洗过滤器 3 次。然后将过滤器翻转过来，将其倒置在培养皿中，并在过滤器底部吸取 10 毫升 PBS。

要去除 PSC 集落，现在将细胞悬液转移到 15 mL 试管中，并以 300 次离心 5 分钟。G.去除 PBS，将细胞悬浮在 1 毫升 Accutane 中，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育后，加入 10 毫升 PBS。

通过上下吹打 5 次混合细胞溶液，并以 300 次 G 离心 5 分钟，去除 PBS 后，使用 10 毫升细胞培养培养基重悬细胞并确定细胞编号种子。每 15， 000 个细胞在 75 平方厘米的过滤瓶中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养两天，此时培养瓶应为 50至 70% 汇合。根据文本方案收获细胞和 Resus 悬浮在分化培养基中后，将 20 毫升水和 5 毫升悬滴液或 HD 溶液移液到二次培养皿中，以避免 HDS 变干。

接下来，在托盘中移液最多 50 毫升的细胞悬液。然后翻转培养皿的盖子，使用 12 通道移液器将 180 个 HDS 每个含有 20 微升细胞悬液的 HDS 放在盖子上。小心地翻转盖子，将其放在培养皿上。

孵育两天后让细胞形成 ebs，小心地翻转二次培养皿的盖子，并将来自两个培养皿的 EBS 转移到 50 毫升试管中。等待 10 分钟，让 EBS 沉降到试管底部，然后吸出尽可能多的培养基。使用 10 毫升分化培养基悬浮 EBS 并将悬浮液转移到 10 厘米培养皿中。

一旦细胞悬浮培养四天，根据文本方案，将 EBS 转移到一个涂有明胶的 10 平方厘米细胞培养皿中，并在接下来的 2 到 6 天内在显微镜下孵育，检查细胞的跳动病灶和细胞开始跳动三天后细胞层的形成， 吸出培养基并加入 10 mL 新鲜分化物。每毫升含有 400 μg G 4 的培养基 4 天后 18 到细胞中。小心地去除培养基，不要吸出细胞层。

然后加入 10 毫升 PBS 洗涤细胞。小心去除 PBS 后，加入 10 毫升胶原酶 4 溶液，并将细胞转移到 50 毫升试管中。接下来，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟后，通过上下吹打 10 次剧烈混合悬浮液，并在 37 摄氏度下再孵育细胞 5 分钟。

应存在小簇的悬浮液。然后加入 20 毫升 PBS，以 300 倍离心 10 分钟。G，小心吸出 PBS，如果产生诱导的窦房体或 sabs，使用 12 毫升分化培养基，每毫升含有 400 微克 G 4 18 复苏，悬浮细胞，并在 24 孔明胶包被板的 6 个孔上看到每毫升 2 毫升，以产生单个淋巴结细胞，而不是添加分化培养基。

去除 PBS 后，使用 5 毫升 Accutane 悬浮细胞并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。上下移液以用力。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟后混合悬浮液。

加入 20 mL PBS，以 300 倍 G 离心 5 分钟，分化 12 mL。含有 G 4 18.悬浮细胞，在 24 孔明胶包被板培养物的 6 个孔中各观察 2 毫升，并根据文本方案进行细胞分析。

使用本视频中演示的方案，可以从多能干细胞中产生 isab S，跳动频率约为每分钟 450 次，如此处所示，在 isab S 解离后观察到的单细胞显示了窦房结细胞的典型形状，包括梭形细胞和蜘蛛细胞。这些细胞显示出对窦房结功能至关重要的蛋白质的高表达水平，如超极化激活的环核苷酸门控阳离子。通道 4、HCN 4、锥 4、5、锥 30.2 和 MYH 6。

当用通道阻滞剂 ZD 7 2 88 或毒蕈碱受体激动剂 caracol 处理时，isab 衍生细胞表现出显着降低的跳动频率。另一方面，β 肾上腺受体激动剂异戊二烯导致跳动频率升高。总体而言，我们的技术将为更好地了解心脏起搏器的功能和疾病铺平道路。

看完这个视频，你应该对如何从 PLU 强效干细胞生成功能齐全的窦结细胞有一个很好的了解。