使用高通量的在体外微流控系统开发口服多物种生物膜
2014年12月1日
此方法本文的目的是描述了使用微流体系统的为包含通常在人类龈上菌斑鉴定物种多品种生物膜的发展。方法描述生物膜结构，生物膜的可行性，以及一种方法来收获生物膜文化依赖或培养独立分析突出显示。
该程序的总体目标是创建具有成分代表性的多物种牙菌斑生物膜。在进行分析的同时，这是通过首先创建具有代表性的培养基和接种物来实现的。然后，在过夜孵育后，将接种物引入微流体芯片，在微通道内形成生物膜。
最后，对生物膜进行洗涤和染色，用于原位两种共聚焦激光扫描显微镜或落射荧光显微镜。与流通池等现有方法相比，该技术的主要优点是它是一个高通量系统，允许并行进行多个实验，同时使用更少的材料，不需要人工实验室介质。首先，在单独的 50 毫升塑料管中收集来自五名或更多志愿者的唾液样本。
将唾液样本拉入放置在冰上的单个塑料烧杯中。在此设置中避免使用玻璃烧杯，因为唾液生物聚合物往往会粘附在玻璃表面。接下来，向样品中添加 di thio threes 孔，直到其最终浓度为 2.5 毫摩尔。
将混合物在冰上搅拌 10 分钟。将所有物品拉入几个塑料管中。在 4 摄氏度的冷冻离心机中高速离心 30 分钟，以分离样品中的颗粒。
将唾液酸转移到新鲜、无菌的容器中，丢弃沉淀组分，从样品中制备无菌生长培养基。首先，用 3 倍体积的去离子水稀释无碎屑的样品。然后使用 0.22 微米低蛋白结合膜过滤器。
对唾液进行消毒，同时将过滤后的部分放在冰上冷藏。将灭菌后的溶液挤出并储存在零下 80 摄氏度，直到需要为止。在 50 毫升无菌塑料管中收集 5 名或更多志愿者的唾液样本。
将唾液样品拉入室温预灭菌塑料烧杯或 50 毫升试管中。加入灭菌的甘油，直至甘油达到 25%。达到 75% 的唾液混合物。
与通过过滤步骤去除污染物的生长培养基方案不同，无菌技术在这里很重要，以防止非口服特异性细菌或真菌的污染。混合唾液甘油溶液。将唾液甘油混合物分装，并将样品储存在零下 80 摄氏度，直到需要开始。
在室温下将样品接种到微芯片中之前，在工作台上为细菌阴性生长培养基和细菌阳性接种物接种样品之前，购买或制造具有类似于此处所示的微通道的微流体芯片。在进行主要实验之前，将每根试管涡旋 5 秒钟以混合，首先在微芯片出口储液器处添加 100 微升生长培养基。使用计算机控制泵开始中等透明流过微通道 2 分钟。
在室温下，目视检查每个通道以确保液体正确填充。将微芯片在室温下孵育 20 分钟。这将用生物聚合物支架覆盖微通道侧壁，生物膜在生长过程中将锚定在该支架上。
然后从出口储液罐中手动吸出或剩余介质，并将这些馏分转移，这些馏分现在将作为流体动力平衡负载到入口储液罐。生物聚合物支架沉积后，将 100 微升细菌阳性接种物添加到出口储液器中。将微芯片放在 37 摄氏度的热板上，开始中等剪切逆流。
从出口到入口 储液罐正好 6 秒钟。然后关闭泵，在 37 摄氏度的静态条件下孵育芯片 40 分钟，以促进细菌或真菌附着在微通道侧壁上。接下来，用移液管从出口储液器中取出并丢弃所有接种物，并通过添加 1 毫升无细菌生长培养基重新填充相同的储液器。
将微芯片在 37 摄氏度下在低剪切流速下孵育约 20 小时，以促进通道内生物膜在过夜生长时生长。从入口和出口储液槽中移出所有溶液。在入口储液槽处加入 100 μL PBS，并清洗微通道 20 分钟。
在从入口到出口的低透明正向流下，生物膜现在可以进行活死细胞染色。在生物膜染色之前，为每个要染色的通道准备 100 微升文本方案中的活性染色混合物。保护此溶液免受光照，直到需要对生物膜进行染色，从入口吸出所有剩余液体，然后用 100 微升活力染色混合物重新填充同一储液器。
然后将染色溶液推入微通道 45 分钟。在室温下低份额流下，请务必保护芯片免受光照。从进样口储液器中吸出所有剩余液体，并重新填充 100 微升 PBS。
在室温下以低份额流速洗涤微通道 20 分钟，以去除多余的未结合染料。染色的生物膜现在已准备好进行荧光显微镜检查，以检测生物膜的三维结构。使用共聚焦显微镜进行水平扫描的数字重建可用于从任何倾斜角度观察整体薄膜结构。
此外，活死细胞染色分析可以应用于相同的数据数据集，以研究生物膜内细胞活力的空间依赖性作为不同化学处理的函数。一旦生物膜成像，就可以从未染色通道中提取细胞。使用在高剪切流下运行的蒸馏水，然后可以通过 4 5 4 pyro 测序从基因组 DNA 中鉴定生物膜菌群。
遵循此过程。可以执行其他方法，例如添加不同的物种或化合物，以回答不同的问题，例如在各种条件下多物种生物膜会发生什么。
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概述
本方法论文描述了一个微流控系统，该系统专为开发能模拟人类牙龈上菌斑的多物种生物膜而设计。该研究强调了用于分析生物膜结构、活力和收集进行进一步分析的技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 生物膜研究
- 牙科微生物学
背景
- 生物膜是复杂的微生物群落。
- 人类牙菌斑是生物膜的常见例子。
- 了解生物膜的形成对牙齿健康至关重要。
- 当前研究生物膜的方法存在局限性。
研究目的
- 创建代表性的多物种牙菌斑生物膜。
- 开发用于生物膜分析的高通量系统。
- 改进研究生物膜活力和结构的方法。
使用的方法
- 从志愿者处收集唾液样本。
- 准备代表性培养基和接种物。
- 将接种物引入微流控芯片中。
- 使用显微镜技术对生物膜进行染色和成像。
主要结果
- 在微通道内成功形成生物膜。
- 高通量能力允许进行多次实验。
- 与传统方法相比，材料使用量减少。
- 原位成像提供了生物膜结构的洞察。
结论
- 该微流控系统是生物膜研究的有效工具。
- 该方法增强了对牙菌斑生物膜的理解。
- 未来的研究可以利用这种方法进行各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic systems for multi-species oral biofilm development enable pharmaceutical R&D teams to model complex, disease-relevant microbial communities under physiologically relevant conditions. This approach supports predictive confidence in early-stage anti-biofilm compound screening and informs target validation for oral health therapeutics. The system's scalability and use of natural human saliva enhance translational continuity from discovery to preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community dynamics and therapeutic hypothesis testing in a controlled, human-relevant environment.
- Supports biological de-risking by modeling in vivo-like biofilm complexity for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in identifying anti-biofilm targets and mechanisms relevant to oral disease.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multi-species biofilm systems for robust compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs through confocal imaging and viability assays.
- Enables high-throughput, parallel experimentation with reduced material requirements and increased assay scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant oral microbiota for translational biomarker studies.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting genomic and architectural analyses.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical candidate selection for oral health interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic biofilm system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification and mechanistic de-risking for oral therapeutics.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by modeling native oral biofilm communities.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible biofilm systems with quantitative imaging and viability readouts.
- Analytics: Provides 3D architectural and viability data to compare compound effects across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease relevance through use of pooled human saliva and multi-species communities.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse oral biofilm research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation for anti-biofilm strategies.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in oral health portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oral biofilm-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, oral microbiology, and advanced imaging techniques.
- Needs access to confocal microscopy and genomic analysis infrastructure for comprehensive outputs.
- Demands rigorous cross-team standardization for saliva collection, biofilm growth, and data analysis.
- Adaptation across different microbial communities or disease models may require protocol optimization.
- Limitations include current throughput of imaging and the complexity of multi-species data interpretation.
