Name: 考试多巴胺快速与动态快速扫描循环伏安法在口内呈味物质管理清醒大鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习使用快速扫描循环伏安法在清醒自由活动大鼠中测量口内呈味物质诱发的亚秒级多巴胺释放。该技术可实时记录伏隔核神经递质动态，为研究奖赏与动机行为的神经化学基础提供重要方法。

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本研究工作得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（RJW）以及美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所和美国食品药品监督管理局烟草产品中心（CTP）的支持，项目编号为P50DA036151（EJN和NAA）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并经耶鲁大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1）术前准备
<ol>
	<li>口服溶液制备
	<ol>
		<li>配制10%蔗糖和0.005% L-薄荷醇的去离子水溶液（pH 7.4）。将这些溶液储存于密闭容器中，室温保存，并每2周重新配制一次，以防止降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极校准溶液
	<ol>
		<li>配制 Tris 缓冲液（pH 7.4），可在校准前任意时间进行。该溶液包含 12.0 mM Tris-HCl、140 mM NaCl、3.25 mM KCl、1.20 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4、1.20 mM MgCl22，以及 2.00 mM Na2SO4.</li>
		<li>配制10 mM多巴胺（DA；盐酸多巴胺）的储备液，溶剂为0.1 M高氯酸。高氯酸有助于防止多巴胺氧化。将该储备液储存于-20 °C，可使用长达6个月。将DA储备液分装成多个 aliquot 储存，每个 aliquot 仅使用一次。</li>
		<li>从10 mM DA母液中，用Tris缓冲液稀释成1 μM、500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM和31.25 nM的溶液。</li>
		<li>用于pH校准，配制pH为7.2、7.3、7.5和7.6的Tris缓冲液溶液。这将提供可模拟在实验过程中可能发生的pH变化的溶液 体内 实验</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极制备
	<ol>
		<li>通过真空抽吸，将一根T-650碳纤维（直径7 μm）吸入硼硅酸盐玻璃毛细管（长度10 mm，外径0.6 mm，内径0.4 mm）中。</li>
		<li>将装有碳纤维的玻璃毛细管放入垂直电极拉制仪中。初始参数设置为加热器温度55.0，关闭磁铁。但由于不同实验室的加热器和磁铁参数存在差异，可能需要进一步优化。 
		注意：电极长度应至少为5.5 cm（包含锥形部分），以便能够顺利安装至显微操作仪中，并可插入大鼠脑部硬脑膜下至少6.9 mm。若电极过短，则无法记录伏隔核腹侧区域的信号。另一方面，电极总长度不应超过6.5 cm，否则将因过长而无法适配显微操作仪。</li>
		<li>使用光学显微镜切割暴露的碳纤维，使其超出玻璃管末端75–100 μm。确认玻璃电极与碳纤维之间形成非常紧密、几乎难以分辨的密封，以确保后续记录过程中噪声最小。若玻璃管出现任何可见裂纹，或密封松动（表明密封不良），则弃用该电极。更详细的说明请参见[12]和[13]。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将电极安装到显微操作器中
	<ol>
		<li>获取一根3英寸、30G的针头&#160;使用一根长度一半绝缘的导线，用小刷子将一层薄薄的银漆直接涂在导线裸露部分。涂抹银漆后，立即将导线插入电极顶部的孔中，以实现与碳纤维的物理和电学连接。在显微镜下确认银导线与碳纤维接触良好。</li>
		<li>使用热缩管将银丝电极固定在显微操作器上。</li>
		<li>将制备好的碳纤维电极放入纯化的异丙醇（IPA）中至少10分钟，以清洁电极表面并提高后续对多巴胺的检测灵敏度。在IPA中浸泡后，用自来水冲洗碳纤维以去除残留的IPA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参比电极制备
	<ol>
		<li>取一根13 mm的银丝，其末端带有约6 mm长的Ag/AgCl网状结构（银丝全长7 mm，网状部分6 mm，直径0.4 mm），将银丝部分剪短至原长度的一半左右，并将银丝端焊接至金针上。</li>
		<li>在引脚的焊料上涂抹环氧树脂。</li>
		<li>将银/氯化银网状端浸入5%聚四氟乙烯与全氟-3,6-二氧杂-4-甲基-7-辛烯磺酸共聚物中5次，每次间隔30分钟&#160;每次浸渍之间的空气干燥时间</li>
		<li>让包被的Ag/AgCl网在室温下过夜晾干。</li>
		<li>在 120 ºC 烤箱中固化 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
&#160;2) 口内手术与颅内套管植入手术联合操作（约75分钟）
<ol>
	<li>口腔导管制作
	<ol>
		<li>制备口腔导管，并至少在手术前10天通过环氧乙烷灭菌法进行灭菌。</li>
		<li>将PE 100导管切成6 cm长的节段。</li>
		<li>使用电烙铁熔化PE导管的一端，立即压紧于固体表面以冷却PE导管。结果应在PE导管一端形成一个小的扁平圆盘，且不应有翻边。使用针头（18 G）或图钉在该圆盘中心打孔。</li>
		<li>在PE导管的另一端，将18 G针头的钝端紧密插入管内。</li>
		<li>使用标准纸打孔器，从聚四氟乙烯片材（厚度3.18 mm，直径6 mm）上冲出多个圆形片，制成聚四氟乙烯垫圈。</li>
		<li>在垫圈中心打孔。取连接在PE导管上的针头，将其完全穿过垫圈。针头穿过之后，将垫圈滑至PE导管底部，使其紧贴导管末端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>口腔手术
	<ol>
		<li>在对手术器械、套管（在灭菌前修剪至基座下方2.5 mm）和参考电极进行灭菌后，通过腹腔注射给予大鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。
		<ol>
			<li>5分钟后，施加有害刺激测试（足部或尾部夹捏）以评估麻醉深度。如果动物对有害刺激测试出现任何身体反应（如抽搐反应、呼吸或心率增加），则追加原剂量10%至15%的氯胺酮，并重复上述有害刺激测试流程。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>当大鼠完全麻醉且对有害刺激测试无反应时，使用动物毛发剪剃除从眼睛到耳后约2 mm范围内的毛发。然后将大鼠置于薄型循环水加热垫上以维持术中体温。涂抹眼用润滑剂。在进行任何切口及插入口腔套管前，通过腹腔注射给予非甾体抗炎药（NSAID）卡洛芬（5 mg/kg）。全程采用无菌操作技术。</li>
		<li>先用聚维酮碘消毒，再用70%乙醇清洁皮肤，重复3次。</li>
		<li>将大鼠仰卧放置，使用无菌棉签打开口腔，找到第一上臼齿。</li>
		<li>将针头插入颊部与第一上臼齿之间的组织，直至针头从耳后稍内侧穿出皮肤。</li>
		<li>刺穿皮肤，使PE导管随之穿出皮肤并可被触及。</li>
		<li>向上牵拉套管（仅握持套管本身而非针头），并将聚四氟乙烯垫圈固定在臼齿之间，以确保导管位置稳定。 
		注：将垫圈切成梯形，并使其平面朝向颊侧紧贴臼齿，可使此步骤更易操作。</li>
		<li>取另一聚四氟乙烯垫圈，将其套在暴露的针头上，沿塑料导管向下滑动，直至紧贴切口处。</li>
		<li>为固定聚四氟乙烯垫圈，使用灭菌胶带制作一个三角形&#34;旗标&#34;，防止垫圈上滑。将垫圈固定于大鼠皮肤及灭菌胶带上。</li>
		<li>剪断暴露的导管，使其在大鼠头部上方保留2–4 cm长度。</li>
		<li>对口腔另一侧重复步骤2.2.1至2.2.10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于伏安法的颅内手术
	<ol>
		<li>将大鼠固定于立体定位仪中，采用两步清洗法清洁其头皮（先用聚维酮碘擦拭，再用70%乙醇擦拭，重复3个循环）。</li>
		<li>使用灭菌尖头镊子和手术剪剪除一块15 × 15 mm大小的头皮组织。</li>
		<li>使用灭菌棉签轻轻清洁颅骨表面。进一步滴加2至3滴3%过氧化氢清洁颅骨。</li>
		<li>使用立体定位钻在颅骨上钻3个小型孔（直径1 mm），用于后续植入螺钉；另钻1孔用于引导套管，1孔用于刺激电极，1孔用于参考电极。</li>
		<li>若需记录伏隔核（NAc）核心区域信号，将引导套管定位在前囟前1.2 mm、旁侧1.4 mm处。降低套管装置，直至其塑料基座与颅骨表面平齐。</li>
		<li>将灭菌的参考电极置于与引导套管对侧的大脑半球，将其下放至硬脑膜下方约2 mm处。</li>
		<li>将刺激电极定位在前囟后5.2 mm、旁侧1.0 mm处，并下放至硬脑膜下方8.0 mm，以靶向腹侧被盖区（VTA）。</li>
		<li>使用灭菌的小型外科螺丝刀将螺钉固定于颅骨。随后插入参考电极、刺激电极和引导套管。最后使用颅骨塑形水泥固定所有组件。</li>
		<li>术后48小时内，通过皮下注射给予非甾体抗炎药（NSAID）卡洛芬（5 mg/kg）。术后至少恢复1周，方可进行伏安法记录。
		<ol>
			<li>在术后护理期间，每日用水冲洗口腔导管。术后前2天提供浸水软化的食物，以帮助动物咀嚼和进食。&#160;每日监测动物是否出现疼痛或应激迹象（如轻度感染或脱水），并根据需要采取适当干预措施（包括补液、局部使用消毒剂，和/或皮下注射5 mg/kg卡洛芬）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3) 在清醒自由活动大鼠中进行伏安法记录
<ol>
	<li>降低电极并采集多巴胺训练数据集
	<ol>
		<li>实验当天，通过灌注200 μl水并观察口面部反应来检查口腔套管的通畅性（以确认大鼠能尝到水）。</li>
		<li>将FSCV探头通过刺激电极（位于探头上）插入大鼠的双极刺激电极套管（位于大鼠上）的方式固定在大鼠身上。因此，探头（微型电流-电压转换器）直接连接至双极刺激电极。</li>
		<li>移除套管装置中的假性套管，并向套管内加入两滴50%肝素溶液。然后轻轻插入一根稍长于先前移除的假性套管的假性套管，以清除可能形成的血凝块或胶质瘢痕，这些物质会损坏后续实验中将要插入的碳纤维电极。用于清除血凝块的套管应延伸至颅骨下方3-4 mm处（至少位于记录位点上方2 mm）。</li>
		<li>将带有电极的显微操作仪插入导向套管，并将欧米伽环置于 &#34;锁定&#34; 位置。</li>
		<li>将参考电极导线从前置放大器连接到相应的引脚，然后将微操纵器上的工作电极导线连接到前置放大器上的相应导线。</li>
		<li>将电极降至颅骨下方约 4-4.5 mm 处。</li>
		<li>使用恒电位仪施加三角波形（400 V/s，-0.4 至 +1.3 V）。以 60 Hz 的频率将该波形施加于电极，持续至少 10 分钟，随后将波形施加频率改为 10 Hz，用于后续实验记录。 
		注意：60 Hz波形应用步骤可产生稳定的碳纤维表面，并有助于防止电漂移</li>
		<li>使用不同频率（10 至 60 Hz）、脉冲数（10 至 30 个脉冲）和电流强度（50 至 150 μA），以 2 ms/相的脉宽对腹侧被盖区（VTA）施加电刺激，以诱发不同浓度的多巴胺（DA）释放和 pH 值变化。至少采集 5 种不同浓度的 DA 释放信号和 5 种不同的 pH 值变化。等待（2 - 3 分钟）&#160;刺激之间需留出足够时间（至少）以允许囊泡重新装载[14]。 
		注意：必须获得能够产生多巴胺（DA）浓度的刺激，其范围应覆盖后续实验中将采集的全部浓度区间，因为这些数据将用作主成分分析的训练集（见第5.1节）。</li>
		<li>将电极插入伏隔核核心（尾状核下6.3 mm处）。随后以100 μm为步长逐步降低电极在伏隔核核心内的位置，直至观察到多巴胺瞬时释放事件的频率至少为每分钟1次。</li>
		<li>连接内径为1/32英寸的管路&#34;，外径 3/32&#34;将溶液连接至一个20 ml注射器，并将注射器安装到注射泵上。在管路的另一端，使用斜面23 G针头将管路与大鼠的套管连接。确保管路内完全充满所需的味觉刺激物，并确认管路中无任何气泡。 
		注意：通常在记录开始前，先向大鼠口腔内给予少量呈味物质，以确保记录时的首次灌注能够输送完整的灌注量，而非管路中残留的水或空气。此外，这可使动物在记录前对呈味物质有一定接触经验，因为即使是具有食欲促进作用的新型呈味物质，也可能因其新颖性而在初期产生厌恶反应。</li>
		<li>数据采集时，使用泵和前述管路系统，以6.5秒时间注入200 μl的味觉刺激物。每1-3分钟注入一次，每种味觉刺激物共注入25次。每次注入提供200 μl溶液。</li>
		<li>若在单次实验中递送多种味觉刺激物，在采集完一种味觉刺激物的数据后，需用水冲洗口腔导管，并等待至少20分钟&#160;在注入新的味觉刺激物之前。</li>
		<li>在多巴胺记录结束后，为进行组织学验证，需在记录位点制造一个小的损伤标记。为了保存碳纤维电极以供后续校准，首先回撤电极并移除显微操作器。然后使用一个新的显微操作器，装配玻璃微电极和钨丝（钨丝伸出玻璃尖端100 μm），将其插入至与原始碳纤维微电极相同的深度（硬脑膜下方）。</li>
		<li>为进行组织学验证，通过在钨丝上施加3 V电压，并以每10秒增加1 V的幅度逐级升高电压，直至达到10 V，从而形成一个小的损伤灶。</li>
		<li>如果已使用多个碳纤维电极建立了标准浓度曲线，则直接对碳纤维电极施加电位，执行上述损毁步骤（3.1.14）。 
		注意：该损伤方法将破坏碳纤维，导致无法使用该特定电极进行后续校准。</li>
		<li>使用戊巴比妥钠（150 mg/kg，腹腔注射）对动物实施安乐死。</li>
		<li>使用镊子垂直向上拉动头帽，将带有套管的头帽取下。切勿旋转头帽，以免对脑组织造成不必要的损伤，并增加组织学检测时确定电极位置的难度。
		<ol>
			<li>取出脑组织，置于4%甲醛中固定3天，随后置于30%蔗糖溶液中1周。使用冷冻切片机切成30 μm切片，将切片贴附于盖玻片上，于光学显微镜下观察，以确定碳纤维或钨电极损伤的位置。 
			注：3.1.17 步骤中灌注为可选操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4) 电极校准
<ol>
	<li>利用流动池建立电流-浓度转换系数。
	<ol>
		<li>为了确定电极的灵敏度，每次实验后需使用流动法校准电极 &#34;T细胞&#34; 装置。将电极缓缓下放至 &#34;T细胞&#34; 当以2 ml/min的流速将Tris缓冲液、pH溶液或DA溶液冲洗电极表面时，使用六通道空气电磁阀驱动装置在缓冲液与pH溶液或DA溶液之间来回切换。</li>
		<li>每次校准过程中，先施加5秒Tris缓冲液（基线），随后施加5秒pH或DA溶液，再施加20秒Tris缓冲液，共采集30秒的伏安数据。每种校准标准浓度重复运行3次，并对不同浓度标准进行交叉平衡。</li>
		<li>每次样品采集时，测量DA或pH诱导的峰值电流。对每次试验的峰值电流取平均值，以获得浓度与峰值电流的关系。更详细的说明请参见[12]和[13]。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5）数据分析
<ol>
	<li>在主成分分析（PCA）中使用训练集 
	注意：在伏安法实验过程中，输出信号表现为电流，该电流来源于多巴胺的氧化与还原、pH 变化以及电化学噪声。PCA 可将这些因素分离，从而提取出目标组分（DA 和 pH），并去除可能干扰目标信号的其他组分（更详细的描述参见15, 16）。
	<ol>
		<li>在 PCA 分析后，为输出电流分配一个校准因子（约为 5–10 nA/μM），以便确定分析物的浓度值。</li>
		<li>利用实验过程中获得的训练集对 PCA 模型进行&#34;训练&#34;，以分离 DA、pH 及其他因素。PCA 会采用训练集中的循环伏安图（在 3.1.8 节中采集）来确定伏安图中哪些关键特征可用于识别在 in vivo 伏安记录过程中采集的每种分析物。</li>
		<li>为确定应保留的主成分数量，使用马林诺夫斯基 F 检验（Malinowski F-test）。通常仅保留 2 或 3 个主成分，这些主成分通常可解释数据中约 95–99% 的方差。有关马林诺夫斯基 F 检验实施的进一步讨论，请参见17。 
		注意：一旦确定主成分数量，PCA 分析将有效地把来自 DA 和 pH 训练集的实测伏安图投影到所保留的主成分上。结果得到一个经过滤波的数据集，其中仅保留 DA（或 pH）相关数据，而与 DA 或 pH 不相似的残余信号则被去除（参见“代表性结果”部分以了解预期输出）。有关将 PCA 用于伏安分析的更详细解释及逐步操作说明，请参见材料表及16, 17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+mediates+dynamic+shifts+in+dopamine+signaling+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens.</a> Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholamines+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+reciprocally+respond+to+reward+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion.</a> Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Wheeler, R. A., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroscience+of+pleasure.+Focus+on+%27Ventral+pallidum+firing+codes+hedonic+reward%3A+when+a+bad+taste+turns+good%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good.</a> J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).</li>
<li>Bunin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+and+uptake+rates+of+5-hydroxytryptamine+in+the+dorsal+raphe+and+substantia+nigra+reticulata+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain.</a> J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).</li>
<li>Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+electrochemical+measurements+of+oxygen+and+dopamine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo.</a> Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).</li>
<li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+evaluating+the+reinforcing+properties+of+tastants+in+laboratory+rats%3A+operant+intraoral+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration.</a> J Vis Exp. (84), e50956(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

口腔内呈味物质递送与快速扫描循环伏安法（FSCV）相结合，可实现对口腔风味物质引发的“实时”多巴胺（DA）反应的分析。该实验方案中有三个关键步骤，对于成功检测DA至关重要。首先，口腔导管的正确植入是确保风味物质有效递送的关键。应将导管插入第一磨牙后方并牢固楔入到位，以防止导管堵塞或被动物意外拔出。术后恢复的最初几天内定期冲洗导管也非常重要，因为在术后前两到三天内给予动物的软质食物可能堵塞导管。其次，电极质量对于提高自由活动大鼠实验中的信噪比至关重要。在某些情况下，即使电极在视觉上看似质量良好、状态完好，仍可能产生噪声信号。解决此问题的一种方法是在背侧纹状体（硬脑膜下4 mm）进行基线记录测试。若电极噪声过大，可在将电极移至伏隔核（NAc）核心区记录位点（硬脑膜下6–7 mm）开展实验前，将其取出并更换为新电极。第三个关键步骤是在目标脑区内找到合适的记录位点，要求在此处能够以足够频率（至少每分钟1次）观察到自发的多巴胺释放事件（“瞬时信号”），且多巴胺浓度升高幅度足够明显（至少20 nM至40 nM）。通过该优化过程，可在给予风味物质之前确认特定位置存在可检测的自发性多相多巴胺释放事件。以相当于暴露的碳纤维尺寸（50–100 µm）的步长...

Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

阶段性多巴胺释放对介导奖赏导向行为具有重要作用 [1-3]然而，分离并研究初级奖赏如何改变多巴胺（DA）的时相性释放常常受到伴随行为或认知过程的干扰，这些过程本身也能够改变时相性DA释放，例如决策过程或为获取奖赏而进行的奖赏导向性运动行为。在本研究中，我们通过使用味觉刺激物来分离对味觉刺激的时相性DA反应 体内 快速扫描循环伏安法（FSCV）结合经口内套管递送味觉刺激物。该技术可绕过选择与行为过程，使我们能够在将味觉刺激物直接灌注至大鼠腭部时，检测细胞外多巴胺（DA）的释放。
FSCV 是一种具有高时间分辨率和空间分辨率的电化学技术，能够在亚秒级时间尺度（10 Hz 分辨率）上对局部微小区域（约 100 µm）内的多巴胺（DA）释放进行测量。将口腔内给药与 FSCV 相结合，能够实时观察到对味觉刺激物产生的快速多巴胺反应，而这种动态过程无法通过传统的微透析方法进行检测。此外，多巴胺在对奖赏或与奖赏相关线索刺激下的瞬时释放浓度通常在 20–100 nM 之间，高于 FSCV 的 10–20 nM 检测阈值[4]。FSCV 的高空间分辨率还允许对脑内较小区域的亚区（如伏隔核核心区，NAc）进行信号记录。因此，将 FSCV 与口腔内味觉刺激物灌注相结合，是研究味觉刺激或其他刺激如何改变清醒、自由活动动物中瞬时多巴胺释放的理想模型。事实上，这些技术已支持了多项研究，用于探究奖赏性和厌恶性味觉刺激如何调节细胞外多巴胺的释放[5]。
在过去十年中，快速扫描循环伏安法（FSCV）分析已成功结合静脉给药[6]和大鼠自我给药范式[7, 8]，用于揭示成瘾模型中多巴胺（DA）瞬时释放机制的作用。此外，结合经口给药与FSCV技术已被用于研究与可卡因可获得性配对的味觉刺激如何调节瞬时DA释放以及反映情绪效应的行为反应[3]。这种结合经口给药与FSCV的方法还可有力地用于研究烟草制品和可溶性烟草产品中添加的香料（如薄荷醇和口服甜味剂）所引发的瞬时DA反应[9-11]。尽管添加到烟草制品中的许多香料具有增强食欲的特性[9-11]，但尚不清楚这些香料是否以符合奖赏性享乐价值的方式增强瞬时DA释放。事实上，添加到香烟和可溶性烟草产品中的香料可能对DA奖赏系统产生直接影响，并可能通过多巴胺能机制作用，从而影响香烟及其他烟草产品的奖赏价值。因此，结合经口给药与FSCV技术可为理解香料如何调节快速DA释放提供新的视角。联合使用经口给药与in vivo FSCV方法及其研究所得数据，还可促进未来研究进一步阐明香料与尼古丁如何相互作用以改变DA信号传导，并可能调节尼古丁的强化效应。此外，此类研究获得的数据还可为有关烟草制品香料的监管决策提供科学依据。

<table><tbody><tr><td>刺激电极</td><td>PlasticsOne</td><td>MS303/2-A/SPC</td><td>订购时，请注明基座下方22 mm处切割</td></tr><tr><td>电极套管</td><td>BioAnalytical Systems</td><td>MD-2251</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>A-M systems</td><td>624503</td><td></td></tr><tr><td>碳纤维</td><td>Thornel</td><td>T650</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Narishige International</td><td>PE-22</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/" target="_blank"&gt;Neurolog 刺激隔离器&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://digitimer.com" target="_blank"&gt;Digitimer Ltd.&lt;/a&gt;</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds4-bi-phasic-stimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS4&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>热缩管</td><td>3M</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>电极用绝缘导线</td><td>Squires electronics</td><td>Custom</td><td>L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>伊利诺伊大学芝加哥分校，工程机械车间</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>ITW Devcon</td><td>14250</td><td>“5分钟环氧树脂”</td></tr><tr><td>全氟-3,6-二氧杂-4-甲基-7-辛烯磺酸与四氟乙烯的共聚物</td><td>Ion Power</td><td>LQ-1105</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Nafion</td></tr><tr><td>银漆</td><td>GC Electronics</td><td>22-023</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>BK Precision</td><td>9110</td><td></td></tr><tr><td>口腔内导管用管路</td><td>Intramedic</td><td>427426</td><td>PE 100，内径 = 0.86 mm；外径 = 1.52 mm</td></tr><tr><td>口腔内输注用管路</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-587-1A</td><td>内径 1/32"；外径 3/32"</td></tr><tr><td>流体池用注射泵</td><td>Pump Systems Inc.</td><td>NE 1000</td><td></td></tr><tr><td>外科水泥</td><td>Dentsply Caulk</td><td>675571 和 675572</td><td></td></tr><tr><td>气动执行器</td><td>VICI</td><td>A60</td><td>6位数字阀接口</td></tr><tr><td>数字阀接口</td><td>VICI</td><td>DVI</td><td>230 VAC</td></tr><tr><td>四通道前置放大器</td><td>北卡罗来纳大学，电子设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UEI 电源</td><td>北卡罗来纳大学，电子设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UEI 接线盒</td><td>北卡罗来纳大学，电子设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>味觉刺激物注射泵电源</td><td>Med Associates</td><td>SG-504</td><td></td></tr><tr><td>味觉刺激物注射泵</td><td>Med Associates</td><td>PHM-107</td><td></td></tr><tr><td>钨微电极</td><td>MicroProbes</td><td>WE30030.5A3</td><td></td></tr><tr><td>带AgCl的银丝参比电极</td><td>InVivo Metric</td><td>E255A</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>80497</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>高氯酸</td><td>Sigma</td><td>244252</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（4 M）</td><td>Sigma</td><td>54435</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>306576</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多巴胺</td><td>Sigma</td><td>H8502</td><td></td></tr><tr><td>TarHeel HDCV 软件</td><td>北卡罗来纳大学教堂山分校</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.chem.unc.edu/facilities/index.html?display=electronics&amp;amp;content=software&amp;amp;software_id=2" target="_blank"&gt;需申请软件：点击此处访问软件申请页面&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

清醒大鼠经口给予味觉刺激物期间利用快速扫描循环伏安法检测多巴胺快速动态变化

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

快速、时相性多巴胺（DA）释放在中国台湾哺乳动物大脑中对奖赏处理、强化学习及动机调控具有关键作用。快速扫描循环伏安法（FSCV）是一种具有高空间和时间分辨率（亚秒级）的电化学技术，已被用于在多种实验体系中研究时相性DA释放。 体外 单细胞和脑切片实验 体内 在麻醉啮齿类动物中进行的实验已被用于鉴定在正常条件及疾病模型下介导多巴胺释放与摄取的机制。在过去20年中， 体内 清醒自由活动啮齿类动物中的FSCV实验也揭示了多巴胺能机制在奖赏处理和奖赏学习中的作用。清醒自由活动实验体系的一个主要优势在于能够检测与特定行为事件或奖赏/线索呈现时间同步的快速多巴胺（DA）浓度波动。然而，行为学与伏安法联合实验的一个局限性在于，难以将特异性针对初级奖赏或厌恶刺激的DA效应，与同时发生的、介导奖赏导向行为或其他运动行为的DA波动区分开来。本文描述了一种联合方法，结合 体内 清醒大鼠中采用FSCV结合口腔内灌注直接研究多巴胺对口腔味觉刺激物的反应。在这些实验中，口腔味觉刺激物被直接灌注至大鼠腭部——绕过奖赏导向行为和自主饮水行为——从而可直接检测多巴胺对味觉刺激物的反应。

采用快速扫描循环伏安法（FSCV）结合口腔内导管植入技术，研究了蔗糖这一奖赏性味觉刺激物对伏隔核（NAc）核心区域多巴胺（DA）时相性释放的调节作用。在味觉刺激物灌注前，对腹侧被盖区（VTA）施加电刺激（150 µA，60 Hz，24个脉冲；以红色条形表示），可在伏隔核中引发显著的时相性多巴胺释放增加（图1）。图1展示了一个彩色图谱，其中纵轴表示电位，横轴表示时间，电流（以伪彩色表示）作为z轴。彩色图谱下方为多巴胺浓度随时间变化的曲线。该浓度-时间曲线是通过提取多巴胺氧化电位（由白色虚线标示）处的电流-时间轨迹，并经电极校准后转换为浓度值得到的。此多巴胺浓度-时间曲线被用作主成分分析（PCA）训练集的一部分。
在获取训练集后，每隔1-3分钟给予25次蔗糖输注（10%，每次200 µl）。蔗糖对阶段性多巴胺（DA）释放调节作用的示例如图2和图3所示。在图2中，持续6.5秒的输注（以红色条带表示）在DA的氧化电位（以白色虚线表示）处引起电流升高（以白色...

细胞外多巴胺（DA）的快速波动介导了哺乳动物的奖赏处理和动机行为。本文描述了快速扫描循环伏安法（FSCV）与口腔内呈味物质给予相结合的方法，用于研究呈味物质如何改变清醒自由活动大鼠中多巴胺的快速释放。

快速、时相性多巴胺（DA）释放对哺乳动物大脑中的奖赏处理、强化学习和动机调控具有关键作用。

本实验的总体目标是测量对高浓度口腔味觉刺激的亚秒级多巴胺反应。首先，制备用于手术及后续通过快速扫描循环伏安遥测技术进行记录所需的口腔导管、参考电极和碳纤维电极。第二步是通过外科手术将口腔导管、颅内电极以及碳纤维电极的导向套管植入体内。一周后，可将碳纤维微电极插入伏隔核，以记录在经口给予味觉刺激时细胞外多巴胺释放的变化。记录完成后的最后一步是校准电极，并采用主成分分析法分离出包含多巴胺信息的数据。最终，结合经口味觉给予与快速扫描循环伏安遥测技术，用于揭示多巴胺在亚秒级时间尺度上对味觉刺激的响应变化。与现有方法相比，这种联合技术主要有两个优势：第一，快速循环伏安光度法具有很高的时间分辨率；第二，通过口腔内递送taten可最大限度减少大鼠为获取tatin所需做出的动作，从而帮助我们更准确地分离出多巴胺对tatin的响应。通常，初次接触该方法的研究人员在制备口腔导管时会遇到困难。然而，制作一个合适且经过加固的口腔导管，可确保导管紧密贴合于颊部与上部磨牙之间，从而提高实验成功的可能性。首先准备记录电极：将一根直径为七微米的 T650 碳纤维吸入内径为 0.4 毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管中。接着，将毛细管置于垂直电极拉制仪中，初始设置加热器温度为 55.0，磁体关闭，进行初步拉制，随后根据需要进行调整。在显微镜下拉制移液管后，剪切暴露的碳纤维，使其超出玻璃管末端75至100微米。碳纤维在玻璃管内必须密封紧密，否则应弃用该制备样品。接下来，剥离一段3英寸长、30号线规导线的一半绝缘层，并使用热缩管将电极固定在显微操作器上。当银漆仍处于湿润状态时，在导线上涂抹一层薄薄的银漆。将导线插入电极的开口端，并将其固定在其中的碳纤维上。在显微镜下验证此接触是否良好。使用显微操作器夹持电极，并用热缩管固定。将制备好的碳纤维电极放入异丙醇（IPA）中至少10分钟，以清洁电极表面并提高后续对多巴胺的检测灵敏度。从异丙醇中取出电极后，用自来水冲洗碳纤维，以去除残留的异丙醇。接下来，使用一根13毫米长的银丝制备参比电极，该银丝一端带有直径为0.4毫米、尺寸为6毫米的银/氯化银网格；剪去银丝上无网格的部分，并将其焊接至一枚金针上。然后在焊点处涂覆环氧树脂。随后将网格部分浸入共聚物酸中五次。最后一次浸渍后，每次浸渍之间在空气中干燥30分钟。然后让其过夜晾干。第二天。将金属丝的网状部分在 120 摄氏度下烘烤一小时。制作口腔导管时，先将聚乙烯 100 导管切成六厘米长的段。然后，将其中一段管子的末端熔化，并在圆盘中心将其压在平坦的冷却表面上，形成一个小型扁平圆片。使用18号针头打一个孔。将管段的另一端连接到18号针头的钝端。然后使用打孔器制备数个直径为6毫米、厚度为3.18毫米的聚四氟乙烯圆片。接着在这些圆片的中心位置打孔，使其成为垫圈状。将垫圈切割成梯形，以利于在磨牙植入过程中固定。为完成导管制备，将连接聚乙烯（PE）导管的针头完全穿过垫圈，并将垫圈沿导管滑至与之齐平。以下实验步骤约需75分钟完成。从一只已做好手术准备的大鼠开始，使用棉签打开其口腔。然后将套管针的针头插入颊部与第一上臼齿之间的组织，使针头刚好从耳后内侧穿出。接着向上移动套管，将垫圈固定在臼齿上，以稳定导管并使其紧贴暴露的针头。套上另一个垫圈，并将其紧贴切口处。将此垫圈固定到位。修剪导管，使其在大鼠头部上方露出 2 至 4 厘米。然后采用相同技术，将导管插入另一侧口腔。随后，将大鼠放入立体定位仪框架中，并钻三个孔用于插入股管和电极，以在伏隔核核心区域进行记录。引导股管位于前囟前方1.2毫米，外侧1.4毫米处。将套管装置缓慢下移，直至其塑料基座与颅骨表面平齐。将参考电极置于与引导套管对侧的半球。将参考电极下移约两毫米，至硬脑膜下方。然后将刺激电极置于耳廓后方5.2毫米、外侧1.0毫米处，以定位腹侧被盖区。将刺激电极下降至硬脑膜下8.0毫米处。然后用螺钉和粘固剂固定组件，并进行术后护理。在开展实验前，务必通过注入 200 µL 水来验证口腔套管的通畅性，并观察大鼠是否尝到水；通过移除假性套管、向其中加入两滴 50% 肝素，然后轻轻重新放置，以清洁记录位点。假性套管距离记录位点不得超过 2 毫米。现在将头戴装置连接并固定到植入VTA的刺激器上，然后将记录电极缓慢下降至伏隔核核心区域。随后按照文本协议生成训练数据集。每次刺激之间务必等待至少两分钟，最长可达四到五分钟，以允许囊泡重新装填。实验中最关键的步骤是获得高质量的电极。如果背景在上升阶段呈现特征性的圆润形状，则表明电极为优质。如果圆润形状较小或与施加的波形非常相似，则应尝试更换另一种电极。如果背景电位发生偏移，则以0.1伏为增量，向正方向对施加的波形应用偏移校正。在记录位点生成训练集后，每隔1至3分钟注入200微升的塔藤（taten）脉冲溶液，共进行25次注入。随后等待至少30分钟，再以相同方式注入下一种味觉刺激物。采用FSCV结合口腔内导管植入技术，研究蔗糖在给药前如何调节伏隔核核心区域的阶段性多巴胺释放。VTA给予电刺激（以红色竖线表示）在训练完成后，可在伏隔核核心区域引发显著的阶段性多巴胺释放增加。持续6.5秒、体积为200 µL的蔗糖灌注（以红色竖线表示）引起电流升高，如白色箭头所示。该信号出现在多巴胺的氧化电位处，即白色虚线所标示的位置。将数据转换为浓度-时间曲线后，通过主成分分析（PCA）验证，确认味觉刺激引发的电流增加源于多巴胺浓度的升高。在伏隔核核心进行FSCV记录期间，另一种塔亭（tatin）薄荷醇灌注也观察到多巴胺浓度升高。一旦掌握，这种联合的经口内和套管手术可在75分钟内完成。该技术可与其他行为范式结合使用，例如竞争性和厌恶性经典条件反射和操作性条件反射，以探究在这些过程中亚秒级多巴胺信号传递的相关问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

考试多巴胺快速与动态快速扫描循环伏安法在口内呈味物质管理清醒大鼠

利用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中电刺激诱发的突触前多巴胺动态变化。...

采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化

本视频展示了在麻醉大鼠中植入电极和套管，以使用恒电位仪测量伏隔核中的多巴胺释放，并通过向腹侧被盖区输注药物来调节多巴胺能活性。...

通过VTA多巴胺能神经元受体操控的大鼠模型监测多巴胺释放

本研究评估了一种用于检测可口溶液对实验大鼠强化效应的新方法：口腔内自我给药。为此，在连续比率和递增比率强化程序下，测量了大鼠对不同浓度甜溶液进行口腔内输注的操作式反应（即 按压杠杆）行为。...

一种评估实验大鼠味觉物质强化特性的新方法：操作性经口内自我给药

本研究的目的是通过建立一种可靠的免疫组织化学技术，利用细胞c-fos激活来检测大鼠首次摄入脂肪和糖后多巴胺通路及其终末位点的同步变化，从而鉴定与奖赏相关的分布式脑网络。...

大鼠初次摄入糖和脂肪后从中脑边缘和中脑皮层多巴胺奖赏区域同时检测c-Fos激活

快速扫描循环伏安法可用于在药物、疾病及其他实验干预条件下监测体内多巴胺神经传递。本研究介绍了QNsim1.0软件的使用方法，该软件基于定量神经生物学模型，用于模拟电刺激诱导的多巴胺反应，以量化估算多巴胺的释放与再摄取动力学参数。...

使用 QNsim1.0 对电刺激多巴胺神经传递的快速扫描循环伏安法数据进行建模

突触体多巴胺摄取与高效液相色谱分析是研究小鼠多巴胺稳态的实验工具，分别用于评估多巴胺转运体功能和纹状体组织中多巴胺水平。本文中，我们提供了测定多巴胺组织含量及评估多巴胺转运体功能的实验方案。...

利用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠多巴胺能稳态

本文详细介绍了利用碳纤维电极和酶法生物传感器技术进行固定电位安培记录，以在雌性仓鼠自然奖赏行为期间高时间分辨率地测量多巴胺和谷氨酸的释放。...

测量雌性叙利亚仓鼠在自然奖赏行为期间细胞外神经递质的体内变化

本实验方案的目的是直接操控腹侧被盖区受体，以研究其对次秒级多巴胺释放的贡献。...

联合灌注与刺激结合快速扫描循环伏安法（CIS-FSCV）评估腹侧被盖区受体对时相性多巴胺的调控

我们提出了一种新的正电子发射断层成像（PET）方法，用于捕捉香烟吸烟引起的多巴胺波动。受试者在PET扫描仪内进行吸烟。通过lp-ntPET对动态PET图像进行逐体素的时间建模，该模型包含一个随时间变化的多巴胺项。结果生成了吸烟过程中纹状体内多巴胺波动的“动态影像”。...

利用lp-ntPET技术生成短时多巴胺波动的动态图像：香烟吸烟过程中的多巴胺动态影像

本文描述了用于从小鼠脑内进行在体电生理记录脑信号的微型驱动装置的设计与组装方法。通过将微电极束固定在坚固且可驱动的载体上，这些技术可实现长期且稳定的神经信号记录。该装置的轻量化设计使得动物在植入驱动装置后仍能不受限制地完成各种行为学任务。...

用于清醒行为小鼠慢性神经记录的微驱动阵列构建

学习使用快速扫描循环伏安法在清醒自由活动大鼠中测量口内呈味物质诱发的亚秒级多巴胺释放。该技术可实时记录伏隔核神经递质动态，为研究奖赏与动机行为的神经化学基础提供重要方法。

清醒大鼠经口给予味觉刺激物期间利用快速扫描循环伏安法检测多巴胺快速动态变化

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