对于肿瘤基质相互作用的三维共培养模式
February 2nd, 2015
在这里，我们提出了一种在三维中共培养的方案，这对于研究癌细胞行为的多细胞相互作用和细胞外基质依赖性调节很有用。在这个实验模型中，癌细胞在包埋了人癌症相关成纤维细胞的胶原凝胶上培养。
该程序的总体目标是以三维共培养方法研究肺癌细胞和癌症相关成纤维细胞之间的细胞相互作用。这是通过从收集的肺组织中原代培养人肺癌相关成纤维细胞来实现的，这些成纤维细胞被切成 1 毫米大小的块。第二步是通过使用胰蛋白酶眼细胞混合胶原蛋白溶液来制备包埋成纤维细胞的胶原蛋白凝胶，并转移到六孔板中进行凝胶化。
接下来，将肺腺癌细胞接种到每个凝胶的表面，以制备癌细胞和成纤维细胞的维度共培养物，并将凝胶从孔边缘分离以产生漂浮培养物。最后一步是将收缩的凝胶置于位于六孔板中的网片上，将收缩的凝胶暴露于空气中，进行气液界面培养和侵袭测定。最终，组织学检查用于评估癌细胞侵袭和形态学变化。
与二维单层培养等现有方法相比，该程序的主要优点是可以在条件的三维培养中研究多细胞相互作用。该程序从收集的肺组织中成纤维细胞的原代培养开始，如文本方案中所述和引用。在本视频中，使用小鼠肺代替人肺癌组织。
将肺组织样品放在没有培养基的 10 厘米组织培养皿上。使用无菌镊子和手术刀将组织切成约 1 毫米大小的小段在此过程中，避免使切片干燥，否则会损害细胞生长的效率。将小的肺组织切片彼此分开放置，以保持每块周围有空白区域。
使用手术刀刀片在组织培养皿的表面划伤。或者，组织块的覆盖增强了几次传代后细胞生长和细胞增殖的功效。首先将硅脂放在两个点上，每个孔相距 1.5 厘米。
接下来，将切碎的纸巾块分别放在每个纸巾块的中心。然后，使用硅脂将盖玻片贴在板的表面。在组织切片变干之前，轻轻地将培养基加入培养皿或六孔板中。
有效的细胞生长在很大程度上丢失。如果样品变干，请勿过快地倒入培养基，以免组织切片脱落以形成胶原凝胶。用 1 x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤成纤维细胞，并加入 tryin one 以在胰蛋白酶化后分离生长的细胞约 5 分钟。
在 37 摄氏度下，使用补充有 10% FBS 的 9 毫升 DMEM 分离细胞，将悬浮在培养基中的细胞收集在 10 毫升试管中，并以 200 至 300 倍 G 离心以形成细胞沉淀。复苏。将所得沉淀以每毫升五十万个细胞的密度悬浮在 100% FBS 中。在制备胶原蛋白凝胶之前，将用于胶原蛋白凝胶制备的试剂、移液管和试管在冰箱中冷却。
接下来，通过在 FBS 1 型 A 型胶原蛋白 5 X-D-M-E-M 中混合成纤维细胞悬浮液来制备胶原蛋白凝胶，并用力移液管重组缓冲液，以确保混合物均匀，避免在移液过程中产生气泡。然后将 3 毫升混合物加入六孔板的每个孔中，并在 37 摄氏度的培养箱中无干扰地糊化 30 至 60 分钟，以便在胶原凝胶 Resus 上培养癌细胞。将癌细胞悬浮在 3D 共培养基中，密度为 1 倍 10 至第 5 个细胞/毫升。
将 2 毫升重悬的 A 5 49 肺腺癌细胞溶液稀释到每块凝胶的表面。根据实验条件修改共培养中癌细胞或成纤维细胞的细胞数以进行凝胶收缩。将凝胶在 37 摄氏度下孵育过夜，以便癌细胞可以粘附在胶原凝胶上。
然后分离每个并在每个孔中生成漂浮的培养物。在六孔板中，每两到三天用一个倾斜的 21 号针头或小刮刀将每个凝胶从孔边缘分离。用 2 毫升 3D 共培养基刷新孔。
每天测量每块凝胶的大小，持续五天。最后，参见胶原蛋白凝胶分析的文本方案。在 37 摄氏度下培养胶原蛋白凝胶 5 天后。
将收缩的凝胶放在网上，使其暴露在空气中。在新的六孔板中，使用用于流式细胞术的市售细胞过滤器制成网状细胞。用 11 毫升 3D 共培养物轻轻填充每个孔。中等。
使用无菌勺将凝胶放在网片上，并在这种情况下从凝胶中去除任何剩余的培养基。凝胶浸没在培养基中，而凝胶的上表面暴露在空气中。将此培养条件定义为气液界面。
这种模拟肿瘤微环境的共培养方法是研究癌细胞与胶原凝胶中嵌入的成纤维细胞之间相互作用的有用工具。将 A 5 49 细胞共培养在包埋成纤维细胞的胶原凝胶上，并将 5 49 个细胞的层置于空气中，方法是将凝胶放在培养基中的网眼上。此处显示的是放置在孔中的网状物上的凝胶的代表性图片，该孔是含有血红蛋白、toin 和 eoin 的六孔板组织学分析。
三维培养凝胶横截面的染色显示 5 49 个细胞侵入嵌入肺癌相关成纤维细胞的胶原凝胶。按照此程序，可以执行其他方法，如基因表达或敲低，以回答其他问题，例如肿瘤风暴相互作用中的特定基因功能。
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概览
该协议概述了一种三维共培养方法，用于研究肺癌细胞和癌症相关成纤维细胞之间的相互作用。该模型利用胶原蛋白凝胶来促进对细胞外基质对癌细胞行为的影响的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 癌症研究
背景
- 理解多细胞相互作用在癌症研究中至关重要。
- 癌症相关成纤维细胞在肿瘤微环境中发挥重要作用。
- 三维培养比传统的二维培养更能模拟体内条件。
- 胶原蛋白凝胶为细胞生长和相互作用提供支持性基质。
研究目的
- 调查肺癌细胞与成纤维细胞之间的相互作用。
- 评估细胞外基质对癌细胞行为的影响。
- 开发可靠的共培养模型用于未来的癌症研究。
使用的方法
- 从肺组织中初次培养人肺癌相关成纤维细胞。
- 制备嵌入成纤维细胞的胶原蛋白凝胶。
- 将肺腺癌细胞接种在胶原蛋白凝胶上。
- 进行气液界面培养和侵袭性测定。
主要结果
- 成功建立了三维共培养模型。
- 组织学检查显示癌细胞侵袭和形态变化。
- 展示了成纤维细胞对癌细胞行为的影响。
- 提供了细胞外基质在癌症进展中作用的见解。
结论
- 三维共培养模型对于研究癌细胞-成纤维细胞相互作用是有效的。
- 研究结果突出了细胞外基质在癌症生物学中的重要性。
- 该模型可用于进一步研究癌症治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
Three-dimensional co-culture models that incorporate cancer-associated fibroblasts (CAFs) and tumor cells in a collagen matrix address a critical gap in recapitulating the tumor microenvironment for oncology drug discovery. This system enables more predictive interrogation of tumor-stromal interactions, supporting mechanistic de-risking and translational continuity from early discovery through preclinical research. Enhanced physiological relevance improves confidence in target validation and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of tumor-stromal interactions in a physiologically relevant 3D context.
- Supports mechanistic de-risking by modeling ECM-dependent modulation of cancer cell behavior.
- Improves predictive confidence for target validation by capturing multicellular communication.
Screening & Assay Development
- Provides a validated platform for quantitative invasion and migration assays in a 3D environment.
- Facilitates assay standardization and reproducibility by enabling controlled co-culture conditions.
- Supports screening readiness for compounds targeting tumor-stroma interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling the tumor microenvironment more accurately than 2D cultures.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation for invasion and stromal modulation endpoints.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing translationally relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D co-culture model integrates into the oncology discovery continuum from early target validation through preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of tumor-stroma signaling and ECM remodeling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative invasion and migration readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables histological and morphological assessment of cancer cell invasion within a 3D matrix.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by modeling multicellular tumor microenvironments.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform adaptable for gene function, knockdown, or pathway interrogation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tumor biology studies.
- Operational Value: Standardizes 3D co-culture workflows for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and 3D matrix preparation.
- Needs access to histological analysis and imaging infrastructure for endpoint assessment.
- Demands cross-team standardization of cell sourcing, matrix composition, and assay conditions.
- Adaptable to various cancer and stromal cell types for broader disease modeling.
- Dependent on careful tissue handling to ensure fibroblast viability and outgrowth.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
Primary Culture of Human Lung Fibroblasts
3:35
Three-dimensional Co-culture of Human Lung Fibroblasts and Cancer Cells
6:27
Air-liquid Interface Culture and Invasion Assay
7:14
Results: Analysis of A549 Cells Co-cultured on a 3D Collagen Gel Embedded with Primary Cultures of Cancer-associated Fibroblasts
8:09
Conclusion
