三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

本实验的总体目标是通过三维共培养方法研究肺癌细胞与癌相关成纤维细胞之间的细胞相互作用。首先，从获取的肺组织中分离人源肺癌相关成纤维细胞，将组织剪碎至约1毫米大小，进行原代培养。第二步是制备嵌有成纤维细胞的胶原凝胶，通过将胶原溶液与胰蛋白酶消化后的细胞混合，转移至六孔板中使其凝固。

接下来将肺腺癌细胞接种到每种凝胶表面，以制备癌细胞与成纤维细胞的三维共培养体系，并将凝胶从孔壁边缘分离，形成悬浮培养。最后一步是通过将收缩后的凝胶置于六孔板中的网格上，使其暴露于空气-液体界面，从而进行气液界面培养及侵袭实验。最终通过组织学检查评估癌细胞的侵袭能力及形态学变化。

与现有的二维单层培养等方法相比，该方法的主要优势在于能够在三维培养条件下研究多细胞间的相互作用。本实验流程首先从获取的肺组织中进行成纤维细胞的原代培养，具体步骤如文本方案中所述并已引用相关文献。在本视频中，使用小鼠肺脏而非人肺癌组织。

将肺组织样本置于一个10厘米的组织培养皿中，不加培养基。使用无菌镊子和手术刀将组织切成约1毫米大小的小块。在此过程中，避免组织干燥，否则会影响细胞爬出的效率。将小块肺组织彼此分开放置，以确保每块周围留有空余区域。

使用手术刀片在组织培养皿表面划痕。或者，在多次传代后，组织块的覆盖可增强细胞迁移和细胞增殖的效果。首先，在每个孔中相距 1.5 厘米的两个位置放置硅脂。

接下来，将剪碎的组织块分别放置于每个孔的中央。然后使用硅脂将盖玻片固定在培养板表面。在组织切片干燥之前，轻轻向培养皿或六孔板中加入培养基。

大部分情况下，细胞的有效迁移生长能力会丧失。如果样本变干，切勿过快地加入培养基，以免组织切片脱落，影响胶原凝胶的形成。用一倍磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤成纤维细胞，然后加入胰蛋白酶作用约五分钟，以使迁移生长的细胞脱落。

在37摄氏度下，使用9毫升添加了10% FBS的DMEM培养基消化细胞，收集悬浮于培养基中的细胞至10毫升离心管中，并在200至300 ×g条件下离心以形成细胞沉淀。将所得沉淀重悬于100% FBS中，细胞密度为每毫升50万个细胞。在制备胶原凝胶前，将试剂、移液器和离心管置于冰箱中预冷。

接下来，通过将成纤维细胞悬液与胎牛血清、I型胶原蛋白、5倍DMEM以及重构缓冲液充分混合来制备胶原凝胶，使用移液器剧烈吹打以确保混合均匀，并在移液过程中避免产生气泡。然后将3毫升该混合液加入6孔板的每个孔中，在37摄氏度的培养箱中静置30至60分钟，使其不受干扰地凝固，用于后续在胶原凝胶上进行癌细胞培养。将癌细胞以每毫升1×10⁵个细胞的密度悬浮于3D共培养培养基中。

将重悬的 A549 肺腺癌细胞溶液各 2 毫升加入每块凝胶表面。根据实验条件，调整共培养体系中癌细胞或成纤维细胞的细胞数量，以进行凝胶收缩实验。将凝胶在 37 摄氏度下孵育过夜，使癌细胞能够黏附于胶原凝胶。

然后将每个凝胶分离，并在每孔中形成悬浮培养。使用六孔板，每隔两到三天用21号斜角针头或小刮刀将每个凝胶从孔壁边缘分离。每孔补充两毫升3D共培养基。

每天测量一次凝胶的尺寸，持续五天。最后，请参阅文本方案中的胶原凝胶分析步骤。在 37 摄氏度下培养胶原凝胶五天后。

将收缩的凝胶置于筛网上暴露于空气中。在新的六孔板中，使用市售的流式细胞术用细胞滤筛制作筛网。每孔轻轻加入11毫升3D共培养基。

使用无菌勺子将凝胶置于筛网上，并在此条件下去除凝胶上残留的任何培养基。凝胶浸没于培养基中，同时其上表面暴露于空气中。将此培养条件定义为空气-液体界面。

这种模拟肿瘤微环境的共培养方法是一种研究癌细胞与嵌入胶原凝胶中的成纤维细胞之间相互作用的有效工具。将A549细胞与嵌有成纤维细胞的胶原凝胶进行共培养，并通过将凝胶置于培养基中的网格上，使A549细胞层暴露于空气中。图中显示的是将凝胶放置在六孔板中网格上的代表性图像，用于苏木精-伊红染色的组织学分析。

对三维培养凝胶的横切面进行染色，显示出5 49细胞侵入了嵌有肺癌相关成纤维细胞的胶原凝胶。通过该方法，可进一步开展基因表达分析或基因敲低等其他实验，以探究特定基因在肿瘤与基质相互作用中的功能等科学问题。