原发性脑多巴胺能神经元的分离，培养和长期维持胚胎脑鼠类
February 19th, 2015
帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚不完全清楚。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。在这里，我们提出了一种优化的方案，可用于神经退行性变的体外建模。
该程序的目标是从啮齿动物腹侧中脑中有效地分离和培养原代神经元。这是通过首先解剖啮齿动物胚胎的中脑来完成的。第二步是小心隔离腹侧中脑。
接下来，必须解离神经元组织以产生单细胞悬液。最后一步是将小体积的原代神经元接种在盖玻片上，然后再将附着的细胞转移到 24 孔板中。最终，使用抗体和免疫荧光显微镜来识别培养物中的多巴胺能神经元。
中脑中的多巴胺能神经元参与多种功能，包括控制认知中的运动和情绪以及大脑的奖励分泌。他们还与神经和神经精神疾病有关，包括帕金森病、成瘾和精神分裂症。修复腹侧中脑的方法。
神经元培养可用于研究多巴胺能神经元的生理学和细胞特性，以及了解其退化的原因。在帕金森病等疾病的病程中。首先，准备盖玻片。
将它们在 70% 乙醇中煮沸至少 30 分钟，以去除任何油脂痕迹。然后高压灭菌盖玻片。将盖玻片转移到 24 孔板中，并向每个孔板中加入半毫升多元醇，全部加入 Athene。
让板在室温下孵育一小时。请注意，工作多元醇或 Athene 溶液的保质期为一个月。然后用每次洗涤半毫升水清洗盖玻片 3 次。
如果没有所有 3 次洗涤，培养的细胞将无法存活 24 小时。接下来，修复层粘连蛋白溶液。请务必先在冰上慢慢解冻。
然后将层粘连蛋白溶解在冷的 D-M-E-M-F 12 中，并立即使用。现在向每个孔中加入半毫升新鲜制备的工作层粘连蛋白溶液，让板在 37 摄氏度下孵育过夜。最后，在准备玻璃移液器时，我将它们的吸头抛光至正常尺寸的一半。
做一个腹部切口，露出子宫囊，用镊子切开子宫。将子宫转移到 100 毫米培养皿中的冰冷 HBSS 中，然后开始用镊子取出胚胎。将分离的胚胎转移到新的冷 HBSS 培养皿中。
现在在解剖显微镜下，准备在 10 倍放大倍率下进入腹侧中脑的这个位置。通过使用生物剪刀或镊子在峡部和头部和头部边界区域切割大脑来解剖 meas 和 cephalic di cephalic 边界区域。取出整个中脑后，在内侧背侧中脑上切开。
使用镊子去除脑膜。此步骤对于神经元培养的成功至关重要。非神经元细胞会在培养和条件下死亡，并对邻近神经元产生不利影响。
现在将中脑组织压平成蝴蝶形。用无菌刀片切掉每个翅膀的大约一半，留下腹侧中脑。将腹侧中脑转移到 15 毫升锥形管中的冰冷 HBSS 中。
然后继续解剖下一个胚胎过程，在一小时内尽可能多地解剖胚胎。胚胎在冰上放置一个多小时，细胞活力较差。为确保多巴胺能神经元的高活力，从解剖到铺板的时间不应超过一小时。
此外，去除脑膜对于神经元的生存至关重要。从腹侧中脑集合中取出 HBSS。然后加入一毫升温热的 0.05% tripsin A DTA，足够 12 块组织使用的溶液。
将组织在 37 摄氏度下孵育 5 到 10 分钟。在引擎盖下，将 tripsin A DTA 替换为 1 毫升去活剂。培养基轻轻膨胀以混合，然后去除去活培养基，但留下足够的培养基，以免丢弃解离的细胞。
接下来，用完全培养基洗涤组织两次，不要丢失细胞。现在加入 1 毫升完全培养基。然后用火焰抛光的移液管研磨组织，不要形成气泡，直到获得单细胞悬液。
大约 8 到 10 次传球就足够了。持续时间后，将 400 G 的细胞离心 5 分钟。去除培养基，将细胞重悬于 1 mL 完全培养基中。
移液细胞最多四次以获得悬浮液。首先对悬浮液中细胞的健康状况进行计数和评估。在血细胞仪上使用 triam 蓝色排除。
现在将细胞悬液调整为每微升 1500 个细胞。然后将灭菌的微量离心管盖转移到 100 毫米培养皿中。使用镊子将准备好的盖玻片放在盖子上。
不要清洗盖玻片，尽量不要让它们变干。将 100 微升悬浮液加载到每个盖玻片上。这种有点不寻常的方法提供了 90% 的培养活力，是成功的关键一步。
然后关闭培养皿，并在孵育后将其转移到培养箱中一小时，小心地将盖玻片和培养基转移到 24 孔板中，每个孔中含有 400 微升温至 37 摄氏度的完全培养基，然后孵育细胞过夜。最初的几个小时对 24 小时内的细胞存活最关键。向每个孔中轻轻加入半毫升完全培养基。
每两周一次。更换一半的介质。如果区域性变为黄色，则可以更快地执行半培养基更换，但更换仍然应该不频繁。
在这些情况下，多巴胺能神经元将存活六周以上。培养两周后，针对酪氨酸、羟化酶和神经元标志物的免疫组织化学显示 1% 的细胞是多巴胺能的。神经元投射在接种后 2 小时内出现。
在培养的第一天结束时，轴突和树突是可区分的。最终，神经元存活六周以上，并在此程序后显示出广泛的生长。可以进行其他方法，如病毒转导、免疫荧光或电生理学，以回答多巴胺能神经元的机制问题。
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概述
本文介绍了一种从啮齿动物腹侧中脑中分离和培养原代神经元的协议，这对于研究帕金森病中多巴胺能神经元的退化至关重要。该方法包括解剖、组织解离和神经元铺板，随后使用免疫荧光显微镜进行神经元鉴定。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经退行性变
背景
- 帕金森病涉及中脑多巴胺能神经元的退化。
- 这种退化的机制尚未完全理解。
- 体外模型对于研究神经生理学特性至关重要。
- 原代神经元培养可以提供对神经退行性变的见解。
研究目的
- 开发多巴胺能神经元培养的优化协议。
- 促进对这些神经元神经生理学特性的研究。
- 加深对帕金森病机制的理解。
使用的方法
- 啮齿动物胚胎中脑的解剖。
- 腹侧中脑的分离。
- 神经组织解离以创建单细胞悬液。
- 在盖玻片上铺板原代神经元并转移到24孔板中。
主要结果
- 成功分离和培养了原代多巴胺能神经元。
- 实施免疫荧光显微镜以鉴定神经元。
- 建立了一个可靠的体外模型用于研究神经退行性变。
- 在帕金森病研究中的潜在应用。
结论
- 该协议为研究中脑多巴胺能神经元提供了一个有价值的工具。
- 它增进了对神经退行性变所涉及的细胞机制的理解。
- 该方法可以帮助开发帕金森病的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and long-term culture of primary mesencephalic dopaminergic neurons enables mechanistic interrogation of neurodegeneration relevant to Parkinson’s disease and related disorders. This system provides a physiologically relevant platform for target validation, pathway analysis, and predictive de-risking in early discovery and preclinical neuroscience portfolios. Robust in vitro maintenance of these neurons supports translational continuity and risk-adjusted advancement of neurotherapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of therapeutic hypotheses in disease-relevant dopaminergic neurons.
- Supports mechanistic de-risking by allowing manipulation and observation of neuronal survival and degeneration.
- Facilitates functional target validation through quantitative and morphological readouts.
Screening & Assay Development
- Provides a validated neuronal system for compound screening and phenotypic assay development.
- Ensures reproducibility and standardization through optimized culture and identification protocols.
- Delivers quantitative outputs such as cell viability and neurite outgrowth for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant biology for translational biomarker exploration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting long-term neuronal maintenance.
- Reduces translational risk by modeling key aspects of dopaminergic neuron vulnerability and survival.
Pipeline & Workflow Integration
This primary neuron culture method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, lead identification, and mechanistic studies in neurodegeneration research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in dopaminergic neuron degeneration.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible cultures for compound and genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables quantitative measurement of neuronal survival, morphology, and marker expression.
- Translational Research: Supports alignment with disease mechanisms and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurobiology and neurodegeneration projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Standardizes neuronal culture and identification for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and neuronal culture techniques.
- Demands access to sterile tissue culture facilities and immunofluorescence microscopy.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dissection, plating, and identification protocols.
- Adaptation to other neuronal subtypes or species may require protocol optimization.
- Cell viability and culture success are highly time-sensitive and dependent on precise handling.
