从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

本实验的目的是高效分离并培养来自啮齿类动物腹侧中脑的原代神经元。首先解剖啮齿类动物胚胎的中脑，第二步是精细分离腹侧中脑。

接下来，需要将神经组织进行解离，以获得单细胞悬液。最后一步是在小体积中将原代神经元接种到盖玻片上，随后将已贴壁的细胞转移至24孔板中。最终，利用抗体和免疫荧光显微镜技术来鉴定培养物中的多巴胺能神经元。

中脑中的多巴胺能神经元参与多种功能，包括运动控制、认知过程中的情绪调节以及大脑的奖赏分泌功能。这些神经元还与多种神经及神经精神疾病相关，包括帕金森病、成瘾以及精神分裂症。修复腹侧中脑的方法。

神经元培养可用于研究多巴胺能神经元的生理学和细胞特性，以及了解其在帕金森病等疾病过程中退变的原因。首先，准备盖玻片。

用70%乙醇煮沸至少30分钟，以去除任何油脂残留。然后对盖玻片进行高压灭菌。将盖玻片转移至24孔板中，每孔加入0.5毫升聚氧乙烯醚。

将培养板在室温下孵育一小时。请注意，工作浓度的多元醇或Athene溶液的有效期为一个月。随后用0.5毫升水洗涤盖玻片，共洗涤三次。

若未完成全部三次洗涤，培养的细胞将无法存活24小时。接下来，修复层粘连蛋白溶液。务必先将其在冰上缓慢解冻。

然后将层粘连蛋白溶解于冷的D-M-E-M-F 12培养基中，并立即使用。现在向每个孔中加入0.5毫升新配制的工作浓度层粘连蛋白溶液，将培养板在37摄氏度下孵育过夜。最后，在准备玻璃移液管时，我将管尖抛光至其正常尺寸的一半。

进行腹部切口以暴露子宫囊，使用镊子将子宫游离。将子宫转移至盛有冰上预冷的HBSS的100毫米培养皿中，并开始用镊子取出胚胎。将分离的胚胎转移至另一含有冷HBSS的新培养皿中。

现在在解剖显微镜下，于10倍放大倍数下准备暴露腹侧中脑的该区域。使用手术剪或镊子，在峡部以及中脑与头侧弓的头侧边界区域剪开脑组织，以分离中脑和头侧弓。取出整个中脑后，在内侧背侧中脑进行剪切。

使用镊子去除软脑膜。此步骤对神经元培养的成功至关重要。非神经元细胞在培养条件下会死亡，并对邻近神经元产生不利的信号影响。

现在将中脑组织压平成蝴蝶形状。使用无菌刀片切去每侧翼部约一半，保留中脑腹侧部分。将中脑腹侧部分转移至含有冰冻HBSS的15毫升锥形管中。

随后继续解剖下一个胚胎，在一小时内尽可能处理多个胚胎。冰上保存超过一小时的胚胎，其细胞活力较差。为确保多巴胺能神经元具有较高的存活率，从解剖到接种的时间不应超过一小时。

此外，在通风橱下剥离脑膜对于神经元的存活至关重要。将收集到的腹侧中脑中的 HBSS 去除，然后加入 1 毫升温热的 0.05% 胰蛋白酶 A DTA 溶液，每 12 块组织需加入足量的溶液。

将组织在 37 °C 下孵育 5 至 10 分钟。在通风橱内，用 1 mL 去活化液替换胰蛋白酶 A DTA，轻轻吹打混匀，然后去除去活化液，但需保留足够液体，以免弃去解离的细胞。

接下来，用完全培养基洗涤组织两次，注意不要丢失细胞。然后加入一毫升完全培养基。接着用火焰抛光的移液管轻轻吹打组织，避免产生气泡，直至获得单细胞悬液。

大约传代八到十次即可。结束后，以 400 G 离心五分钟，弃去上清，将细胞重悬于一毫升完全培养基中。

用移液器将细胞吹打至多四次以获得单细胞悬液。开始使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板对悬液中的细胞进行计数并评估细胞活力。

现在将细胞悬液调整至每微升1500个细胞。然后将已灭菌的微量离心管盖转移至100毫米培养皿中。用镊子将准备好的盖玻片放置在管盖上。

不要清洗盖玻片，并尽量避免其干燥。将100 µL悬浮液加样至每张盖玻片上。这种略显非常规的方法可提供90%的细胞存活率，是实验成功的关键步骤。

然后盖上培养皿，将其转移至培养箱中孵育1小时。孵育后，小心地将带有培养基的盖玻片转移至24孔板中，每孔含有400 µL预热至37 °C的完全培养基，随后将细胞在37 °C孵育过夜。最初几个小时对细胞在24小时内的存活最为关键。轻柔地向每孔加入0.5 mL完全培养基。

每两周一次。更换一半培养基。如果培养液变黄，则可提前进行半量换液，但换液频率仍应保持较低。

在这些条件下，多巴胺能神经元可存活六周以上。培养两周后，针对酪氨酸羟化酶和神经元标记物的免疫组织化学结果显示，1%的细胞为多巴胺能神经元。神经元突起在接种后两小时内即开始出现。

培养第一天结束时，轴突和树突已可区分。按照此操作步骤，神经元最终可存活六周以上，并表现出广泛的突起生长。此外，还可进行病毒转导、免疫荧光或电生理学等其他方法，以探究多巴胺能神经元中的机制性问题。