Name: 原发性脑多巴胺能神经元的分离，培养和长期维持胚胎脑鼠类 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习从啮齿类动物胚胎腹侧中脑分离和培养原代多巴胺能神经元的方法，用于帕金森病神经退行性机制研究。该方案结合免疫荧光显微技术，为体外研究神经元生理特性及开发治疗策略提供可靠模型。

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本工作由伦敦帝国理工学院医学院脑科学系为 K.N.A. 提供的启动资金完成。

注意：动物的饲养和操作均遵循机构指南，所有动物实验程序均经帝国理工学院动物福利与伦理审查委员会（AWERB）、英国内政部以及哈佛大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合联邦和州级法规要求。
1. 试剂与仪器准备
<ol>
	<li>在 –80 ºC 下解冻、分装并储存 1 mg/ml&#160;层粘连蛋白（Laminin）溶液。将 2 µl 溶解于 1 ml DMEM/F12 中，得到 1–2 µg/cm2 的包被浓度。 
	注意：应在冰上缓慢解冻层粘连蛋白，并用预冷的 DMEM/F12 溶解后立即加入培养板或盖玻片中。</li>
	<li>将 75 ml 的 0.01% 多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-ornithine）溶液用 425 ml PBS 稀释，4 ºC 保存。 
	注意：工作液的有效期最长为一个月。</li>
	<li>将 25%（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA）溶于 PBS（pH 7.4）中，4 ºC 保存，最长可保存一年。</li>
	<li>制备含 50% FBS（HBSS 中）的灭活培养基。</li>
	<li>向 DMEM/F12 中加入 50 U/ml 青霉素和链霉素、1× N2 添加剂、5%（vol/vol）FBS、0.36% D-(+)-葡萄糖（wt/vol）、0.25% BSA（wt/vol），配制成完全培养基，4 ºC 保存。 
	注意：该培养基有效期最长为 10 天。</li>
	<li>将盖玻片置于煮沸的 70%（vol/vol）乙醇中至少 30 分钟，以去除任何油脂残留，随后进行高压灭菌。</li>
	<li>将盖玻片放入 24 孔板中，每孔加入 500 µl 多聚-L-鸟氨酸溶液，在室温下于超净台中孵育 1 小时，然后用 500 µl 水洗涤 3 次。每孔加入 500 µl 层粘连蛋白溶液，在 37 ºC 湿润的组织培养箱中过夜孵育。 
	注意：层粘连蛋白处理后无需洗涤，但若多聚-L-鸟氨酸洗涤少于三次，则细胞在培养 24 小时后会死亡。</li>
	<li>用天然气或火焰对玻璃移液管尖端进行抛光。 
	注意：此步骤后，移液管尖端直径应约为原始大小的一半。</li>
	<li>使用已灭菌的剪刀剪去 1.5 ml 微离心管的管帽，并进行高压灭菌。</li>
</ol>
2. 胚胎腹侧中脑的解剖
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 使妊娠特定时间（E12.5）的母鼠麻醉，随后通过颈椎脱位实施安乐死。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒腹部，做腹部切口直至暴露所有子宫囊。用镊子切断阴道连接处并取出子宫，将子宫置于冰上预冷的 HBSS 中，放入 100 mm 培养皿内。</li>
	<li>使用镊子从子宫和羊膜囊中取出胚胎（图&#160;1C），并将胚胎放入新鲜的冰上预冷的 HBSS 中。 
	注意：图 1D 中的矩形框标示了胚胎腹侧中脑的位置。</li>
	<li>将胚胎置于解剖显微镜（10 倍放大）下，使用显微剪刀和镊子在峡部及中脑-间脑边界区域剪切脑组织，分离出中脑弓（图 1E，切口位置请参见 图 1A）。</li>
	<li>取出整个中脑后，在中背侧中脑区域进行一次切口（图 1F）。</li>
	<li>使用两把镊子去除脑膜（图 1H）。 
	注意：关键步骤：此步骤对获得最佳神经元产量和存活率至关重要。由于培养条件最适合脑细胞生长，周围组织来源的细胞在接种后大多会死亡，而这些组织释放的凋亡信号可能破坏培养物的完整性。</li>
	<li>将中脑组织在培养皿中展平以观察其蝴蝶形状，然后使用无菌剃刀刀片切下每侧“翅膀”约一半的部分（图 1H,I）。 
	注意：图 1J 显示了分离出的腹侧中脑。</li>
	<li>将腹侧中脑组织块转移至含有冰上预冷 HBSS 的 15 ml 锥形管中，并继续处理下一个胚胎。 
	注意：步骤 2.1–2.8 不应超过 1 小时。若胚胎在冰上存放超过此时间，细胞活力将显著下降。</li>
</ol>
3. 腹侧中脑细胞的解离
<ol>
	<li>在超净工作台中将腹侧中脑组织块转移至容器中。吸除HBSS，加入1 ml预热（37 ºC）的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液（适用于最多12块腹侧中脑组织）。将组织在37 ºC下孵育5-10分钟。</li>
	<li>在超净台中移除胰蛋白酶-EDTA溶液，并向组织中加入1 ml去活化培养基（血清可使胰蛋白酶失活）。</li>
	<li>移除去活化培养基，并用1 ml完全培养基清洗组织两次。 
	注意：避免将管中所有培养基完全吸除或用移液器吸取组织，以防丢失已解离的细胞。</li>
	<li>加入1 ml完全培养基，使用火焰抛光的玻璃移液管吹打组织。避免产生气泡，持续吹打直至获得单细胞悬液。 
	注意：通常需要经过限制性尖端吹打8-10次才能实现完全解离。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心5分钟，然后移除上清液。</li>
	<li>通过缓慢吹打上下混合最多四次，将细胞沉淀重悬于1 ml完全培养基中。</li>
</ol>
4. 接种腹侧中脑细胞
<ol>
	<li>取10 µl细胞悬液与90 µl台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板计数细胞数量。 
	注意：此步骤可同时检测细胞活力。</li>
	<li>将灭菌的微量离心管盖放入100 mm培养皿中，用镊子将预先包被多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白的盖玻片逐个转移至管盖上方。 
	注意：切勿清洗盖玻片，避免层粘连蛋白干燥，否则可能导致细胞培养分布不均并降低细胞存活率。</li>
	<li>加入完全培养基，调整细胞悬液至每1 µl含1,500个细胞，然后取100 µl（共150,000个细胞）滴加至每张盖玻片表面（该体积可充分覆盖盖玻片表面且不会溢出）。盖上培养皿，置于加湿的组织培养孵箱中孵育1小时（37 °C，5% CO2）。 
	注意：关键步骤：此步骤有助于提高细胞贴壁率和存活率，并增加每个胚胎可获得的盖玻片数量。也可将细胞直接接种至孔板（内含盖玻片）中，但每孔细胞数量需增至350,000个（而非150,000个）。换言之，采用本方法可获得8–10张盖玻片，而直接接种法仅能获得约3–4张，因部分细胞会贴附于孔板表面（盖玻片周围或下方）。采用该方法时，细胞培养的平均存活率约为90%。</li>
</ol>
5. 培养物的培养与维持
<ol>
	<li>孵育1小时后，小心地将载玻片连同培养基一起转移至含有400 µl预热至37 ºC的完全培养基（总体积：500 µl）的24孔板中。于37 ºC孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>在孔板孵育后的24小时内，轻轻向每个孔中加入500 µl完全培养基。 
	注意：最初的几个小时是多巴胺能神经元存活最关键的阶段，此后存活细胞数量不再发生显著变化。</li>
	<li>在培养的前两周内或直到培养基变黄之前，不要额外添加培养基。若培养超过两周或培养基颜色变为黄色，则更换一半培养基（500 µl）为新鲜的预热完全培养基（通常每两周一次）。 
	注意：在此条件下，培养物中的多巴胺能神经元可存活超过6周。</li>
</ol>

<ol><li>Prasad, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+immortalized+clonal+cell+lines+from+fetal+rat+mesencephalic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).</li>
<li>Fall, C. P., Bennett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+time+course+of+MPP%2B+-induced+apoptosis+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).</li>
<li>Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+modulation+of+dopamine+expression+in+neuronal+hybrid+cells+by+primary+cells+from+different+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).</li>
<li>Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+P75NTR+expression+causes+death+of+engrailed-deficient+midbrain+dopaminergic+neurons+by+Erk1%2F2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression.</a> Neural Dev. 4, 11(2009).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain. 133, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Animal models of Parkinson's disease.</a> Bioessays. 24, 308-318 (2002).</li>
<li>Schober, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+toxin-induced+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+6-OHDA+and+MPTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP.</a> Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+type+1+astrocytes+rescue+dopaminergic+neurons+from+death+induced+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation.</a> J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).</li>
<li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+progressive+degeneration+of+nigral+dopaminergic+neurons+in+postnatal+Engrailed+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice.</a> PNAS. 103, 15242-15247 (2006).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifelong+maintenance+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+Nurr1+and+engrailed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed.</a> J Biomed Sci. 21, 27(2014).</li>
<li>Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons%3A+determination+of+their+developmental+fate+by+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors.</a> Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).</li>
<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39, 889-909 (2003).</li>
<li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%3A+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiopathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurology%22%5BJournal%5D)">Aetiopathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurology. 258, S307-S310 (2011).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+gene+expression+of+midbrain+dopaminergic+neurons+reveals+molecules+involved+in+their+vulnerability+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection.</a> Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

中脑中的多巴胺能神经元是中枢神经系统中多巴胺的主要来源。这些神经元可分为三组：黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）、腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）和红核后区（retrorubral field, RRF）10,11。SNpc和VTA中的神经元形成了主要的多巴胺能通路，包括中脑皮层通路、中脑边缘通路和黑质纹状体通路，参与调控情绪、动机和运动行为等功能。SNpc中神经元的死亡以及黑质纹状体系统的功能障碍是第二常见的神经退行性疾病——帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的主要病理特征12,13。目前的治疗方法仅针对疾病症状，无法阻止或减缓神经元的退化过程，而这种缓慢、进行性细胞丢失的根本原因至今仍不清楚14-16。因此，建立用于研究该神经元群体发育、生化及生理特性的体内（in vivo）和体外（in vitro）技术，对于阐明帕金森病的病因以及开发新的治疗策略至关重要。
<p class="jove_co...

黑质致密部多巴胺能神经元的丢失导致帕金森病（PD）的主要运动症状，帕金森病是第二常见的神经退行性疾病。目前尚不清楚这一中脑神经元群体死亡的根本原因。为了研究负责中脑多巴胺能（mesDA）神经元发育、调节其神经生理特性及存活的生化通路，已采用多种细胞培养和动物模型系统。已用于生化及有限机制研究的永生化细胞系包括：大鼠多巴胺能细胞系1RB3AN27（N27）、人类多巴胺能神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、小鼠多巴胺能杂交细胞系MN9D以及人类中脑LUHMES细胞1-5。为研究mesDA神经元的特异性丢失，已开发出多种基于神经毒素和遗传因素的模型6-8。原代腹侧中脑培养物为研究多巴胺能神经元的神经元和突触特性，以及这一常见疾病发病机制中涉及的通路提供了不可或缺的工具。
本文介绍了一种分离中脑多巴胺能神经元的详细方案，其中包含若干改进措施，可显著提高细胞存活率，并增加每个胚胎所能获得的盖玻片数量。采用发育早期的E12.5小鼠中脑（大鼠为E14.5）有助于提高细胞存活率。在此阶段，神经元尚未长出轴突，因此在解剖过程中细胞结构保持完整，显著减少了机械损伤带来的应激，从而大幅提高细胞活力。此外，如本方案第2节所述，对腹侧中脑进行精细解剖可进一步提升细胞存活率。为了增加每个胚胎所能制备的盖玻片数量，本方案在第4节中介绍了一种替代性的接种方法。该方法可使每个胚胎获得多达10个盖玻片，而标准接种条件下仅能获得4个盖玻片，从而显著减少实验所需的动物数量。
培养的神经元表现出轴突和树突的生长，形成突触连接，并显示出神经元和突触标志物的存在，因此这类培养物适用于活细胞成像、免疫细胞化学和电生理学研究。此外，使用神经元培养便于进行遗传学和药理学操作。自第2天起神经突的生长 体外 可用于发育研究。此外，培养物的长期存活（长达六周）使其适用于研究这些神经元的缓慢进行性变性。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F-12 营养混合物）</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>汉克斯平衡盐溶液（HBSS）(1X)，液体</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂（100X），液体</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖溶液（水中 45% (wt/vol)）</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白（Laminin）</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（0.05% (wt/vol)）</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>经细胞培养验证的牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸，0.01% 溶液</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>抗微管相关蛋白-2A 和 -2B（Map2）抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>抗突触素-1 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗绵羊 IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗绵羊 IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4% (wt/vol)）</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片镊子 &amp;ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>两把 Dumont #45 镊子 &amp;ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>刀片夹持器/折断器，平握式 - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>学生用虹膜剪刀 - 直头 11.5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>光纤卤素光源照明器</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 无菌滤器</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100×20 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片 #1 厚度，德国玻璃，直径 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

中脑多巴胺能（mesDA）神经元的退化是帕金森病的病理特征。研究这些神经元生理功能及其易损性和死亡所涉及的生物学过程，对于理解这种常见神经退行性疾病的病因并揭示其治疗方法至关重要。原代培养的mesDA神经元为研究其分子、生化和电生理特性提供了工具，有助于理解这些神经元在疾病过程中发育、长期存活及退化的机制。本文介绍了一种从E12.5小鼠（或E14.5大鼠）胚胎中分离、培养和维持中脑多巴胺能神经元的详细方法。本方案优化的细胞培养条件可使神经元形成轴突和树突突起、建立突触连接及其他神经元形态学特征，从而使该培养体系适用于研究此类神经元群体的生理学、细胞生物学和分子特性。

酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, Th）的免疫组织化学染色显示，培养物中约有0.5%-1%的细胞为多巴胺能神经元。神经元突起在接种后2小时内开始出现，至第一天时，轴突和树突已可清晰分辨（图2），该结果通过酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白2（Microtubule-Associated Protein 2, Map2）抗体染色证实（图3）。这些神经元可存活六周以上，并表现出广泛的突起生长。培养物中的神经元-胶质细胞比例与培养基中血清浓度直接相关，这与先前研究结果一致。尽管从培养体系中去除胎牛血清（FBS）可能获得相对纯化的神经元培养物，但我们及其他研究者发现，添加血清可提高多巴胺能神经元在体外培养中的存活率9。
<img alt="脊椎动物脑解剖；解剖图示、提取过程、实验工具、发育研究。" src="/files/ftp_upload/52475/52475fig1.jpg" data-altu...

帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外 神经退行性变的建模。

中脑多巴胺能（mesDA）神经元的退化是帕金森病的病理特征。对这些神经元生物学过程的研究……

本实验的目的是高效分离并培养来自啮齿类动物腹侧中脑的原代神经元。首先解剖啮齿类动物胚胎的中脑，第二步是精细分离腹侧中脑。接下来，需要将神经组织进行解离，以获得单细胞悬液。最后一步是在小体积中将原代神经元接种到盖玻片上，随后将已贴壁的细胞转移至24孔板中。最终，利用抗体和免疫荧光显微镜技术来鉴定培养物中的多巴胺能神经元。中脑中的多巴胺能神经元参与多种功能，包括运动控制、认知过程中的情绪调节以及大脑的奖赏分泌功能。这些神经元还与多种神经及神经精神疾病相关，包括帕金森病、成瘾以及精神分裂症。修复腹侧中脑的方法。神经元培养可用于研究多巴胺能神经元的生理学和细胞特性，以及了解其在帕金森病等疾病过程中退变的原因。首先，准备盖玻片。用70%乙醇煮沸至少30分钟，以去除任何油脂残留。然后对盖玻片进行高压灭菌。将盖玻片转移至24孔板中，每孔加入0.5毫升聚氧乙烯醚。将培养板在室温下孵育一小时。请注意，工作浓度的多元醇或Athene溶液的有效期为一个月。随后用0.5毫升水洗涤盖玻片，共洗涤三次。若未完成全部三次洗涤，培养的细胞将无法存活24小时。接下来，修复层粘连蛋白溶液。务必先将其在冰上缓慢解冻。然后将层粘连蛋白溶解于冷的D-M-E-M-F 12培养基中，并立即使用。现在向每个孔中加入0.5毫升新配制的工作浓度层粘连蛋白溶液，将培养板在37摄氏度下孵育过夜。最后，在准备玻璃移液管时，我将管尖抛光至其正常尺寸的一半。进行腹部切口以暴露子宫囊，使用镊子将子宫游离。将子宫转移至盛有冰上预冷的HBSS的100毫米培养皿中，并开始用镊子取出胚胎。将分离的胚胎转移至另一含有冷HBSS的新培养皿中。现在在解剖显微镜下，于10倍放大倍数下准备暴露腹侧中脑的该区域。使用手术剪或镊子，在峡部以及中脑与头侧弓的头侧边界区域剪开脑组织，以分离中脑和头侧弓。取出整个中脑后，在内侧背侧中脑进行剪切。使用镊子去除软脑膜。此步骤对神经元培养的成功至关重要。非神经元细胞在培养条件下会死亡，并对邻近神经元产生不利的信号影响。现在将中脑组织压平成蝴蝶形状。使用无菌刀片切去每侧翼部约一半，保留中脑腹侧部分。将中脑腹侧部分转移至含有冰冻HBSS的15毫升锥形管中。随后继续解剖下一个胚胎，在一小时内尽可能处理多个胚胎。冰上保存超过一小时的胚胎，其细胞活力较差。为确保多巴胺能神经元具有较高的存活率，从解剖到接种的时间不应超过一小时。此外，在通风橱下剥离脑膜对于神经元的存活至关重要。将收集到的腹侧中脑中的 HBSS 去除，然后加入 1 毫升温热的 0.05% 胰蛋白酶 A DTA 溶液，每 12 块组织需加入足量的溶液。将组织在 37 °C 下孵育 5 至 10 分钟。在通风橱内，用 1 mL 去活化液替换胰蛋白酶 A DTA，轻轻吹打混匀，然后去除去活化液，但需保留足够液体，以免弃去解离的细胞。接下来，用完全培养基洗涤组织两次，注意不要丢失细胞。然后加入一毫升完全培养基。接着用火焰抛光的移液管轻轻吹打组织，避免产生气泡，直至获得单细胞悬液。大约传代八到十次即可。结束后，以 400 G 离心五分钟，弃去上清，将细胞重悬于一毫升完全培养基中。用移液器将细胞吹打至多四次以获得单细胞悬液。开始使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板对悬液中的细胞进行计数并评估细胞活力。现在将细胞悬液调整至每微升1500个细胞。然后将已灭菌的微量离心管盖转移至100毫米培养皿中。用镊子将准备好的盖玻片放置在管盖上。不要清洗盖玻片，并尽量避免其干燥。将100 µL悬浮液加样至每张盖玻片上。这种略显非常规的方法可提供90%的细胞存活率，是实验成功的关键步骤。然后盖上培养皿，将其转移至培养箱中孵育1小时。孵育后，小心地将带有培养基的盖玻片转移至24孔板中，每孔含有400 µL预热至37 °C的完全培养基，随后将细胞在37 °C孵育过夜。最初几个小时对细胞在24小时内的存活最为关键。轻柔地向每孔加入0.5 mL完全培养基。每两周一次。更换一半培养基。如果培养液变黄，则可提前进行半量换液，但换液频率仍应保持较低。在这些条件下，多巴胺能神经元可存活六周以上。培养两周后，针对酪氨酸羟化酶和神经元标记物的免疫组织化学结果显示，1%的细胞为多巴胺能神经元。神经元突起在接种后两小时内即开始出现。培养第一天结束时，轴突和树突已可区分。按照此操作步骤，神经元最终可存活六周以上，并表现出广泛的突起生长。此外，还可进行病毒转导、免疫荧光或电生理学等其他方法，以探究多巴胺能神经元中的机制性问题。

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