Name: 跟踪小鼠骨髓单核细胞在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 了解如何利用双光子成像技术在小鼠颅骨骨髓中实时追踪单核细胞动态。该方法揭示单核细胞在稳态和化疗后的动员机制，为免疫血液学研究提供重要见解。

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作者感谢Anne Daron和Pierre Louis Loyher提供的编辑协助，感谢皮提耶-萨勒佩特里尔影像平台（PICPS）在双光子显微镜使用方面的帮助，以及感谢动物设施“NAC”和Camille Baudesson在小鼠繁育方面的支持。本研究工作获得了欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，项目编号为n° 304810 – RAIDs 和 n°241440-Endostem，同时也获得了Inserm、巴黎第六大学“Emergence”项目、“法国抗癌联盟”（Ligue contre le cancer）、“癌症研究协会”（Association pour la Recherche sur le Cancer）以及法国国家科研署2012年新兴计划（ANR-EMMA-050）的资助。&#160;P.H. 获得了“法国抗癌联盟”的资助。&#160;

注意：所有实验方案均已获得法国动物实验与伦理委员会批准，并由“动物健康与环境保护服务部”（编号 A-75-2065）审核通过。样本量的确定旨在确保实验的可重复性，并符合动物伦理法规中的“3R”原则。

1. 小鼠的准备
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>对于短时间成像（少于1小时），通过腹腔注射200 µl含有氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的生理盐水溶液对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>或者，对于较长时间的成像（长达4小时），通过适配的面罩吸入2.5%异氟烷，该气体由70/30的O2/N2O混合气体雾化产生，对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>注意：此方法可提供更稳定的无意识状态，并避免重复进行腹腔注射药物。</li>
		<li>小鼠麻醉后，使用镊子刺激足垫以确认其是否失去知觉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血管染色/附加染色
	<ol>
		<li>进行血管染色时：通过尾静脉静脉注射200 µl罗丹明-葡聚糖（2 MDa，10 mg/ml溶于生理缓冲液中）。</li>
		<li>进行中性粒细胞染色时：将2 µg Ly6G-PE（克隆1A8）溶于100 µl生理盐水溶液中，通过尾静脉静脉注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>为实现固定，使用定制的立体定位支架，该支架需适配显微镜和麻醉气体吸入装置。 
		注意：立体定位支架是一种金属支撑装置，带有两个金属板夹，其中一个为固定式，另一个为可拆卸且可调节式，用于夹紧动物头部。</li>
		<li>将小鼠头部置于固定板之间，以隔绝呼吸运动的影响。将耳朵夹紧在固定板与头部之间，以拉伸皮肤。检查动物的稳定性及呼吸状况是否良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除头皮
	<ol>
		<li>使用无菌涂抹棒蘸取70%乙醇小心润湿头皮毛发，避免接触眼睛。</li>
		<li>使用无菌剪刀和镊子从顶骨后部至额骨完全切除头皮。操作时应距离眼睛和耳朵至少3 mm，以防大量出血。清除覆盖颅骨的疏松结缔组织（骨膜）。用温热的PBS浸湿纸巾擦洗残留的毛发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浸没系统设置
	<ol>
		<li>使用细针头将直径为18 mm的橡胶环通过外科胶水直接粘附于颅骨上，以控制胶水分布。将橡胶环整个边缘牢固粘合，防止液体泄漏（30 µl胶水应足够）。</li>
		<li>用PBS浸湿的纸巾在橡胶环下最后一次清洁颅骨，然后加入37 °C的PBS，使颅骨完全浸没。在小鼠每只眼睛上滴加一滴0.9%氯化钠溶液或专用眼用软膏，以防止眼睛干燥。将立体定位支架移至物镜下方。</li>
		<li>通过显微镜目镜利用直接透射光大致定位视野。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 双光子成像采集
<ol>
	<li>使用配备钛宝石晶体激光器的多光子显微镜，该激光器可提供脉宽为140 fs的近红外光，波长可在680至1,080 nm范围内选择性调节，并配备声光调制器以控制激光功率。采用包含3个外部非扫描探测器（NDD）的配置（可同时记录3个荧光通道），结合两个二向色镜（565&#160;nm 和 690&#160;nm）、565/610 和 500/550 带通滤光片以及一个485短通滤光片，搭配平面复消色差×20（NA = 1）水浸物镜。</li>
	<li>设置加热腔以维持麻醉小鼠良好的恒温状态。 
	注意：建议在成像开始前1小时&#160;设定温度，以获得更稳定的控温效果。本实验中设定为32 °C，以使麻醉小鼠的核心体温维持在最佳范围（36–37 °C），并持续维持不超过4小时。此温度可根据所用系统进行调整（可使用数字探头验证）。此外，所用加热腔为暗色/黑色，覆盖显微系统部分组件（如物镜和电动载物台），以避免外界光线干扰。</li>
	<li>开启系统
	<ol>
		<li>先开启钛宝石激光器，再启动整个显微镜系统。运行图像采集软件，将激光波长设定为870 nm，并选择合适的NDD用于信号记录。 
		注意：在本实验中，二次谐波生成（SHG）19和增强型青色荧光蛋白（ECFP）信号由经过485短通滤光片后的NDD检测；ECFP也由经过500/550带通滤光片的NDD检测，而罗丹明-葡聚糖信号则由经过565/610带通滤光片的NDD检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整采集参数
	<ol>
		<li>使用软件中的“实时采集”成像命令，并通过显微镜方向控制调节焦平面，聚焦至具有ECFP和罗丹明信号的区域。将激光功率调至最低，以在最小光损伤的前提下获得最佳信噪比。 
		注意：所用功率设置取决于目标区域的深度。通常将AOM设置在约20%，对应物镜后激光功率约为15 mW。建议通过提高各NDD对应PMT的增益来减少光漂白和光损伤。典型的采集参数为单次扫描模式，像素驻留时间为1.58 µs，分辨率为512 × 512像素，放大倍数为1.5倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择感兴趣区域
	<ol>
		<li>参数设定完成后，再次使用“实时”采集命令，扫描组织以选择需要实时监测的（x, y, z）视野。 
		注意：通常选择同时包含血管区和实质区的视野。</li>
		<li>使用软件“位置”命令注册该视野。 
		注意：该命令可记忆多个不同位置的x, y, z坐标。</li>
		<li>按照相同流程，选择并注册最多3个额外的感兴趣区域。</li>
		<li>在第一个已记忆的位置上，根据所需成像体积和选定的放大倍数，使用“z-stack”软件命令设置三维z层扫描。先记录较深位置，再记录最浅位置，并根据深度归一化激光功率。 
		注意：对于多个区域同步成像，我们对每个视野采集5层图像，z轴步进为3 µm，总厚度为12 µm。这些参数可根据所研究细胞类型进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动图像采集
	<ol>
		<li>选择“时间序列”软件命令，设定时间间隔和循环次数。通过点击“开始实验”命令，根据所需的时间间隔和总时长开始延时成像。 
		注意：本实验中，每30秒&#160;采集一个体积图像，共60个循环，相当于30分钟真实时间。若需追踪血管内细胞的快速滚动行为，可采用更短的时间间隔。此时应使用更薄的z层扫描，且同时记录的视野不超过2个。</li>
		<li>定期监控系统状态。
		<ol>
			<li>始终监控动物状态，确保其处于无意识状态。 
			注意：若动物胡须或腿部出现抖动，提示可能苏醒。若呼吸呈现不规则，可略微减少异氟烷用量。采集过程中若出现显著组织漂移，提示小鼠可能正在恢复意识。</li>
			<li>确保物镜始终处于浸没状态。在两次采集之间（约30分钟）更换37 °C的PBS缓冲液。 
			注意：采集过程中信号逐渐减弱提示可能存在PBS泄漏。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验结束
	<ol>
		<li>完成所需视频采集后，在动物复苏前迅速通过颈椎脱臼法实施安乐死。 
		注意：伤口愈合将在24至48小时内形成结痂，从而限制后续纵向成像的可能性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>漂移校正
	<ol>
		<li>使用 Imaris Bitplane 软件进行三维自动追踪。</li>
		<li>在 Imaris 中打开三维图像序列。选择“spot”命令，并通过手动追踪（鼠标点击+Shift键）为所有时间点生成至少4个不同的锚定点，若可能，应使这些点在视野中均匀分布。</li>
		<li>在“edit track”选项卡中使用“correct drift”命令进行漂移校正。</li>
		<li>检查x、y方向尤其是z方向的校正质量，以避免出现伪影性波动。 
		注意：如果校正效果不理想，可尝试更换其他锚定点，或排除该视频数据不参与后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞追踪
	<ol>
		<li>使用“add new spots”命令，并选择“track spots over time”算法设置。进入下一步。</li>
		<li>使用“source channel”命令对整个目标通道执行自动细胞追踪程序。将目标（即细胞）的直径设置为 10 µm。进入下一步。 
		注意：该选择取决于目标物与检测信号之间的区分度及特异性。简而言之，仅当检测到的信号对目标物具有特异性时，才可对整个通道进行自动追踪。由于SHG和ECFP信号均通过NDD在485短通滤光片后被检测，因此使用NDD在500/550带通滤光片后记录的ECFP信号进行追踪将更具特异性和效率。对于成簇或密集排列的目标物，需参照步骤3.1.2进行个体目标的手动选择。</li>
		<li>选择“quality”滤波类型，设定阈值以排除非特异性目标的追踪。进入下一步。</li>
		<li>选择“Brownian Algorithm Motion”，并准确设置两个斑点之间的“Max distance”和“Gap size”参数。确认并生成轨迹。</li>
		<li>轨迹自动生成后，选择“track duration”滤波类型，设定阈值以剔除短于120秒（对应4个时间点）的轨迹。</li>
		<li>必须步骤：自动追踪完成后，需检查轨迹质量。
		<ol>
			<li>展开时间轴，检查目标是否沿轨迹路径移动。若不符合，可使用“edit”选项卡中提供的轨迹点校正功能：使用“delete”命令删除错误或不恰当的轨迹（可使用“disconnect”命令单独删除任意轨迹点）。若轨迹路径不连续，可通过手动添加缺失的时间点（鼠标点击+Shift键），选中某一条轨迹上的所有点，然后在“edit track”选项卡中使用“connect”命令进行连接。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量参数分析
	<ol>
		<li>在“Preferences”命令中选择“Statistic”选项卡，从列表中选择感兴趣的动态参数。选择“Export all statistics to file”命令，并保存生成的Excel文件。 
		注意：软件可直接提供多种动态参数，如轨迹长度、瞬时速度、平均速度和轨迹直线性。运动系数6,20可被计算得出，但软件不直接提供该值。</li>
		<li>对每个细胞，计算每个时间段（δt）内的位移均值（对于30秒时间间隔的成像视频，δt分别为30、60、90秒等）。绘制均方位移随时间间隔变化的曲线图，并通过计算曲线线性部分的斜率获得运动系数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键点 体内 成像方法学的目标是确保焦距的稳定性，以最大限度延长成像持续时间，并尽量减少细菌污染和炎症的风险，这些因素可能影响炎性细胞的动态行为。颅骨骨髓的成像遵循上述原则，因为为获取骨髓而实施的手术创伤极小。使用无菌材料和消毒剂对于限制感染风险至关重要，因为感染可能干扰细胞稳态。
立体定位支架的开发可能具有挑战性，需要针对每个系统进行特定的定制（如显微镜物镜与电动载物台之间的距离、使用气体吸入麻醉装置等）。应尽可能使小鼠头部保持水平，以获得更广泛的成像表面访问。动物放置到位后，通常需要数分钟时间才能获得焦平面的良好稳定性。因此，建议在启动图像采集记录前检查组织是否发生漂移。由于此过程连同感兴趣区域的选择可能耗时较长，若使用了氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉，建议定期检查动物是否仍处于无意识状态，并检查物镜是否始终浸没在液体中，因为液体可能发生泄漏或蒸发。
橡胶环在颅骨上的良好定位是该过程中的另一个关键步骤。氰基丙烯酸酯胶水在稳定性和密封性方面效果良好，但需避免胶水过量，以免覆盖颅骨并阻碍对组织感兴趣区...

骨髓在造血过程中起着核心作用，是单核细胞的主要储存库，这些单核细胞持续在血液与骨髓实质之间循环，不断更新寿命较短的循环单核细胞池2,3，并参与稳态下组织巨噬细胞和树突状细胞的重建4。在炎症反应期间或短暂性再生障碍后，单核细胞会从骨髓或脾脏被主动动员5, 6, 7，并定植于炎症器官。已有多个趋化因子轴被证实参与骨髓中髓系细胞的动员过程8, 5, 6,9。除了髓系细胞外，骨髓也是T淋巴细胞启动活化的重要部位10，并构成免疫记忆的微环境11,12。因此，该组织在血液学和免疫学领域的众多研究中具有核心地位。目前关于骨髓内髓系细胞结构组织的认识，主要来源于对固定组织切片的组织学分析13。这种静态观察无法研究骨髓不同区室之间的细胞交换动态，而后者正是其功能活动的基础。
活体成像为研究细胞迁移、细胞黏附以及细胞间相互作用提供了重要的生物学信息，这些过程以往仅通过体外（in vitro）系统进行描述。实现高质量活体成像的技术挑战主要包括：从光学角度能够有效到达目标组织，并最大程度地减少生理因素（如呼吸、肌肉或肠蠕动收缩）或机械漂移（如手术引起的组织扰动和延展、显微镜物镜接触以及温度和血管/氧合状态变化）对成像的干扰。微小的漂移可能限制长时间聚焦的稳定性，并在细胞运动性定量分析中引入伪影。一种已被多种组织验证、可有效缓解上述技术难题的替代方法是：将离体组织置于恒温且供氧的培养环境中进行成像；然而，这种方法完全中断了淋巴和血液循环，可能带来一定问题。颅骨骨髓的活体成像在上述方面具有多项优势。首先，其所需外科操作极小。其次，该区域骨组织的厚度允许直接可视化骨髓微环境，无需磨骨，从而减少了生理干扰。骨髓网络可在颅骨的旁矢状区进行成像；但在额顶区域，由于骨基质较薄，窦状血管更为清晰可见12,14。
活体成像依赖于能够最精确标记目标细胞群体的荧光报告系统。体外对纯化的细胞群体进行标记后再进行过继转移，已成功用于鉴定造血干细胞微环境15以及促进肿瘤植入的骨髓内皮微区16，并为免疫学中若干关键概念提供了重要依据17。然而，该方法通常需要数十万计的细胞，才有可能在后续的体内检测到这些细胞。这可能是由于染色后细胞死亡率高、细胞在全身分布稀释以及细胞活化状态发生改变，从而导致归巢行为出现偏差。利用转基因小鼠系统进行内源性标记在很大程度上克服了这些局限性，已实现对内源性成骨细胞8、巨核细胞18以及髓系细胞亚群6行为的成像观察。然而，在采用荧光报告系统研究特定细胞亚群时，仍需谨慎评估其标记的特异性。
的 Csf1r- Gal4VP16/UAS-ECFP，称为 MacBlue 小鼠 1是一种用于通过实时成像研究髓质单核细胞的有价值的转基因系统 6静脉注射高分子量罗丹明-葡聚糖可将骨髓实质与骨髓中的血管窦状网络区分开来。利用该方法，可在特定的病理生理背景下追踪单核细胞在不同骨髓区域中的行为。此外，我们提出另一种策略，通过该方法可将单核细胞的动力学与中性粒细胞进行比较 体内 使用特异性抗体进行标记。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml，麻醉剂</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg/ml，麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td></td><td>2.5%，麻醉剂</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/NO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>70/30 混合气体，麻醉剂</td></tr><tr><td>罗丹明-葡聚糖</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa，10 mg/ml，血管染色</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>克隆株 1A8，中性粒细胞染色</td></tr><tr><td>立体定位固定装置</td><td>自制</td><td></td><td>手术</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>手术</td></tr><tr><td>无菌剪刀和镊子</td><td></td><td></td><td>手术</td></tr><tr><td>橡胶环</td><td></td><td></td><td>直径 18 mm，手术</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Medical</td><td></td><td>外科粘合剂，用于固定橡胶环</td></tr><tr><td>细针头</td><td>Terumo</td><td></td><td>手术</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO 多光子显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Ti:蓝宝石晶体激光器&amp;nbsp;</td><td>Coherent Chameleon Ultra</td><td></td><td>近红外光，140 飞秒脉冲</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>采集软件</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td>分析软件，三维自动追踪</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. Dutscher</td><td></td><td>手术</td></tr><tr><td>温控培养室</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>活体成像</td></tr></tbody></table>

追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

实时多光子成像为研究细胞迁移及细胞间相互作用在其生理性的三维环境中的动态过程提供了重要机遇。免疫细胞的生物学功能主要依赖于其运动能力。血液单核细胞在血液循环中的半衰期较短，它们起源于骨髓并持续从骨髓释放入血。在炎症状态下，该过程被增强，导致血液单核细胞增多，并继而浸润外周炎症组织。明确调控单核细胞从骨髓向血管网络迁移的生物力学事件，是理解单核细胞生理病理意义的重要步骤。我们进行了 体内 通过双光子显微镜对颅骨骨髓进行延时成像 Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP（MacBlue）小鼠。MacBlue小鼠在髓系特异性启动子的调控下表达增强型青色荧光蛋白（ECFP）荧光报告基因。 1结合血管网络标记，我们描述了该方法如何实现对单个骨髓单核细胞的实时追踪，从而进一步量化其在骨髓实质和血管系统中的迁移行为以及细胞间的相互作用。该方法为骨髓单核细胞亚群的生物学特性提供了新的见解，并有助于深入探究在特定病理条件下如何影响这些细胞的功能。

小鼠颅骨结构为通过活体成像研究骨髓生理学提供了良好机会。额顶区域的骨组织较薄，因此无需磨除骨组织即可进入骨髓微环境。图1展示了一幅MacBlue转基因小鼠颅骨的宽视野二维图像。骨基质主要由胶原蛋白I组成，可通过二次谐波信号（SHG）清晰检测19。注射罗丹明-葡聚糖可标记骨髓中的血管网络，从而识别位于骨基质与血管之间的实质骨髓微环境14。ECFP标记的细胞分布于骨髓的两个区室中，但不存在于骨基质内。单核细胞根据其在组织中的位置进行人工分类：当整个细胞位于血管系统内时，定义为血管内单核细胞，不考虑血管大小，仅排除较大的汇集性小静脉；当细胞位于血管系统与骨基质之间时，定义为实质单核细胞。
对特定区域进行延时成像（补充视频1和2），可分别追踪血管内（图2A）或实质内（图2B）单核细胞随时间变化的单个细胞运动轨迹。轨迹长度显示，实质内单核细胞的位移较血管内单核细胞减少。对随时间变化的位移进行分析，可比较两个区室中单核细胞的平均速度（...

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。

实时多光子成像为研究细胞迁移及其在生理三维环境中的细胞间相互作用提供了极佳的机会……

本实验的总体目标是利用双光子成像技术，在活体小鼠的颅骨骨髓中可视化单核细胞的迁移过程。首先，对小鼠进行麻醉，并注射罗丹明葡聚糖溶液以标记血管系统。随后，将小鼠置于定制的金属支架中，去除从顶骨后部至额骨区域的头皮组织。随后，将一个橡胶环直接用手术胶粘附在颅骨上，并用液体生理盐水填充储液池。最后，利用双光子显微镜追踪颅骨骨髓中荧光标记细胞随时间的发育过程。该方法有助于解答免疫血液学领域中的关键问题，例如单核细胞在稳态条件下或化疗后的动员机制。因此，该方法可深入了解单核细胞的行为特征，也可根据所使用的荧光报告系统的特异性，应用于研究其他骨髓细胞亚群。以下方案采用配备钛蓝宝石晶体激光器以及光功率调制器的多光子显微镜系统。为了实现三个荧光通道的同时记录，配置应包括三个外部非DS扫描探测器（NDD），并结合使用565纳米和690纳米的二向色镜、565纳米、610纳米以及500-550纳米的带通滤光片，以及一个485短通滤光片。请注意，在此设置中，二次谐波产生（SHG）和青色荧光蛋白（CFP）均通过485短通滤光片后的NDD进行检测。CFP也由NDD检测。经过500-550带通滤光片后，由NDD检测Rod Domine Dextran。在成像前数小时，使用565-610带通滤光片，并将加热室设置为32摄氏度。该温度将在整个实验过程中维持小鼠的最佳体温。请注意，此处使用的加热室为暗色，可覆盖系统的物镜和电动载物台，有助于避免外界光线干扰。开启系统时，应先打开钛宝石激光器，然后再开启显微镜系统的其余部分。启动采集软件。此处使用蔡司 Zen 软件。将激光波长范围设置为 870 纳米。然后选择合适的NDD进行记录。本实验所使用的小鼠是一种名为Mac blue的转基因小鼠，该小鼠在CSF1受体启动子的调控下表达青色荧光蛋白。推荐的麻醉方法取决于成像时长，因此最好参考随附文档以获取详细信息。该操作中较困难的部分是T形静脉注射，因为很容易错过静脉。若发生此情况，可改为进行眶后注射。小鼠麻醉后，使用镊子刺激足垫以检查其是否失去意识。下一步。为了染色血管系统，向小鼠尾静脉注射 200 微升 rod domine dextran；若需染色中性粒细胞，则注射含有 LY6G PE 的 100 微升生理盐水。注射后，将小鼠头部置于定制的立体定位仪的固定板之间，该定位仪已适配显微镜和麻醉气体吸入装置。这可以确保呼吸运动不会影响成像。拧紧固定板，以拉伸耳部与头部之间的皮肤。检查其稳定性。用镊子轻轻按压头部时，头部不应移动。然后确保动物呼吸正常。为进行双光子成像，用手指将70%乙醇涂抹于头皮毛发处，注意避免接触眼睛。然后放置一块带有开口的手术巾，暴露头皮。接着使用无菌剪刀和组织钳，从顶骨后部至额骨处剪开皮肤，并完全去除头皮。操作时需距离眼睛和耳朵至少三毫米，以防止大量出血。去除覆盖颅骨的疏松结缔组织或骨膜。然后用浸有温PBS的纸巾擦拭残留的毛发，如图所示。使用细针头，将手术胶涂抹于直径10毫米的橡胶环的整个周边。然后将橡胶圈直接放置在颅骨上，并用另一张浸有 PBS 的纸巾覆盖。最后再清洁一次橡胶圈内部。加入温热的 PBS，完全浸没颅骨。然后将立体定位架置于物镜下方。小鼠就位后，使用显微镜目镜通过直接透射光观察颅骨，并大致将其调整至显微镜视野范围内。在成像软件窗口的左上角，点击“实时采集”。使用软件中的显微镜方向控制，组织的实时扫描图像将出现在窗口中央。找到具有CFP和杆状结构信号的区域以调节焦距。然后将激光功率设置为最低，以在光损伤最小的情况下获得最佳的信噪比。接下来在软件中，点击通道选项卡，针对每个NDD增加PMT的增益功率，以减少光漂白和光损伤；然后点击相应的选项卡，将采集设置设为单次扫描模式，像素驻留时间为1.58微秒，分辨率为512×512像素，放大倍数为1.5倍。参数设置完成后，点击实时采集命令，对组织进行扫描，选择一个理想的x、y、z视野进行实时监测。此处选择的视野同时包含血管区域和实质区域。接下来，保存或注册“位置”选项卡中显示的视野的 X、Y、Z 坐标。单击“添加”。重复此过程，最多可再添加三个视野，以注册所有感兴趣的坐标位置。坐标将显示在软件中“位置”选项卡的相应位置。要采集三维Z轴图像堆栈，请在软件的“位置”选项卡中点击“移动到”，前往第一个已注册的位置，并在软件左上角的方框中选择“Zack”。这将打开Z轴堆栈选项卡，移动到最高的Z轴位置，并相应调整激光功率。先点击“设置最后”，然后移动到最深位置。调节激光功率，再点击“设置最初”。应根据所研究细胞的运动速度调整成像堆栈的厚度。运动较快的细胞会迅速移出视野，因此需要采集较厚的堆栈；而对于运动较慢的细胞，则可采集较薄的堆栈。在左上角的框中，选择时间序列命令以打开时间序列选项卡。设置循环次数和时间间隔。此处，每个30秒采集一次数据，共采集60个循环。这代表实际时间中的30分钟。在主窗口中开始延时成像时，选择“开始实验”，并在整个过程中持续监测动物，以确保其处于无意识状态。同时确保物镜已正确浸入。序列捕获后，使用移液器加入预热的 PBS，然后开始第二次 30 分钟的数据采集。若在采集过程中观察到信号逐渐减弱，请检查是否有 PBS 泄漏。在完成所有必需视频的录制后，按照随附文档中所述进行数据分析，以通过活体成像研究骨髓生理学。将2百万道尔顿的罗丹明葡聚糖注射到Mac blue转基因小鼠体内，并通过双光子激光扫描显微镜进行成像。如本视频所示，在所得的显微图像中，血管系统因被2百万道尔顿罗丹明葡聚糖标记而呈红色，骨组织通过二次谐波生成显示为蓝色。呈青色的ECFP阳性单核细胞位于实质微环境内，这些区域表现为血管与骨之间的暗区，以及血管内部。为计算单个细胞的运动轨迹，进行了延时成像。本视频展示了实质单核细胞的迁移行为。ECFP 信号显示为青色，每个红色斑点的迁移路径显示为绿色。此处可见血管单核细胞的迁移行为。这些数据可用于计算细胞的平均速度和均方位移。需要注意的是，与实质单核细胞相比，血管单核细胞表现出更高的位移和更快的迁移速度。观看本视频后，您应能充分了解如何在小鼠骨髓单核细胞发育完成后，利用双光子成像技术在活体中对其进行示踪。该技术为免疫学领域的研究人员探索骨髓中的细胞迁移与相互作用奠定了基础。骨髓不仅是重要的造血场所，还具有抗原启动和免疫记忆等其他关键功能。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

跟踪小鼠骨髓单核细胞<em&gt;在体内</em

本视频介绍了一种详细的实验方案，用于从小鼠后肢分离新鲜的完整骨髓，以研究白血病等血液疾病患者的全骨髓缺陷。...

从小鼠后肢采集骨髓

本方案描述了一种无需处死小鼠即可进行股骨骨髓（BM）连续取样的操作流程。该方法可支持对小鼠骨髓组成进行长期的纵向研究，并能够连续获取骨髓内的细胞，用于离体（ex...

活体小鼠股骨骨髓穿刺

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。...

通过活体显微镜实时成像麻醉小鼠肠系膜静脉中的中性粒细胞和单核细胞

该方案描述了一种新型的小鼠股骨观察窗模型，可用于追踪股骨骨髓中细胞的运动...

股骨窗室模型 在体 内 小鼠骨髓中的细胞追踪

在此，我们介绍一种实验方案 体内 GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）对初始CD4...

一个 在体 内 用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的 小鼠模型

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。...

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

此处，我们介绍一种用于分析巨核细胞超微结构的实验方案 原位 采用透射电子显微镜（TEM）观察。收集小鼠骨髓，经固定、环氧树脂包埋后切成超薄切片。经对比染色后，在120 kV电压下用TEM显微镜观察骨髓结构。...

原位 探索小鼠巨核细胞生成过程——基于透射电子显微镜技术

本方案描述了在小鼠异种移植模型中向股骨内注射少量造血干细胞或白血病干细胞（包括基因编辑细胞）的方法，该方法不仅能够实现细胞的快速安全移植，还可进行骨髓的系列分析。...

利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

了解如何利用双光子成像技术在小鼠颅骨骨髓中实时追踪单核细胞动态。该方法揭示单核细胞在稳态和化疗后的动员机制，为免疫血液学研究提供重要见解。

追踪小鼠骨髓单核细胞体内

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