追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

本实验的总体目标是利用双光子成像技术，在活体小鼠中观察单核细胞在颅骨骨髓中的迁移过程。首先，对小鼠进行麻醉，并注射罗丹明葡聚糖溶液以标记血管系统。随后，将小鼠置于定制的金属支撑装置中，去除从顶骨后部至额骨区域的头皮组织。

随后，将一个橡胶环直接用手术胶粘附在颅骨上，并用液体生理盐水填充储液池。最后，利用双光子显微镜追踪颅骨骨髓中荧光标记细胞随时间的发育过程。该方法有助于解答免疫血液学领域的一个关键问题，例如单核细胞在稳态下或化疗后的动员机制。

因此，该方法可深入了解单核细胞的行为特征。此外，根据所使用的荧光报告系统的特异性，该方法也可用于研究其他骨髓细胞亚群。以下方案采用配备钛蓝宝石晶体激光器以及光功率调制器的多光子显微镜。

为了实现三个荧光通道的同时成像，系统配置应包括三个外部非DS扫描探测器（NDD），并结合使用565纳米和690纳米的二向色镜、565纳米、610纳米以及500–550纳米的带通滤光片，以及一个485纳米短通滤光片。需要注意的是，在此设置中，二次谐波生成（SHG）和青色荧光蛋白（CFP）信号在经过485纳米短通滤光片后由NDD探测器检测。CFP信号也由NDD探测器检测。

经过500-550带通滤光片后，由NDD检测Rod Domine Dextran。在565-610带通滤光片之后，成像前数小时将加热腔室设置为32摄氏度。该温度将在整个实验过程中维持小鼠处于最佳体温状态。

请注意，此处使用的加热室为暗色，可覆盖系统的物镜和电动载物台，有助于避免外界光线干扰。开启系统时，应先打开钛宝石激光器，然后再开启显微镜系统的其余部分。

启动采集软件。此处使用的是蔡司 Zen 软件。将激光波长范围设置为 870 纳米。

然后选择合适的NDD进行记录。本实验所使用的小鼠是一种名为Mac blue的转基因小鼠，该小鼠在集落刺激因子1受体启动子的调控下表达青色荧光蛋白。推荐的麻醉方法取决于成像时间的长短，因此最好参考随附文档以获取详细信息。

该操作中较困难的部分是T形静脉注射，因为很容易错过静脉。如果发生这种情况，可改为进行眶后注射。小鼠麻醉后，使用镊子刺激足垫以检查其是否失去意识。下一步。

为了染色血管系统，向小鼠尾静脉注射 200 微升罗丹明葡聚糖；若需染色中性粒细胞，则注射 100 微升含有 LY6G PE 的生理盐水。注射后，将小鼠头部置于定制的立体定位仪的固定板之间，该定位仪已适配显微镜和麻醉气体吸入装置。

这可以确保呼吸运动不会影响成像。拧紧固定板，以拉伸耳部与头部之间的皮肤。检查稳定性。

用镊子轻轻按压头部时，头部不应移动。然后确保动物呼吸正常。为进行双光子成像，用手指将70%乙醇涂抹于头皮毛发处，注意避免接触眼睛。

然后放置一块带有开口的手术巾，暴露头皮。接着使用无菌剪刀和组织剪，从顶骨后部至额骨完全切除头皮。操作时需与眼睛和耳朵保持三毫米的距离，以防止大量出血。

去除覆盖颅骨的疏松结缔组织或骨膜。然后用浸有温PBS的纸巾擦拭残留的毛发，如图所示。使用细针头，将手术胶水涂抹于直径10毫米的橡胶环整个周边。

然后将橡胶圈直接放置在颅骨上，并用另一张浸有 PBS 的纸巾覆盖。最后再清洁一次橡胶圈内部。加入温热的 PBS，完全浸没颅骨。

然后将立体定位装置置于物镜下方。小鼠就位后，使用显微镜目镜通过直接透射光观察颅骨，并大致将其调整至显微镜视野范围内。在成像软件窗口的左上角，点击“实时采集”。

使用软件中的显微镜方向控制，在窗口中央将出现组织的实时扫描图像。找到具有CFP和杆状结构域信号的区域以调整焦距。然后将激光功率设置为最低，以在光损伤最小的情况下获得最佳的信噪比。

接下来在软件中，点击通道选项卡，针对每个NDD增加PMT的增益功率，以减少光漂白和光损伤；然后点击相应的选项卡，将采集设置设为单次扫描模式，像素驻留时间为1.58微秒，分辨率为512×512像素，放大倍数为1.5倍。参数设置完成后，点击实时采集命令，对组织进行预览，选择一个理想的x、y、z视野进行实时监测。此处选择的视野同时包含血管和实质区域。

接下来，保存或注册“位置”选项卡中显示的视野的 X、Y、Z 坐标。单击“添加”。重复此过程，最多可再添加三个视野，以注册所有感兴趣的坐标位置。

坐标将显示在软件中“位置”选项卡上，以指导操作。要采集三维Z轴图像堆栈，请在软件的“位置”选项卡中点击“移动至”，前往第一个已注册的位置，并在软件左上角的框中选择Zack。这将打开Z轴堆栈选项卡，移动到最高的Z轴位置，并相应调整激光功率。

先单击“设置最后”，然后移动到最深的位置。调节激光功率，再单击“设置最初”。

应根据所研究细胞的运动速度快速调整成像堆栈的厚度。运动较快的细胞会迅速移出焦平面，因此需要采集较厚的堆栈图像；而对于运动较慢的细胞，则可进行较薄堆栈的采集。

在左上角的框中，选择时间序列命令以打开时间序列选项卡。设置循环次数和时间间隔。此处，每个体积将在 60 个循环内每 30 秒采集一次。

这代表实际时间的30分钟。在主窗口中开始延时成像时，选择“开始实验”。在整个过程中，持续监测动物以确保其处于无意识状态，并确保物镜已正确浸入。

序列捕获后，使用移液器加入预热的 PBS，然后开始第二次 30 分钟的数据采集。如果在采集过程中观察到信号逐渐减弱，请检查是否有 PBS 泄漏。

在完成所有必需的视频录制后，按照随附文档中所述进行数据分析，以通过活体成像研究骨髓生理学。一只Mac blue转基因小鼠被注射了2百万道尔顿的罗丹明标记葡聚糖，并通过双光子激光扫描显微镜进行成像。如本视频所示，在获得的显微图像中，血管系统因摄取2百万道尔顿罗丹明标记葡聚糖而呈红色，骨组织通过二次谐波生成显示为蓝色。呈青色的ECFP阳性单核细胞位于血管与骨之间的实质微环境（表现为暗区）中，同时也存在于血管内部。

为了计算单个细胞的运动轨迹，进行了延时成像。该视频展示了实质单核细胞的迁移行为。ECFP 信号显示为青色，每个红色斑点的迁移路径显示为绿色。

此处可见血管单核细胞的迁移行为。这些数据可用于计算细胞的平均速度和均方位移。需要注意的是，与实质单核细胞相比，血管单核细胞表现出更高的位移和更快的速度。

观看本视频后，您应能充分了解如何在小鼠骨髓单核细胞发育完成后，利用两种光成像技术在活体中对其进行示踪。该技术为免疫学领域的研究人员探索骨髓中的细胞迁移与相互作用奠定了基础。骨髓不仅是重要的造血场所，还具有抗原启动和免疫记忆等其他重要功能。