跟踪小鼠骨髓单核细胞在体内
February 27th, 2015
单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬系统的更新和炎症情况下起关键作用。本手稿描述了小鼠颅骨骨髓实时成像以研究单核细胞动员机制的程序。
该程序的总体目标是使用双光子成像可视化活小鼠颅骨骨髓中的单核细胞运输。首先，麻醉小鼠并注射腐烂溶液，即瘤胃右旋糖酐以标记脉管系统。然后将鼠标放置在定制的金属支架中，并从顶骨后部到额骨的头皮被去除。
然后用手术胶将橡胶圈直接涂在颅骨上，并在储液罐中装满液体盐水。最后，多光子显微镜用于跟踪颅骨骨髓内荧光细胞随时间的变化。这个 me 可以帮助回答免疫血液学领域的一个关键问题，例如稳态或化疗后单核细胞动员的机制。
因此，这种方法可以提供对模块化单核细胞行为的见解。它也可以应用于研究其他骨髓细胞亚群，具体取决于所用 flu cent 报告基因的特异性。以下协议利用多光子显微镜与钛蓝宝石晶体激光器耦合，以及用于激光功率控制的运算调制器。
为了能够同时记录三个荧光通道，配置应包括三个外部非 DS 扫描检测器或 nds，组合为 565 纳米和 690 纳米二向色镜、565、610 纳米和 500 550 纳米带通滤光片，以及一个 485 短通滤光片。请注意，在此设置中，NDD 在 485 短通滤波器之后检测到二次谐波产生或 SHG 和青色荧光蛋白或 CFP。NDD 也会检测到 CFP。
在 500 550 带通滤波器和 Rod Domine 后，NDD 检测到葡聚糖。在 565 610 带通滤光片之后，在成像前几个小时将加热室设置为 32 摄氏度。该温度将在整个实验过程中将小鼠保持在最佳体温。
请注意，此处使用的加热室是深色的，并覆盖了系统的物镜和电动板。这有助于避免外部光污染。要先打开系统，请打开钛蓝宝石激光器，然后打开显微镜系统的其余部分。
启动采集软件。这里使用了 Zeiss Zen 软件。将激光波长范围设置为 870 纳米。
然后选择适当的 NDD 进行录制。本实验中使用的小鼠是一种名为 Mac blue 的转基因小鼠，它在 CSF one 受体启动子的控制下表达青色荧光蛋白。推荐的麻醉方法取决于成像的长度，因此最好查阅随附的文件了解详细信息。
该程序的一个困难方面是 T 静脉注射，因为很容易错过静脉。如果发生这种情况，请改为进行眶后注射。一旦鼠标被麻醉，用钳子刺激脚垫来检查是否失去知觉。下一个。
要对脉管系统进行染色，请将 200 μL 棒状多米葡聚糖注射到尾静脉中，或用于中性粒细胞染色。注射 100 微升含有 LY 6 GPE 的生理盐水。注射后，将鼠标头部放在适用于显微镜和麻醉气体吸入器的定制立体定向支架的固定板之间。
这可确保呼吸运动不会影响成像。拧紧固定板以拉伸耳朵和头部之间的皮肤。检查稳定性。
用钳子轻轻按压头部，头部不应移动。然后确保动物呼吸正常。要为鼠标准备双光子成像，请用手指将 70% 乙醇涂抹在头皮的头发上，注意避开眼睛。
然后放上带有切口的窗帘以露出头皮。接下来，使用无菌剪刀和钳子切开皮肤，从顶骨后部到额骨完全去除头皮。与眼睛和耳朵保持 3 毫米的距离，以防止大面积出血。
去除覆盖颅骨的松散结缔组织或骨膜。然后用温热的 PBS 浸泡过的纸巾，如图所示洗掉剩余的头发。使用小规格针头，将手术胶涂抹在直径为 10 毫米的橡胶环的整个周边。
然后用另一条 PBS 浸湿的纸巾将橡胶圈直接放在头骨上。最后一次清洁戒指内部。加入温热的 PBS 以完全浸入颅骨。
然后将立体定向支架放在物镜下方。鼠标就位后，使用直接透射的显微镜目镜观察头骨，并将其大致放置在显微镜视野中。在成像软件窗口的左上角，单击 live acquisition。
使用软件中的显微镜方向控制，组织的实时扫描将出现在窗口中间。找到具有 CFP 和 rod domine 信号的区域以调整焦距。然后将激光功率设置为最小值，以获得最佳信噪比，同时将光损伤降至最低。
接下来，在软件中，单击通道选项卡并增加每个 NDD 的 PMT 的增益功率，以减少照片漂白和照片损坏，然后单击相应的选项卡，将采集设置设置为单次扫描，像素停留时间为 1.58 微秒，分辨率为 512 x 512 像素，放大倍率为 1.5。设置记录参数后，单击实时采集命令并检查组织以选择要实时监测的所需 x、y、Z 视野。在这里，选择一个包括维管区和实质区域的区域。
接下来，保存或注册位置选项卡中显示的字段的 X、Y、Z 坐标。单击添加。对最多三个附加字段重复此过程，以注册所有感兴趣的坐标。
坐标将出现在指示软件旁边的位置选项卡上。要捕获三个 DZ 图像堆栈，请单击软件中位置选项卡中的移动到以转到第一个注册位置，然后在软件左上角的框中选择 Zack。这将打开 Z 堆栈选项卡，移动到最高的 Z 位置，并相应地调整激光功率。
单击 set last（最后设置），然后移动到最深的位置。调整激光功率。然后点击 set 先。
堆栈分析的厚度应适应快速研究的细胞。移动的单元格会很快离开法语，因此您需要获得更厚的堆栈。然后你收购缓慢移动的细胞。
在左上角的框中，选择时间序列命令以打开时间序列选项卡。设置周期数和时间间隔。在这里，将每 30 秒采集一个体积，持续 60 个周期。
这表示 30 分钟的实时时间。要在主窗口中开始延时成像，请在整个过程中选择"开始实验"，继续监测动物以确保其失去知觉。还要确保物镜正确浸入。
捕获序列后，使用移液器加入温热的 PBS。然后开始第二次 30 分钟的采集。如果在采集过程中看到信号进行性消失，请检查 PBS 泄漏。
一旦录制了所有需要的视频，按照随附文件中的描述进行数据分析，以通过活体成像研究骨髓生理学，将 Mac 蓝色转基因小鼠注射 200 万道尔顿棒多米葡聚糖，并通过两个光子激光扫描显微镜成像。如本视频所示，在所得显微照片中，用 200 万道尔顿棒多胺葡聚糖染色的脉管系统显示为红色骨头，蓝色显示通过二次谐波产生可视化。以青色显示的 ECFP 阳性单核细胞位于实质生态位内，实质生态位被视为脉管系统和骨骼之间的暗区，以及血管内。
为了计算单个细胞的轨迹，进行了延时成像。该视频显示了实质单核细胞的迁移行为。ECFP 信号为青色，每个红点的迁移路径显示为绿色。
在这里，可以看到血管单核细胞的迁移行为。这些数据可用于计算单元的平均速度和均方位移。请注意，与实质单核细胞相比，血管单核细胞表现出增加的位移和增加的速度。
看完这个视频，你应该对如何使用两张照片成像在体内追踪小鼠骨髓单核细胞的显影有了很好的了解。这项技术为免疫学领域的研究人员探索骨髓中的细胞迁移和相互作用铺平了道路，骨髓是造血的一个非常重要的部位，但也代表了抗原启动和免疫记忆等其他基本功能。
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概述
本研究聚焦于使用双光子成像技术对活体小鼠颅骨髓中单核细胞迁移的可视化。该程序旨在阐明稳态和化疗后单核细胞动员的机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 骨髓生物学
- 体内成像技术
背景
- 单核细胞对于先天免疫至关重要。
- 它们在周围单核吞噬系统的更新中发挥重要作用。
- 在炎症期间理解其动员至关重要。
- 实时成像可以提供对这些过程的洞察。
研究目的
- 对小鼠颅骨髓中单核细胞迁移进行可视化。
- 研究单核细胞动员的机制。
- 研究化疗后单核细胞行为的变化。
使用的方法
- 小鼠麻醉和血管标记使用荧光素葡聚糖。
- 从顶骨到额骨的头皮去除。
- 使用手术胶将橡胶环应用于颅骨。
- 多光子显微镜用于随时间跟踪荧光细胞。
主要结果
- 成功实现对单核细胞迁移的实时可视化。
- 对稳态中动员机制的洞察。
- 化疗对单核细胞行为的潜在影响。
- 对免疫血液学领域的贡献。
结论
- 该程序有效地展示了体内单核细胞动力学。
- 发现可能增强对免疫反应的理解。
- 实时成像是未来研究的宝贵工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time multiphoton imaging of bone marrow monocytes enables direct visualization of immune cell trafficking and interactions within a physiologically relevant 3D environment. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence at the target validation stage, informing early portfolio decisions in immunology and inflammation research. Quantitative tracking of monocyte dynamics provides actionable insights for translational continuity from discovery through preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of monocyte trafficking mechanisms under steady-state and inflammatory conditions.
- Supports functional validation of myeloid-specific targets using in vivo quantitative imaging.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell migration pathways and interactions.
- Provides predictive confidence for target selection in immune modulation programs.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vivo imaging systems for downstream compound evaluation.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of cell motility and interaction metrics.
- Supports assay standardization for comparative studies across disease models.
- Enables scalable imaging workflows adaptable to additional fluorescent reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant immune cell trafficking and infiltration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical biomarker development.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular responses to perturbations.
- Supports translational biomarker identification through real-time cell tracking outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo imaging method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven interrogation of immune cell dynamics in native tissue environments.
- Discovery Biology: Quantifies monocyte migration and interaction to clarify immune cell function and trafficking pathways.
- Screening: Provides standardized, reproducible imaging outputs for evaluating compound effects on cell motility.
- Analytics: Generates quantitative metrics such as mean velocity and displacement for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other bone marrow cell subsets and fluorescent reporters for broader portfolio impact.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell trafficking studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging workflows with reproducible quantitative outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of immune modulation programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program knowledge transfer in immunology R&D.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton microscopy and in vivo imaging techniques.
- Demands specialized instrumentation, including multi-channel detectors and precise temperature control.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various fluorescent reporters for different cell subsets, supporting model flexibility.
- Imaging depth and signal stability may limit throughput and require optimization for specific applications.
