Name: 对白细胞从流程的分析招聘基质细胞的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 了解间充质基质细胞如何通过体外流动模型调控炎症期间中性粒细胞从血管内皮细胞的招募过程。该方法揭示了基质细胞与内皮细胞相互作用抑制白细胞粘附的分子机制。

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脐带样本的收集得到了伯明翰妇女保健国家医疗服务体系信托基金的协助。HMM 获得了英国关节炎研究基金会职业发展奖学金（19899）以及伯明翰大学健康系统科学项目（5212）的支持。

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+on+endothelium+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration.</a> Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).</li>
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<li>McGettrick, H. M., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+different+sites+may+promote+or+inhibit+recruitment+of+flowing+lymphocytes+by+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells.</a> European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).</li>
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<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+differentially+regulate+neutrophil+and+lymphocyte+recruitment+through+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium.</a> Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).</li>
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<li>Filer, A., Parsonage, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+survival+of+leukocyte+subsets+mediated+by+synovial%2C+bone+marrow%2C+and+skin+fibroblasts%3A+site-specific+versus+activation-dependent+survival+of+T+cells+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils.</a> Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).</li>
<li>Lally, F., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+neutrophil+recruitment+in+a+coculture+model+of+the+rheumatoid+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).</li>
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<li>Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Pathology+of+Atherosclerosis+Smooth+Muscle+Cells+Prime+Cocultured+Endothelial+Cells+for+Enhanced+Leukocyte+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion.</a> Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).</li>
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<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stromal+cells+on+lymphocyte+adhesion+and+migration+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells.</a> Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).</li>
<li>Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+assays+of+cell+adhesion+relevant+to+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature.</a> Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).</li>
<li>Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effects+of+stromal+cells+on+the+migration+of+lymphocytes+into+and+through+inflamed+tissue+using+3-D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models.</a> Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在此我们描述两种 体外 用于研究炎症内皮招募循环中性粒细胞的“血管”模型。这些模型的一个主要优势在于能够按顺序分析白细胞黏附级联反应的每一步骤，正如其在体内发生的过程一样 体内我们先前观察到中性粒细胞在TNFα刺激的内皮细胞上的黏附及跨内皮迁移呈剂量依赖性增加。9,29我们还描述了如何调整这两种模型以研究基质细胞对白细胞募集的影响。在此，间充质干细胞（MSC）与内皮细胞（EC）在Ibidi微孔载片中或在多孔滤膜的相对两侧进行共培养。这种设置允许两种细胞类型相互交流，从而改变彼此的表型和应答反应。我们在此以及先前的研究中已证实23，间充质干细胞的存在抑制了中性粒细胞对TNFα刺激的内皮细胞的黏附。这表明基质细胞可调节内皮细胞对细胞因子的反应，进而改变循环白细胞的募集。
除了上述模型外，Cellix Biochips、Bioflux 培养板和 Glyotech 平行板流动腔是市面上可购得的流动通道系统，可为内皮细胞的培养及白细胞募集的观察提供表面。在所有系统中，建立内皮细胞培养并进行基于流动的黏附实验时，均...

炎症是对微生物感染或组织损伤的一种保护性反应，其消退过程需要对白细胞进入和离开炎症组织进行严格调控1,2。血管内皮细胞（EC）、循环白细胞与组织驻留的基质细胞之间的相互作用，对于协调这一过程至关重要3。然而，白细胞的失控性募集及其清除效率低下，是慢性炎症性疾病发生发展的基础4。目前，人们对健康与疾病状态下白细胞募集过程的理解仍不完善，亟需建立更为可靠的模型来分析这一过程。
白细胞从血液中通过后微静脉血管内皮细胞（EC）被募集的机制已有较为详尽的描述1,2,5。循环中的白细胞被炎症内皮细胞表面上调表达的特异性受体（例如，VCAM-1、E-选择素、P-选择素）捕获。这些短暂的相互作用使白细胞能够与内皮或间质来源的表面结合型趋化因子及脂质衍生物介质相互作用，从而激活白细胞表面表达的整合素6-11。这一过程继而稳定了白细胞的黏附，并驱动其穿越内皮进入组织12-15。在组织内部，被募集的白细胞受到间质来源因子的影响，从而调控其迁移能力、功能及存活16,17。越来越多的证据强烈表明，白细胞在募集过程的每一阶段所接收到的信号，都会为其进入下一阶段做好准备。然而，目前对白细胞募集过程的理解仍不完整，关于调控白细胞在组织内运动的组分，所知甚少。
在伯明翰，我们已开发出多种用于研究白细胞从流动状态中被募集的体外“血管”模型9,18,19。目前我们认识到，血管内皮细胞（EC）可作为白细胞募集的即时调控者，响应其局部微环境的变化。具体而言，组织驻留的基质细胞可通过与邻近血管内皮细胞进行“对话”，从而主动调节炎症反应，并影响内皮细胞在白细胞募集中的作用3。我们先前已证实，不同类型的基质细胞能够以组织特异性的方式调节内皮细胞支持白细胞黏附和迁移的能力，且这些效应在慢性疾病中会发生改变13,16,20,21。因此，基质细胞建立了定义每种炎症反应背景的组织“地址码”22。最近，我们进一步证明，骨髓来源的间充质干细胞（BMMSC）可强烈抑制内皮细胞对细胞因子的反应，从而减少中性粒细胞和淋巴细胞的募集23。
阐明的招募机制 体外 主要采用了包含单一细胞类型的检测方法（例如， EC) 或单独的蛋白质。然而，这些研究并未考虑局部组织环境的影响（即， 基质细胞对白细胞募集及其随后迁移进入组织的影响。本文描述了两种基于流体的共培养方法，其中基质细胞（特别是间充质干细胞，MSC）与内皮细胞（EC）共培养23此类模型使我们能够研究基质细胞对内皮细胞反应的影响，特别是其在支持白细胞从流动状态下募集方面的能力。

<table><tbody><tr><td>胶原酶 Ia 型</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>用 10 ml PBS 稀释，得到终浓度为 10 mg/ml。分装成 1 ml 每份，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>含氯化钙和氯化镁。保持无菌，室温保存。</td></tr><tr><td>1X M199 培养基</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td>4 &amp;deg;C 保存。加入 500 ml M199 培养基瓶中。</td></tr><tr><td>人表皮生长因子</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>分装成 10 &amp;micro;l 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>FCS 必须进行批次测试，以确保分离的内皮细胞（EC）的生长和活力。56 &amp;deg;C 热灭活。分装成 10 ml 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>药效强，但一周内会变质产生毒性，因此必须每周新鲜配制完全 HUVEC 培养基。分装成 1 ml 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td>储备液溶于乙醇中。分装成 10 &amp;micro;l 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td>用 PBS 稀释储备液至终浓度为 100 mg/ml。分装成 100 &amp;micro;l 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma</td><td>H3631</td><td>用 PBS 稀释储备液至终浓度为 20,000 U/ml。分装成 100 &amp;micro;l 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>用于 50 ml 离心管的 100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Scientific Lab Supplies (SLS)</td><td>352360</td><td>也可使用其他市售的细胞筛（例如 Greiner bio-one）。</td></tr><tr><td>低糖 DMEM 培养基</td><td>Biosera</td><td>LM-D1102/500</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素混合液</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>分装成 1 ml 每份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>25 cc 组织培养瓶</td><td>SLS</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>75 cc 组织培养瓶</td><td>SLS</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>骨髓间充质干细胞冻存管</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>收到后立即存于液氮中。细胞到达时为第 2 代，但记为第 0 代。扩增至第 3 代后冻存于液氮中以备后续使用。</td></tr><tr><td>间充质干细胞生长培养基（MSCGM）</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。进行 Cell Tracker Green 染色时，使用不含 FCS 的培养基。</td></tr><tr><td>EDTA（0.02%）溶液</td><td>Sigma</td><td>E8008</td><td>4 &amp;deg;C 保存。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶溶液</td><td>Sigma</td><td>T4424</td><td>分装成 2 ml 每份，-20 &amp;deg;C 保存。室温解冻后立即使用。</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Greiner bio-one</td><td>2019-02</td><td>加入细胞悬液前保持冰上放置。</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冻存容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>室温保存。加入含细胞的冻存管后，于 -80 &amp;deg;C 保存 24 小时，再转移至液氮中。</td></tr><tr><td>Ibidi u-Slide VI（0.4），经组织培养处理，无菌</td><td>Ibidi</td><td>IB-80606</td><td>替代型号包括玻璃毛细管、Cellix Biochips（www.cellixltd.com）、BioFlux 培养板（www.fluxionbio.com/bioflux/）和 GlycoTech 平行板流动腔（http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html）。</td></tr><tr><td>Cell tracker green 荧光染料</td><td>Life technologies</td><td>C2925</td><td>分装成 5 &amp;micro;l 每份，-20 &amp;deg;C 保存。用 5 ml 预热至 37 &amp;deg;C 的 MSCGM 稀释。</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>也可使用血细胞计数板。</td></tr><tr><td>Cellometer auto T4 细胞计数仪</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4-203-0238</td><td></td></tr><tr><td>肿瘤坏死因子 &amp;alpha;（TNF&amp;alpha;）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA-100</td><td>用 PBS 稀释储备液至终浓度为 100,000 U/ml。分装成 10 &amp;micro;l 每份，-80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>6 孔，0.4 &amp;micro;m PET Transwell 小室</td><td>SLS</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>含 K2-EDTA 的 10 ml 采血管</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>4 &amp;deg;C 保存。使用前恢复至室温。</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>4 &amp;deg;C 保存。使用前恢复至室温。</td></tr><tr><td>10 ml 圆底试管</td><td>Appleton Woods</td><td>SC211 142 AS</td><td></td></tr><tr><td>7.5% BSA 第 V 组分溶液</td><td>Life technologies</td><td>15260-037</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>20 ml Plastipak 注射器</td><td>BD falcon</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Plastipak 注射器</td><td>BD falcon</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Plastipak 注射器</td><td>BD falcon</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>3M 低致敏性手术胶带，9 m × 2.5 cm</td><td>Micropore</td><td>1530-1</td><td>用于将注射器固定在有机玻璃腔室壁上。</td></tr><tr><td>硅胶管，内径/外径（ID/OD）为 1/3 mm（细管）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68854</td><td>将硅胶管剪裁至合适长度。所有直接连接至电子微阀的管路必须使用细管。</td></tr><tr><td>硅胶管，内径/外径（ID/OD）为 2/4 mm（粗管）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68855</td><td></td></tr><tr><td>Portex Blue Line 压力测量管</td><td>Smiths</td><td>200/495/200</td><td>连接至注射泵的管路。</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>BOC Ohmeda AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于泵的 50 ml 玻璃注射器</td><td>Popper Micromate</td><td>550962</td><td>使用前必须排气，确保无气泡。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Raymond A Lamb</td><td></td><td>定制 26 × 76 mm 盖玻片。批号 2440980。</td></tr><tr><td>Parafilm 密封垫圈</td><td>American National Can Company</td><td></td><td>使用铝制模板裁剪 26 × 76 mm 的 Parafilm 片，再用 10a 手术刀片切出 20 × 4 mm 的槽口。垫圈厚度约为 133 &amp;micro;m。</td></tr><tr><td>两块有机玻璃平行板</td><td>Wolfson Applied Technology Laboratory</td><td></td><td>特制腔室，由 8 个螺丝固定两块平行板。下板中央设有观察窗，并铣出浅槽以容纳盖玻片、滤膜和垫圈。上板设有进样口和出样口，正对流道。</td></tr><tr><td>电子三通微阀，最小死体积</td><td>Lee Products Ltd.</td><td>LFYA1226032H</td><td>电子连接至 12 伏直流电源。</td></tr><tr><td>输注/抽取用注射泵（PHD2000）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2001</td><td>设定直径为 29 mm，并设置补液（流速）速率。</td></tr><tr><td>L 形连接器</td><td>Labhut</td><td>LE876</td><td>用于连接 Ibidi 微流控载片通道的进样口和出样口。</td></tr><tr><td>视频摄像机</td><td>Qimaging</td><td>01-QIC-F-M-12-C</td><td>连接至计算机，可记录数字视频。</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td>Media Cybernetics</td><td>41N70000-61592</td><td>用于数据分析。手动标记表现出不同行为的细胞。追踪细胞以分析滚动和迁移速度。</td></tr><tr><td colspan="4">有关本实验所用试剂的危险性详情，请参阅产品说明书。</td></tr></tbody></table>

分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

基质细胞通过与邻近内皮细胞的相互作用，在炎症过程中调控循环白细胞的募集。本文描述了两种 体外 用于研究炎症内皮细胞从流动中募集循环中性粒细胞的“血管”模型。这些模型的一个主要优势在于能够按顺序分析白细胞黏附级联反应的每一步骤，正如其在体内实际发生的过程一样 体内我们还描述了如何调整这两种模型以研究基质细胞（在此为间充质干细胞，MSC）在调控白细胞募集中的作用。
将原代内皮细胞单独培养，或与人源间充质干细胞（MSC）在Ibidi微孔板上直接接触共培养，或在Transwell小室的相对两侧进行非接触共培养，培养时间为24小时。随后，用肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激细胞4小时，并将其用于基于流动的黏附实验。将中性粒细胞团以脉冲形式灌注流经内皮层，持续4分钟。通过相差显微镜观察流动中性粒细胞的捕获过程及其与内皮细胞的相互作用。
在两种模型中，细胞因子刺激均以剂量依赖性方式增强了内皮细胞对流动中性粒细胞的招募。对已招募中性粒细胞行为的分析显示，其滚动现象随剂量增加而减少，而穿过内皮细胞的跨内皮迁移则随剂量增加而增强。在共培养条件下，间充质干细胞（MSC）抑制了中性粒细胞在TNFα刺激的内皮细胞上的黏附。
我们基于流体的黏附模型可模拟白细胞从循环系统中被募集的初始阶段。除了白细胞外，这些模型还可用于研究其他细胞类型的募集过程，例如治疗性输入的间充质干细胞（MSC）或循环肿瘤细胞。我们的多层共培养模型表明，MSC会与血管内皮细胞相互作用，从而改变内皮细胞对促炎性细胞因子的反应，进而影响中性粒细胞的募集。未来还需利用此类模型进一步研究来自不同组织和不同生理病理条件（如炎症性疾病或癌症）的基质细胞如何在炎症过程中影响白细胞的募集。

首先，我们利用Ibidi微载玻片模型分析了用TNFα刺激内皮细胞（EC）对从流动中募集中性粒细胞的影响（第7–9节）。在未添加TNFα的情况下，几乎没有任何中性粒细胞黏附到内皮单层上（图2A）。这一结果符合预期，因为未经处理或处于静息状态的内皮细胞不表达支持中性粒细胞结合所必需的黏附分子（选择素）或趋化因子25,26。相比之下，细胞因子刺激以剂量依赖的方式显著增加了中性粒细胞对内皮层的黏附（图2A）。在实验过程中，黏附通常保持稳定。若白细胞与未经处理的内皮发生结合，表明内皮细胞可能已被激活（例如，在培养过程中被脂多糖LPS污染），和/或中性粒细胞在分离过程中被激活。事实上，已有研究表明LPS可上调内皮细胞表面E-选择素、ICAM-1和VCAM-1的表达25–27，从而使其能够结合中性粒细胞。
在分析募集的中性粒细胞行为时，我们通常观察到中性粒细胞滚动比例呈剂量依赖性降低（图2B），同时伴...

炎症内皮从血流中募集白细胞的能力受到间充质基质细胞的调控。我们描述了两种 体外 结合原代人源细胞的模型，可用于评估中性粒细胞从流动状态中的募集，并研究间充质基质细胞在调控该过程中的作用。

基质细胞通过与邻近内皮细胞的相互作用，在炎症过程中调控循环白细胞的募集。本文中……

本实验的总体目标是研究组织驻留细胞如何影响血管内皮细胞在炎症过程中募集白细胞的能力。该目标通过建立内皮细胞与间充质干细胞的共培养体系来实现，共培养采用两种体外血管模型之一：微载玻片模型或滤膜模型。这些共培养体系在进行流式分析前会先用细胞因子处理。基于流动的 aian 系统随后以逐步方式组装，根据所使用的模型系统进行相应调整。最后一步是将白细胞灌注到内皮细胞上，观察其从流动中被募集的情况以及后续行为。最终，这些基于流动的多细胞黏附实验表明，在炎症过程中，间充质干细胞与内皮细胞之间的相互作用可抑制中性粒细胞的募集。该方法有助于解答白细胞迁移领域的关键问题，例如组织驻留细胞（如间充质干细胞）如何调节这一过程？在慢性炎症或癌症等疾病状态下，这一过程是否发生变化？我们能否利用这些知识来帮助开发新的治疗策略？首先，按照文本方案中所述，使用微载玻片模型或滤膜模型建立内皮细胞与间充质干细胞的共培养体系，以组装流动系统。首先打开加热器并将其设定为 37 摄氏度。然后将一个已移除活塞的 20 毫升注射器以及一个 5 毫升注射器连接到三通阀上。接下来测量并截取一段长约 2.4 毫米的管路，其长度约为阀门与三通阀之间的距离。剪取一段8至10毫米长的1.3毫米管，插入粗管的一端。将粗管的一端连接至三通旋塞阀，并将细管连接至电子三通微阀的一个端口，以形成洗涤储液管路。然后使用微孔胶带将旋塞连接到有机玻璃腔室上。接着，截取一段6至8毫米长的粗细双层套管，并将细管插入粗管的一端。将粗管端连接到一个已移除活塞的2毫升注射器上。现在将2毫升注射器的细管端连接到电子微阀的一个端口上，以构成样品储液槽。接着测量并截取一段长度等于微阀与显微镜载物台中心之间距离的细管。对于微载玻片型号，将一段8至10毫米长的粗管连接到细管的末端。然后将一个L形接头连接到粗管末端，用于连接显微载片或滤器模型。将一段8至10毫米长的Portex蓝色导管（用于连接压力计）连接到细管末端。接下来，将细管的一端连接到微型阀门上。该细管将作为清洗液和样品储液池的公共出口。用含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液填充储液池。简化的 PBSA 通过将 PBSA 流经管道以去除任何气泡来预处理管路，然后将测压管连接到一个 50 毫升的玻璃注射器上。而微型载片模型仅需在通向玻璃注射器的测压管末端连接一段 10 至 12 毫米长的粗管。将一个 L 形连接头安装在粗管的末端。用10毫升PBSA充满注射器以进行预处理。将注射器倒置，使连接管路的一端朝上，排出所有气泡，然后补充五毫升PBSA。最后，将玻璃注射器放入注射泵中，用于输注和回抽。设置玻璃注射器的补充速率和直径，以制备用于流动实验的微滑片。将微滑片放置在倒置相差显微镜的载物台上。转动三通阀，使PBSA流经进样管路。将L形连接器连接到微流通道的入口端口。然后将来自注射泵的L形连接器插入通道的出口端口。清除滴落在微流载玻片上的任何PBSA溶液。或者，对于滤膜模型，首先使用金属模板将一片封口膜裁剪成与玻璃盖玻片相同尺寸。然后使用金属模板在封口膜上切割出一个20毫米×4毫米的槽，以形成流动通道。使用聚苯乙烯垫圈在玻璃盖玻片上标记出流动通道的位置。将六个滤膜的边缘与玻璃盖玻片对齐，确保滤膜覆盖住流动通道的标记。使用10号手术刀小心地将滤膜裁切出来。接下来，小心地用对二氯苯密封垫圈覆盖滤膜，确保流道槽位于滤膜中央。用一块干净的纸巾轻轻按压，排出所有气泡。然后将盖玻片放入亚克力流动室底板的凹槽中。将顶部的有机玻璃板置于垫圈上方，并用螺丝将两块板固定在一起。旋转三通阀，使 PBSA 清洗缓冲液流经阀门。然后将压力计管路连接到顶部有机玻璃板的进样口。通过流道运行 PBSA，使气泡得以通过。然后将注射泵的测压管连接到有机玻璃板的出口端口。倾斜腔室上层板，使滴落的 PBSA 流出。最后，将腔室置于倒置相差显微镜的载物台上，调节焦距以观察滤膜上方的内皮细胞，以便将白细胞灌注到内皮细胞上。将注射泵设置为重新填充，并在焦距调节完毕后按下运行键。为观察内皮细胞单层，向样品储液槽中加入2 mL纯化的中性粒细胞，并静置预热2分钟。随后用 PBSA 冲洗内皮层两分钟。打开阀门，使中性粒细胞流经内皮层。持续输送中性粒细胞团块四分钟。关闭阀门，并从清洗储液槽中持续灌注PBSA直至实验结束。实验过程中需确保气泡在任何阶段均不通过系统，因为气泡会破坏内皮细胞单层，导致黏附的中性粒细胞脱落。使用数字图像采集软件，在中性粒细胞流动期间或灌注结束后记录中性粒细胞的募集情况。通过将物镜移至入口端口处的通道边缘并确定端口的中心位置，从而找到通道的中心。在流动通道中心区域或中性粒细胞流动期间，至少对五个到十个视野进行数字记录。每10秒拍摄一次单个视野的图像，持续1分钟，然后沿通道移动，再记录另一个视野1分钟。在团注持续期间重复此过程，以记录灌注后的数据。在流动通道中心区域选取5至10个视野，进行为期10秒的记录，以评估白细胞行为。在10秒的时间间隔内，每秒采集一次图像。这可以留出足够时间捕获流动中的细胞，并分析黏附性中性粒细胞的行为。记录一个至少包含10个已迁移中性粒细胞的视野，持续五分钟，每30秒拍摄一次图像。可用于计算迁移细胞的迁移速度，并另记录一系列每10秒一个视野的图像。这使得中性粒细胞有足够时间迁移穿过内皮单层。最后，停止注射泵，移除出口管路，然后移除入口管路，拆卸流室，并用 PBSA 冲洗样品储液池；在进行后续的白细胞募集与行为分析前，对其他滤膜和微流滑片通道重复上述步骤，分析方法见文本方案所述。在微流滑片模型中，经肿瘤坏死因子α细胞因子刺激后，中性粒细胞对内皮的黏附显著增强，且呈剂量依赖性。此外，观察到中性粒细胞在内皮表面滚动的比例随 TNF-α 剂量增加而降低。这反映在 A-T-N-F-L 中剂量依赖性增加以及穿过内皮单层的中性粒细胞比例上升，即发生跨内皮迁移。在基于滤膜的流式实验中也观察到类似结果。例如，TNFα刺激以剂量依赖性方式增加了中性粒细胞的黏附。与单独培养的内皮细胞相比，将内皮细胞与骨髓来源的间充质干细胞共培养可显著减少中性粒细胞的黏附。内皮细胞单独培养时，结果符合微载玻片模型的预期。同样，当使用基于滤膜的模型时，也观察到了类似的效果，即与单层培养相比，共培养中的黏附现象减少。观看本视频后，您应能充分理解如何研究间质细胞如何与内皮细胞相互作用，从而影响炎症过程中白细胞的募集。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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