分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响

本实验的总体目标是研究组织驻留细胞如何影响血管内皮细胞在炎症过程中募集白细胞的能力。该目标通过建立内皮细胞与间充质干细胞的共培养体系来实现，共培养采用两种体外血管模型之一：微载玻片模型或滤膜模型。这些共培养体系在进行流式分析前会先用细胞因子处理。

基于流动的 aian 系统随后以逐步方式组装，根据所使用的模型系统进行相应调整。最后一步是将白细胞灌注到内皮细胞上，观察其从流动中被募集的情况以及后续行为。最终，这些基于流动的多细胞黏附实验表明，在炎症过程中，间充质干细胞与内皮细胞之间的相互作用可抑制中性粒细胞的募集。

该方法有助于解答白细胞迁移领域的关键问题，例如组织驻留细胞（如间充质干细胞）如何调节这一过程？在慢性炎症或癌症等疾病状态下，这一过程是否发生变化？我们能否利用这些知识来帮助开发新的治疗策略？首先，按照文本方案中所述，使用微载玻片模型或滤膜模型建立内皮细胞与间充质干细胞的共培养体系，以组装流动系统。

首先打开加热器并将其设定为 37 摄氏度。然后将一个已移除活塞的 20 毫升注射器以及一个 5 毫升注射器连接到三通阀上。接下来测量并截取一段长约 2.4 毫米的管路，其长度约为阀门与三通阀之间的距离。

剪取一段8至10毫米长的1.3毫米管，插入粗管的一端。将粗管的一端连接至三通旋塞阀，并将细管连接至电子三通微阀的一个端口，以形成洗涤储液管路。

然后使用微孔胶带将旋塞连接到有机玻璃腔室上。接着，截取一段6至8毫米长的粗细双层套管，并将细管插入粗管的一端。将粗管端连接到一个已移除活塞的2毫升注射器上。

现在将2毫升注射器的细管端连接到电子微阀的一个端口上，以构成样品储液槽。接着测量并截取一段长度等于微阀与显微镜载物台中心之间距离的细管。对于微载玻片型号，将一段8至10毫米长的粗管连接到细管的末端。

然后将一个L形接头连接到粗管末端，用于连接显微载片或滤器模型。将一段8至10毫米长的Portex蓝色导管（用于连接压力计）连接到细管末端。

接下来，将细管的一端连接到微型阀门上。该细管将作为清洗液和样品储液池的公共出口。用含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液填充储液池。

简化的 PBSA 通过将 PBSA 流经管道以去除任何气泡来预处理管路，然后将测压管连接到一个 50 毫升的玻璃注射器上。而微型载片模型仅需在通向玻璃注射器的测压管末端连接一段 10 至 12 毫米长的粗管。将一个 L 形连接头安装在粗管的末端。

用10毫升PBSA充满注射器以进行预处理。将注射器倒置，使连接管路的一端朝上，排出所有气泡，然后补充五毫升PBSA。最后，将玻璃注射器放入注射泵中，用于输注和回抽。

设置玻璃注射器的补充速率和直径，以制备用于流动实验的微滑片。将微滑片放置在倒置相差显微镜的载物台上。转动三通阀，使PBSA流经进样管路。

将L形连接器连接到微流通道的入口端口。然后将来自注射泵的L形连接器插入通道的出口端口。清除滴落在微流载玻片上的任何PBSA溶液。

或者，对于滤膜模型，首先使用金属模板将一片封口膜裁剪成与玻璃盖玻片相同尺寸。然后使用金属模板在封口膜上切割出一个20毫米×4毫米的槽，以形成流动通道。使用聚苯乙烯垫圈在玻璃盖玻片上标记出流动通道的位置。

将六个滤膜的边缘与玻璃盖玻片对齐，确保滤膜覆盖住流动通道的标记。使用10号手术刀小心地将滤膜裁切出来。

接下来，小心地用对二氯苯密封垫圈覆盖滤膜，确保流道槽位于滤膜中央。用一块干净的纸巾轻轻按压，排出所有气泡。然后将盖玻片放入亚克力流动室底板的凹槽中。

将顶部的有机玻璃板置于垫圈上方，并用螺丝将两块板固定在一起。旋转三通阀，使 PBSA 清洗缓冲液流经阀门。然后将压力计管路连接到顶部有机玻璃板的进样口。

通过流道运行 PBSA，使气泡得以通过。然后将注射泵的测压管连接到有机玻璃板的出口端口。倾斜腔室上层板，使滴落的 PBSA 流出。

最后，将腔室置于倒置相差显微镜的载物台上，调节焦距以观察滤膜上方的内皮细胞，以便将白细胞灌注到内皮细胞上。将注射泵设置为重新填充，并在焦距调节完毕后按下运行键。为观察内皮细胞单层，向样品储液槽中加入2 mL纯化的中性粒细胞，并静置预热2分钟。

随后用 PBSA 冲洗内皮层两分钟。打开阀门，使中性粒细胞流经内皮层。持续输送中性粒细胞团块四分钟。

关闭阀门，并从清洗储液槽中持续灌注PBSA直至实验结束。实验过程中需确保气泡在任何阶段均不通过系统，因为气泡会破坏内皮细胞单层，导致黏附的中性粒细胞脱落。使用数字图像采集软件，在中性粒细胞流动期间或灌注结束后记录中性粒细胞的募集情况。

通过将物镜移至入口端口处的通道边缘并确定端口的中心位置，从而找到通道的中心。在流动通道中心区域或中性粒细胞流动期间，至少对五个到十个视野进行数字记录。每10秒拍摄一次单个视野的图像，持续1分钟，然后沿通道移动，再记录另一个视野1分钟。

在团注持续期间重复此过程，以记录灌注后的数据。在流动通道中心区域选取5至10个视野，进行为期10秒的记录，以评估白细胞行为。在10秒的时间间隔内，每秒采集一次图像。

这可以留出足够时间捕获流动中的细胞，并分析黏附性中性粒细胞的行为。记录一个至少包含10个已迁移中性粒细胞的视野，持续五分钟，每30秒拍摄一次图像。可用于计算迁移细胞的迁移速度，并另记录一系列每10秒一个视野的图像。

这使得中性粒细胞有足够时间迁移穿过内皮单层。最后，停止注射泵，移除出口管路，然后移除入口管路，拆卸流室，并用 PBSA 冲洗样品储液池；在进行后续的白细胞募集与行为分析前，对其他滤膜和微流滑片通道重复上述步骤，分析方法见文本方案所述。在微流滑片模型中，经肿瘤坏死因子α细胞因子刺激后，中性粒细胞对内皮的黏附显著增强，且呈剂量依赖性。

此外，观察到中性粒细胞在内皮表面滚动的比例随 TNF-α 剂量增加而降低。这反映在 A-T-N-F-L 中剂量依赖性增加以及穿过内皮单层的中性粒细胞比例上升，即发生跨内皮迁移。在基于滤膜的流式实验中也观察到类似结果。

例如，TNFα刺激以剂量依赖性方式增加了中性粒细胞的黏附。与单独培养的内皮细胞相比，将内皮细胞与骨髓来源的间充质干细胞共培养可显著减少中性粒细胞的黏附。内皮细胞单独培养时，结果符合微载玻片模型的预期。

同样，当使用基于滤膜的模型时，也观察到了类似的效果，即与单层培养相比，共培养中的黏附现象减少。观看本视频后，您应能充分理解如何研究间质细胞如何与内皮细胞相互作用，从而影响炎症过程中白细胞的募集。