蛋白质纯化技术，可以检测SUMO化修饰和芽殖酵母蛋白动粒和Ndc10泛素Ndc80的

该程序的总体目标是检测出芽酵母动力学核心蛋白 NDC 10 和 NDC 80 的模拟和泛素化。这是通过首先收获表达嘶嘶声标记的 SMT 3 和 MT 标记的 NDC 10 或 NDC 80 的酵母细胞，并从这些细胞中制备蛋白质提取物来实现的。第二步是纯化 hiss 标记的 SMT 三种偶联物，用于检测求和，或免疫沉淀 mik tagg 动力学核心蛋白，用于检测泛素化。

随后，通过 western blot 分析检测总和或泛素化。最终，NDC 10 和 NDC 80 的阶梯模式的存在证实了这些蛋白质是模拟和泛素化的。所描述的蛋白质纯化方法允许检测出芽酵母骶骨中 connico 蛋白 ND C 10 和 NDC 80 的模拟和泛素化。

我的 cci.该技术的主要优点是我们创建的菌株具有两个表位攻击，一个在测试蛋白质上，另一个允许检测模拟。使用这些标签可降低背景，因为使用多克隆血清时经常观察到的交叉反应性。

该程序的演示将由我实验室的研究员 Canero Uni 完成。将从先前制备的酵母细胞沉淀中提取感兴趣的蛋白质，并在零下 20 摄氏度下储存。复苏，将细胞悬浮在 0.5 毫升冰冷缓冲液中。

如果提取物用于使用镍丁腈、三乙酸或镍 NTA 超流珠的沉降测定，请使用 Guine 缓冲液。如果提取物用于免疫沉淀，请使用缓冲液 A。始终将试管放在冰上。

将细胞悬液转移至 2 mL。将 2 个盖拧到每根试管上。添加的玻璃珠体积等于细胞悬液珠的体积。

室温下，在迷你微珠打浆器中将细胞打浆 2 分钟，然后将试管置于冰上 2 至 3 分钟。重复珠子敲打和糖霜 3 次。在 4 摄氏度下高速涡旋 30 至 60 分钟。

通过在显微镜下观察检查细胞，以确保细胞被裂解。裂解的细胞将显示为黑暗的幽灵，并且没有边界或定义的形状。最好至少 80% 的细胞应该躺着。

接下来，使用图钉在管子底部刺穿一个孔。松散地盖上螺帽，然后将试管放入 15 mL 锥形管中。以 1000 倍 G 离心 1 分钟。

要收集裂解物，请将裂解物转移到微量离心管中，在 4 摄氏度下以 15， 000 倍 G 离心 30 分钟，以收集提取的蛋白质。使用蛋白质检测试剂盒测量提取的蛋白质的浓度后，将所有提取物归一化，使每种提取物含有相同量的蛋白质。用适当的缓冲液将总体积调至 1 mL。

从 50 OD 600 个细胞中获得大约 5 毫克的总蛋白。将 50 微升提取的蛋白质保存为全细胞提取物。剩余的 950 微升蛋白质提取物稍后将用于 MT 标记蛋白的蛋白质纯化或免疫沉淀。

将 50 微升 2 x laly 样品缓冲液添加到 50 微升全细胞提取物中。将样品在 100 摄氏度的加热块中孵育 3 到 5 分钟，然后通过 western blot 进行分析。通过制备纯化所需的镍 NTA 超流珠子来开始此过程。

获得低速离心 1 分钟所需的微珠量。去除上清液并用 PBS 洗涤珠子。加入 1 毫升 PBS，将试管顶部倒置，直到珠子重悬。

通过低速离心收集珠子并去除上清液。以这种方式清洗珠子总共五次。将珠子悬浮在一毫升几级缓冲液中，并将它们分装到与要处理的样品相对应的试管数量中。

通过低速离心收集珠子，并去除每个样品的上清液。加入 950 微升全细胞提取物。提前制备 100 μL 的珠子。

在 4 摄氏度的摇床上孵育至少 4 小时或过夜。在 4 摄氏度下以 800 至 1500 倍 G 离心 1 分钟。节省 50 微升的上清液。

向该上清液中加入 50 微升 2 x laly 样品缓冲液，并在 100 摄氏度下在加热块中孵育 3 至 5 分钟。每个样品 10 微升稍后将通过 Western blot 进行分析。在室温下，在摇床上用 1 毫升 Guine 缓冲液洗涤镍 NTA 超流微珠一次，持续 5 至 10 分钟。

接下来，用 1 毫升破碎缓冲液洗涤珠子 5 次，最后一次用断裂缓冲液洗涤后，将珠子重悬于 90 微升 2 x laly 样品缓冲液中。加入 10 微升一磨牙碘，以帮助将 his 标记的蛋白与镍 NT 解离。A 珠子在 100 摄氏度的加热块中孵育 3 到 5 分钟。然后涡旋，然后以 13， 000 倍 G 离心 30 秒。

将上清液转移到新试管中。要开始此程序，请通过低速离心获得必要量的抗 cmic aero 亲和凝胶抗体。去除上清液，用缓冲液 A 洗涤树脂加入 1 毫升缓冲液 A，并倒置至上，直到树脂重悬。

通过低速离心收集树脂并去除上清液。总共洗涤五次。将树脂悬浮在 1 毫升缓冲液 A 中，并分装到与待处理样品相对应的试管数量中。

通过低速离心收集树脂并去除上清液。将 950 μL 全细胞提取物添加到 25 μL 树脂中，第二天在 4 摄氏度的摇床上孵育过夜。在 4 摄氏度下以 800 至 1500 倍 G 离心 1 分钟。

节省 50 微升的上清液。向该上清液中加入 50 微升 2 x lam ly 样品缓冲液，并在 100 摄氏度下在加热块中孵育 3 至 5 分钟。用缓冲液洗涤树脂，加入 1 毫升缓冲液，上下倒置，直到树脂重悬。

通过低速离心收集树脂，并从最终洗涤中取出上清液后去除上清液。将树脂重悬于 100 μL sume 样品缓冲液中，在 100 摄氏度下在加热块中孵育 3 到 5 分钟。然后涡旋，然后以 13， 000 倍 G 离心 30 秒。

将上清液转移到新试管中。最后，加载从该协议收集的所有样品。在 SDS 页面中，用于 Western blot 分析的凝胶，表达多聚组胺标志标记的 SMT 3 或 HF SMT 3 和 MT 标记的 NDC 80 和 NDC 10 的酵母菌株用于检测动力学蛋白的模拟。

使用镍珠对 HF SMT 三种底物进行亲和纯化，并用 Anti-Flag 抗体进行检测。用抗 mic 抗体探测时，在 HF SMT 三种底物中检测到总和护城沟 NDC 80。在没有 HF SMT three 的对照菌株中不存在修饰蛋白表明 HF SMT three 与其靶蛋白之间相互作用的特异性。

此外，在 NOCO desole 处理的细胞中，NDC 80 和 NDC 10 的总和降低，以检测 NDC 80 和 NDC 10 的泛素化。Mick 标记的 ND C 80 或 ND C 10 被免疫沉淀，用抗 mic 和抗泛素抗体进行蛋白质印迹分析，全细胞提取物和上清液分析证实 NDC 80 M 和 NDC 10 M 免疫沉淀样品的表达用抗 MIC 探测显示多个高分子量条带，表明 NDC 80 和 NDC 10 包含翻译后修饰。用抗泛素探测的免疫沉淀样品的阶梯模式显示 ND C 80 和 ND C 10 是泛素化的。

用蛋白酶体抑制剂 MG 1 32 处理增强了 NDC 80 和 NDC 10 的阶梯模式。进一步确认这些代表多泛素化 看完这个视频后，你应该对可以检测交配和接种蝙蝠 NN 的蛋白质纯化技术有很好的了解。