一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

本实验的总体目标是检测芽殖酵母动粒核心蛋白 NDC10 和 NDC80 的类泛素化修饰（SUMO化）和泛素化修饰。首先收获表达HIS-FLAG标记的SMT3以及MYC标记的NDC10或NDC80的酵母细胞，并从中制备蛋白质提取物。第二步是纯化HIS-FLAG标记的SMT3结合物以检测SUMO化修饰，或通过免疫沉淀MYC标记的动粒核心蛋白以检测泛素化修饰。

随后，通过蛋白质印迹分析检测SUMO化或泛素化。最终，NDC10和NDC80出现梯形条带模式，表明这些蛋白发生了SUMO化和泛素化。所描述的蛋白质纯化方法能够检测出芽殖酵母sacro中connico蛋白NDC10和NDC80的SUMO化与泛素化。

我的cci。该技术的主要优势在于我们所构建的菌株具有两个表位标签，一个位于目标蛋白上，另一个可用于检测模拟过程。这些标签的使用减少了由于多克隆血清常出现的交叉反应而导致的背景干扰。

本实验操作将由我实验室的研究员 Canero Uni 演示。所需的目标蛋白将从先前制备并储存在零下 20 摄氏度的酵母细胞沉淀中提取。将细胞重悬于 0.5 毫升预冷缓冲液中。

如果提取物用于镍-次氮基三乙酸或镍-NTA superflow 琼脂糖珠的pull-down实验，请使用guine缓冲液；如果提取物用于免疫共沉淀，请使用缓冲液A。所有操作过程中，始终将离心管置于冰上。

将细胞悬液转移至2 mL。在每个试管上拧紧盖子。加入与细胞悬液等体积的玻璃珠。

在室温下使用微型珠磨机剧烈振荡细胞两分钟，然后将离心管置于冰上 2 至 3 分钟。重复珠磨和冰浴步骤三次。在 4°C 下高速涡旋振荡 30 至 60 分钟。

在显微镜下观察细胞，以确认细胞是否已裂解。裂解的细胞将呈现为深色的影子状，无明显边界或固定形态。理想情况下，至少应有80%的细胞被裂解。

接下来，使用图钉在管子底部穿一个小孔。将螺帽轻轻拧上，并将管子放入一个15毫升的锥形管中。在1000 × g 条件下离心1分钟。

为收集裂解液，将裂解液转移至微量离心管中，在4°C条件下以15,000 × g离心30分钟，以收集提取的蛋白质。使用蛋白检测试剂盒测定提取蛋白的浓度后，调整所有提取液使其包含相同量的蛋白质。用适当的缓冲液将总体积补至1毫升。

从50 OD 600的细胞中可获得约五毫克的总蛋白。将提取的蛋白中50微升保留作为全细胞提取物。剩余的950微升蛋白提取物将用于后续的蛋白纯化或MT标签蛋白的免疫沉淀。

向50微升全细胞裂解液中加入50微升2×上样缓冲液。在进行Western印迹分析前，将样品置于金属浴中100摄氏度孵育3至5分钟。首先准备纯化所需的镍-NTA Superflow凝胶珠，以开始该实验流程。

通过低速离心一分钟获取所需数量的磁珠。弃去上清液，并用 PBS 洗涤磁珠。加入一毫升 PBS，反复倒置试管，直至磁珠完全重悬。

通过低速离心收集珠子，并移除上清液。以该方法总共洗涤珠子五次。将珠子重悬于一毫升豚鼠缓冲液中，并根据待处理样品的数量分装至相应数量的离心管中。

通过低速离心收集珠子，并移除每个样品的上清液。向100微升珠子中加入950微升先前制备的全细胞提取物。

在4°C的摇床平台上孵育至少4小时或过夜。在4°C下以800至1500 × g离心1分钟。保留50 µL上清液。

向该上清液中加入50微升2×上样缓冲液，在金属浴中100摄氏度孵育3至5分钟。每个样品取10微升用于后续的蛋白质印迹分析。用1毫升洗脱缓冲液在室温下于摇床上洗涤镍-NTA Superflow琼脂糖微珠1次，每次5至10分钟。

随后，用1毫升裂解缓冲液将磁珠洗涤五次。最后一次用裂解缓冲液洗涤后，将磁珠重悬于90微升2×上样缓冲液中。加入10微升1摩尔的异丙醇，以促进His标签蛋白从镍NT.A磁珠上解离，然后在金属浴中100摄氏度孵育3至5分钟。涡旋振荡后，在13,000×g离心30秒。

将上清液转移至新的离心管中。开始此操作前，通过低速离心收集所需量的抗 cmic aero 亲和凝胶抗体。去除上清液，用缓冲液 A 洗涤树脂，加入一毫升缓冲液 A，上下颠倒混匀，直至树脂重新悬浮。

通过低速离心收集树脂，并去除上清液。总共洗涤五次。将树脂悬浮于1毫升缓冲液A中，并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。

通过低速离心收集树脂，并去除上清液。将950微升全细胞提取物加入25微升树脂中，于4°C在摇床上孵育过夜。次日，于4°C以800至1500 × g离心1分钟。

保留50微升上清液。向此上清液中加入50微升2× Laemmli样品缓冲液，在金属浴中100摄氏度孵育3至5分钟。用缓冲液A洗涤树脂，加入1毫升缓冲液A，颠倒混匀直至树脂重新悬浮。

低速离心收集树脂，并在最后一次洗涤去除上清液后，弃去上清液。将树脂重悬于100 µL上样缓冲液中，在加热块中100 °C孵育3至5分钟。涡旋混匀后，于13,000 ×g离心30秒。

将上清液转移至新的离心管中。最后，将本实验方案中收集的所有样品加入SDS-PAGE凝胶，用于Western blot分析。实验中使用的酵母菌株表达多聚组氨酸标签标记的SMT3或HF-SMT3，以及MT标签标记的NDC80和NDC10，以检测动粒相关蛋白的表达情况。

使用镍珠对HF SMT三号底物进行亲和纯化，并用抗Flag抗体进行检测。当使用抗Mic抗体探测时，在HF SMT三号底物中检测到发生SUMO修饰的NDC80。在不含HF SMT三号的对照菌株中未检测到修饰蛋白，表明HF SMT三号与其靶蛋白之间的相互作用具有特异性。

此外，在使用NOCO脱醇处理的细胞中，NDC 80和NDC 10的总和减少，以检测NDC 80和NDC 10的泛素化。将Mick标记的ND C 80或ND C 10进行免疫沉淀，并使用抗mic和抗泛素抗体进行蛋白质印迹分析。对全细胞提取物和上清液的分析证实了NDC 80 M和NDC 10 M的表达。用抗MIC抗体探测的免疫沉淀样品显示出多条高分子量条带，表明NDC 80和NDC 10含有翻译后修饰。用抗泛素抗体探测的免疫沉淀样品呈现出梯状条带模式，表明ND C 80和ND C 10发生了泛素化。

通过蛋白酶体抑制剂MG 132处理，增强了NDC 80和NDC 10的梯状条带模式。这进一步证实了这些条带代表多聚泛素化。在观看本视频后，您应能充分理解可用于检测蝙蝠NN蛋白修饰及疫苗化研究的蛋白质纯化技术。