Name: 蛋白质纯化技术，可以检测SUMO化修饰和芽殖酵母蛋白动粒和Ndc10泛素Ndc80的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学习蛋白质纯化技术以检测酿酒酵母动粒蛋白Ndc10和Ndc80的SUMO化修饰与泛素化修饰。该方法通过亲和纯化和免疫沉淀结合蛋白质印迹分析，可清晰观察到修饰后的梯状条带模式。

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感谢 Oliver Kerscher 博士提供的支持与建议，以及 Basrai 实验室成员对本文的支持和评论。本研究由美国国立卫生研究院院内研究计划资助。

1. 酵母细胞的培养
<ol>
	<li>在小型烧瓶中，将酵母细胞接种于 30 ml YPD 培养基（表 1）中，于 30 °C 摇床培养过夜。</li>
	<li>将细胞用 50 ml YPD 培养基稀释至 600 nm 处的光密度为 0.2（OD600 = 0.2），于 30 °C 摇床培养。</li>
	<li>继续培养至细胞在 600 nm 处的光密度达到 1.0（OD600 = 1.0）。</li>
	<li>将细胞以 2,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 40 ml 无菌水重悬细胞沉淀，以 2,000 × g 离心 5 分钟以洗涤细胞。弃去上清液，将细胞沉淀于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 蛋白质提取
<ol>
	<li>使用冰上预冷的胍缓冲液（0.5 ml，见表1）重悬细胞，用于Ni-NTA superflow磁珠的pull-down实验；或使用缓冲液A（见表1）进行免疫沉淀实验。操作过程中始终将离心管置于冰上。</li>
	<li>转移至2 ml螺口管中。</li>
	<li>加入等体积的玻璃珠（见材料表）。</li>
	<li>在微型珠磨仪（见材料表）中室温珠磨细胞2分钟，随后置于冰上2–3分钟。重复此步骤三次。</li>
	<li>在4 °C下高速涡旋振荡30–60分钟。通过显微镜观察细胞裂解情况，确保细胞已充分裂解。 
	注意：裂解后的细胞呈现为暗色“鬼影”状，无完整边界或明确形态。理想情况下，至少应有80%的细胞被裂解。</li>
	<li>用图钉在管底打孔，并将该管放入15 ml锥形收集管中（螺帽应保持松动）。</li>
	<li>以1,000 × g离心1分钟，收集裂解液。</li>
	<li>将裂解液转移至微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以15,000 × g离心30分钟，收集提取的蛋白质。</li>
	<li>使用蛋白定量试剂盒（见材料表）测定提取蛋白的浓度，并将所有样品调整至相同蛋白含量。用适当缓冲液补足总体积至1 ml。 
	注意：从50 OD600的细胞中通常可获得约5 mg总蛋白。</li>
	<li>保留50 µl（若步骤2.10中提取的总蛋白为5 mg，则含约250 µg蛋白）作为全细胞提取物（WCE）。加入50 µl 2× Laemmli上样缓冲液（表1），在金属浴中100 °C孵育3–5分钟。每样取10 µl上样于SDS-PAGE凝胶，进行Western Blot分析（第5节：Western blot分析）。</li>
</ol>
3. HF-Smt3 缀合物的纯化
<ol>
	<li>获取 Ni-NTA Superflow 珠（见表） 材料通过低速离心（800–1,500 × g，1 分钟）收集实验所需量的珠子（每份样品 100 µl）。移除上清液。</li>
	<li>用1 ml PBS（材料表）洗涤磁珠5次：将管子上下颠倒直至磁珠重新悬浮，低速离心收集磁珠，并移除上清液。</li>
	<li>将珠子悬浮于 1 ml 胍缓冲液中（表1) 并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。低速离心收集磁珠，弃上清液。通过倒置混匀磁珠。 
	注意：通过上下颠倒充分混匀珠子。</li>
	<li>每个样品中，将950 µl剩余的WCE（来自步骤2.11：蛋白质提取）加入100 µl Ni-NTA superflow beads中。</li>
	<li>在4 °C下于摇床上孵育至少4小时或过夜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 800-1,500 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>保留50 µl上清液（SUP）。加入50 µl 2x Laemmli上样缓冲液，于加热块中100 °C孵育3–5分钟。每种样品取10 µl上样至SDS-PAGE凝胶，用于Western Blot分析（第5节：Western blot分析）。</li>
	<li>用1 ml胍缓冲液在摇床上洗涤磁珠一次，5-10分钟。</li>
	<li>用 1 ml 裂解缓冲液洗涤珠子 5 次（表1在摇床上孵育 5-10 分钟。</li>
	<li>将珠子重悬于90 µl的2x Laemmli样品缓冲液中。</li>
	<li>加入10 µl的1 M咪唑。 
	注意：咪唑可通过与Ni-NTA磁珠竞争性结合，帮助解离His标签蛋白与磁珠之间的相互作用。</li>
	<li>在加热块中于 100 °C 孵育 3-5 分钟。</li>
	<li>涡旋，然后在13,000 × g离心30秒。将上清液转移至新管中。</li>
	<li>将每份样品取 10–20 µl 加样至 SDS-PAGE 凝胶中，用于 Western Blot 分析（第 5 节：Western blot 分析）。 
	注意：如果使用5 mg全细胞提取物（WCE），则10–20 µl对应0.5–1.0 mg的上样量。</li>
</ol>
4. Myc标签着丝粒蛋白的免疫沉淀
<ol>
	<li>获取抗c-Myc琼脂糖亲和凝胶抗体（见表） 材料通过低速离心（800–1,500 × g）收集实验所需树脂（每份样品25 µl）。弃去上清液。</li>
	<li>用1 ml缓冲液A洗涤树脂5次：上下颠倒混匀直至树脂重悬，低速离心收集树脂，并移除上清液。</li>
	<li>将树脂悬浮于1 ml缓冲液A中，并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。低速离心收集树脂，弃去上清液。 
	注意：通过上下颠倒充分混匀树脂。</li>
	<li>将950 µl剩余的WCE（来自步骤2.11：蛋白质提取）加入25 µl树脂中。</li>
	<li>在4 °C下于摇床中孵育过夜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 800-1,500 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>保留50 µl上清液（SUP）。加入50 µl 2× Laemmli上样缓冲液，置于金属浴中100 °C孵育3–5 min。每种样品取10 µl上样至SDS-PAGE凝胶，用于Western Blot分析（第5节：Western blot分析）。</li>
	<li>用1 ml缓冲液A洗涤树脂5次：颠倒混匀至树脂重悬，低速离心收集树脂，弃上清液。</li>
	<li>将树脂重悬于 100 µl SUMEB 样品缓冲液中表1). 
	注意：SUMEB 样品缓冲液含有 8 M 尿素和 1% SDS（强变性条件）。</li>
	<li>在加热块中于100 °C孵育3-5分钟。</li>
	<li>涡旋混匀，然后在13,000 × g离心30秒。将上清液转移至新管中。</li>
	<li>将每份样品取 10–20 µl 加样至 SDS-PAGE 凝胶中，用于 Western Blot 分析（第 5 节：Western blot 分析）。 
	注意：如果使用5 mg全细胞提取物（WCE），则10-20 µl对应0.5-1.0 mg的上样量。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>将蛋白质提取物上样至4-12% Bis-Tris凝胶（材料表）中，在120 V电压下电泳90分钟（运行缓冲液：材料表） 材料).</li>
	<li>将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜（见表 材料) 使用转移装置在30 V电压下转移90分钟（转移缓冲液：见表格） 材料).</li>
	<li>用5%脱脂牛奶/1x TBST封闭膜表1室温下孵育1小时。</li>
	<li>用一抗孵育膜（见下表） 材料在含5%脱脂奶粉的1×TBST中4 °C过夜孵育。一抗稀释比例为：抗Flag抗体和抗Ub抗体1:1,000，抗Myc抗体1:5,000。</li>
	<li>用1×TBST缓冲液洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。</li>
	<li>用二抗孵育膜（见下表） 材料在室温下用5%脱脂牛奶/TBST溶液封闭1小时。二抗使用1:5,000稀释度。</li>
	<li>用1×TBST缓冲液洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。</li>
	<li>用 ECL 工作液孵育膜（见表） 材料5 分钟</li>
	<li>将膜暴露于对蓝光敏感的X射线胶片（见表 材料）并使用自动显影仪（见表 材料).</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mub1%2FUbr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216(2013).</li>
<li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li>
<li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li>
<li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li>
<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

HA、Myc、Flag 和 GST 等表位标签被广泛用于蛋白质的生物化学分析。构建表达 HF-Smt3 与 Myc 标签标记的动粒蛋白（如 Ndc10 和 Ndc80）的菌株，有助于检测翻译后修饰（PTMs），例如类泛素化（sumoylation）和泛素化（ubiquitination）。通过 HF-Smt3 下拉实验可检测到类泛素化的动粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80（图 1）。利用抗 Flag 抗体进行亲和纯化和蛋白质印迹分析，可验证 HF-Smt3 与靶蛋白之间的特异性相互作用，因为在不含 HF-Smt3 的对照菌株中未检测到修饰蛋白。在蛋白底物上使用 Myc 标签可进一步验证 HF-Smt3 共价结合物中存在类泛素化的 Ndc10 和 Ndc80。此外，在经诺考达唑（nocodazole）处理的细胞中，Ndc10 和 Ndc80 的类泛素化水平均有所降低（图 1C 和 图 1D）。Montpetit 等9 之前曾报道，诺考达唑处理仅导致 Ndc10 的类泛素化减少，而 Ndc80 无此变...

泛素化和类泛素化分别介导泛素以及类泛素小蛋白（SUMO；在S. cerevisiae中为Smt31）与靶蛋白的共价连接。着丝粒动粒蛋白的翻译后修饰（PTMs）可影响其在细胞周期不同阶段的细胞内水平及蛋白-蛋白相互作用，从而确保染色体的准确分离。例如，Cse4/CENP-A和外层动粒蛋白Dsn1的细胞内水平通过泛素介导的蛋白降解途径进行调控，以维持基因组稳定性2-5。错误的动粒-微管连接的去稳定化依赖于Ipl1/Aurora B激酶，该激酶可磷酸化直接与微管相互作用的Dam1和Ndc80复合物6-8。尽管已鉴定出七十多种动粒蛋白，但针对这些蛋白的翻译后修饰（如泛素化和SUMO化）的研究仍极为有限。e.g.，泛素和SUMO。主要限制因素包括在纯化过程中难以保持PTMs的完整性，以及缺乏可用于检测如类泛素化、磷酸化、甲基化等PTMs的特异性抗体。对类泛素化修饰的动粒蛋白Ndc10、Cep3、Bir1和Ndc80的表征曾使用了定制抗体9。此外，Ndc10也被证实是泛素化的底物10。人源Hec1（即S. cerevisiae中的Ndc80）同样是泛素化的底物，其修饰由APC/C-hCdh1 E3连接酶调控11。因此，Ndc10和Ndc80是优化在S. cerevisiae中同时检测类泛素化和泛素化实验方案的理想候选蛋白。
为了便于鉴定SUMO化修饰，我们构建了表达HF-Smt3以及Myc标签Ndc10或Ndc80的菌株。使用表位标签（HF：His6-Flag）可最大限度地减少由于多克隆抗血清针对候选蛋白时常见的交叉反应所导致的背景信号。我们设计了一种方案，通过亲和纯化HF-Smt3缀合物，随后使用商用抗Flag和抗Myc抗体，在纯化的Smt3样品中检测Ndc10和Ndc80的SUMO化修饰。对于泛素化修饰，我们设计了一种改良的免疫沉淀方案，以保持Myc标签着丝粒蛋白的泛素化状态，并使用商用抗Ub抗体进行蛋白质印迹分析，以检测Ndc10和Ndc80的泛素化修饰。

<table><tbody><tr><td>玻璃珠</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm 直径</td></tr><tr><td>微型珠磨机</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 孔细胞破碎仪</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>兔源抗 c-Myc 琼脂糖亲和凝胶抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>鼠源单克隆抗 Flag M2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>一抗，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc 抗体 (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>一抗，稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>纯化鼠单克隆抗体 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>一抗，稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>泛素 (P4G7) 单克隆抗体</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>一抗，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL 兔 IgG HRP 标记全抗体</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>二抗，稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL 小鼠 IgG HRP 标记全抗体</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>二抗，稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm 孔径</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm，10 孔</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE 转膜缓冲液</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学发光底物</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>蓝色敏感 X 射线胶片</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>自动显影机</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 ndc10 和 ndc80 发生 sumo 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

翻译后内容：蛋白质翻译后修饰（PTMs），如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化和SUMO化，调控多种蛋白质的细胞功能。与着丝粒DNA结合的动粒蛋白的PTMs介导染色体的准确分离，从而维持基因组稳定性。目前最常用的PTMs鉴定方法包括质谱分析和蛋白质印迹（Western blot）分析。本文描述了一种蛋白质纯化方法，可用于检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中动粒蛋白Ndc10和Ndc80的SUMO化和泛素化修饰。我们构建并使用了一种表达聚组氨酸-Flag标签Smt3（HF-Smt3）以及Myc标签Ndc10或Ndc80的菌株进行研究。为检测SUMO化，我们设计了一种利用镍柱亲和纯化His标签SUMO化蛋白的方案，并通过抗Myc抗体进行蛋白质印迹分析，以检测SUMO化的Ndc10和Ndc80。为检测泛素化，我们设计了Myc标签蛋白的免疫共沉淀方案，并使用抗泛素抗体进行蛋白质印迹分析，证明Ndc10和Ndc80存在泛素化修饰。我们的结果表明，在表达His-Flag标签Smt3的菌株中，目标蛋白的表位标签有助于多种PTMs的检测。未来的研究可利用该技术鉴定和表征依赖于特定PTM的蛋白质相互作用。

为了检测着丝粒蛋白 Ndc80 和 Ndc10 的 SUMO 化修饰，构建了表达 HF-Smt3 和 Myc 标签标记的着丝粒蛋白（Ndc80 或 Ndc10）的菌株（表 2），方法如前所述9,12。使用 Ni-NTA 琼脂糖珠对 HF-Smt3 偶联物进行亲和纯化。利用抗 Flag 抗体对纯化的 HF-Smt3 进行蛋白质印迹分析，可检测到 SUMO 底物的 SUMO 化形式，而在未表达 HF-Smt3 的对照菌株中则未检测到该信号（图 1A 和 1B，左图）。与预期一致，在表达 HF-Smt3 的菌株中检测到多种 SUMO 修饰的底物条带。接下来，我们通过抗 Myc 抗体进行蛋白质印迹分析，以确定纯化的 HF-Smt3 偶联物中是否含有 Ndc80 和 Ndc10。结果显示，存在多个分子量高于 Ndc80 或 Ndc10 单体的条带（图 1A 和 1B，右图）。此外，在经诺考达唑处理的细胞中，Ndc80 和 Ndc10 的多条带信号均有所减弱（...

本文描述了在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中着丝粒动粒蛋白Ndc10和Ndc80的SUMO化修饰与泛素化修饰的检测方法。

一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

翻译后修饰（PTMs），如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化和SUMO化，调控细胞内的……

本实验的总体目标是检测芽殖酵母动粒核心蛋白 NDC10 和 NDC80 的类泛素化修饰（SUMO化）和泛素化修饰。首先收获表达HIS-FLAG标记的SMT3以及MYC标记的NDC10或NDC80的酵母细胞，并从中制备蛋白提取物。第二步是纯化HIS-FLAG标记的SMT3结合物以检测SUMO化修饰，或通过免疫共沉淀MYC标记的动粒核心蛋白以检测泛素化修饰。随后，通过蛋白质印迹分析检测SUMO化或泛素化。最终，NDC10和NDC80出现梯状条带模式，表明这些蛋白质发生了SUMO化和泛素化修饰。所述的蛋白质纯化方法可用于检测出芽酵母S. cerevisiae中着丝粒蛋白NDC10和NDC80的SUMO化与泛素化。我的cci。该技术的主要优势在于我们所构建的菌株具有两个表位标签，一个位于目标蛋白上，另一个可用于检测模拟过程。这些标签的使用减少了由于多克隆血清常出现的交叉反应而导致的背景干扰。本实验操作将由我实验室的研究员 Canero Uni 演示。从先前制备并储存在负20摄氏度的酵母细胞沉淀中提取目标蛋白。将细胞重悬于0.5毫升冰上预冷的缓冲液中。如果提取物用于镍-氮川三乙酸（nickel nitrile tri acetic acid）或镍-NTA superflow 琼脂糖 beads 的 pull-down 实验，请使用 guine 缓冲液；如果提取物用于免疫共沉淀，请使用缓冲液 A。始终将离心管置于冰上。将细胞悬液转移至2 mL。向每根试管中加入与细胞悬液等体积的玻璃珠，并拧紧盖子。在室温下使用小型珠磨机剧烈震荡细胞 2 分钟，然后将离心管置于冰上 2 到 3 分钟。重复珠磨和冰浴步骤三次。在 4°C 下高速涡旋震荡 30 至 60 分钟。在显微镜下观察细胞，以确认细胞是否已裂解。裂解的细胞将呈现为深色的影状物，缺乏边界或明确的形态。理想情况下，至少应有80%的细胞被裂解。接下来，使用推针在管子底部穿一个小孔。将螺帽轻轻拧上，并将该管放入一个15毫升的锥形管中。在1000 × g 条件下离心1分钟。为收集裂解液，将裂解液转移至微量离心管中，在4°C条件下以15,000 × g离心30分钟，以收集提取的蛋白质。使用蛋白检测试剂盒测定提取蛋白的浓度后，调整所有提取液使其包含相同量的蛋白质。用适当的缓冲液将总体积补至1毫升。从50 OD 600的细胞中可获得约五毫克的总蛋白。将提取的蛋白保留50微升作为全细胞提取物。剩余的950微升蛋白提取物将用于后续的蛋白纯化或MT标签蛋白的免疫沉淀。向50微升全细胞提取物中加入50微升2×上样缓冲液。将样品置于金属浴中，在100摄氏度孵育3至5分钟，随后进行蛋白质印迹分析。开始本实验前，需先准备纯化所需的镍-NTA Superflow琼脂糖微球。通过低速离心一分钟，获取所需数量的磁珠。移除上清液，并用 PBS 洗涤磁珠。加入一毫升 PBS，反复颠倒试管，直至磁珠完全重悬。 通过低速离心收集珠子，并移除上清液。以该方法总共洗涤珠子五次。将珠子悬浮于1毫升豚鼠缓冲液中，并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。通过低速离心收集珠子，并移除每个样品的上清液。向100微升珠子中加入950微升先前制备的全细胞提取物。在4°C下于摇床上孵育至少4小时或过夜。在4°C下以800至1500 × g离心1分钟。保留50 µL上清液。向该上清液中加入50 µL的2×上样缓冲液，在100 °C的加热块中孵育3至5分钟。每种样品后续将取10 µL进行Western印迹分析。用1 mL洗涤缓冲液在室温下于摇床上洗涤镍-NTA Superflow凝胶珠1次，每次5至10分钟。随后，用1毫升裂解缓冲液将磁珠洗涤五次。最后一次用裂解缓冲液洗涤后，将磁珠重悬于90微升2×上样缓冲液中。加入10微升1摩尔的异丙醇，以帮助使His标签蛋白从镍NT.A磁珠上解离，然后在金属浴中100摄氏度孵育3至5分钟。涡旋振荡后，在13,000×g离心30秒。将上清液转移至新的离心管中。开始此操作前，通过低速离心收集所需量的抗 cmic aero 亲和凝胶抗体。去除上清液，用缓冲液 A 洗涤树脂，加入一毫升缓冲液 A，颠倒混匀直至树脂重新悬浮。通过低速离心收集树脂，并移除上清液。总共洗涤五次。将树脂悬浮于1毫升缓冲液A中，并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。通过低速离心收集树脂，并去除上清液。将950微升全细胞提取物加入25微升树脂中，于4°C在摇床上孵育过夜。次日，在4°C下以800至1500 × g离心1分钟。保存50微升上清液。向此上清液中加入50微升2×Laemmli样品缓冲液，在金属浴中100摄氏度孵育3至5分钟。用缓冲液A洗涤树脂，加入1毫升缓冲液A，上下颠倒混匀，直至树脂重新悬浮。低速离心收集树脂，在完成最后一次洗涤去除上清液后，弃去上清液。将树脂重悬于100 µL上样缓冲液中，在加热块中100 °C孵育3至5分钟。涡旋混匀后，在13,000 ×g条件下离心30秒。将上清液转移至新的离心管中。最后，将本实验方案中收集的所有样品加入SDS-PAGE凝胶，用于Western blot分析。实验中使用的酵母菌株表达多聚组氨酸标签标记的SMT3或HF-SMT3，以及MT标签标记的NDC80和NDC10，以检测动粒相关蛋白的表达情况。使用镍珠对HF SMT三号底物进行亲和纯化，并用抗Flag抗体进行检测。当使用抗Mic抗体探测时，在HF SMT三号底物中检测到发生SUMO修饰的NDC80。在不含HF SMT三号的对照菌株中未检测到修饰蛋白，表明HF SMT三号与其靶蛋白之间的相互作用具有特异性。此外，在使用NOCO脱索处理的细胞中，NDC 80和NDC 10的总和减少，以检测NDC 80和NDC 10的泛素化。将Mick标签标记的ND C 80或ND C 10进行免疫沉淀，并使用抗mic和抗泛素抗体进行蛋白质印迹分析。对全细胞提取物和上清液的分析证实了NDC 80 M和NDC 10 M的表达。用抗MIC抗体探测的免疫沉淀样品显示出多条高分子量条带，表明NDC 80和NDC 10含有翻译后修饰。用抗泛素抗体探测的免疫沉淀样品呈现出梯状条带模式，表明ND C 80和ND C 10发生了泛素化。通过蛋白酶体抑制剂 MG 132 处理，增强了 NDC 80 和 NDC 10 的梯状条带模式，进一步证实这些条带代表多聚泛素化。在观看本视频后，您应能充分理解这一蛋白纯化技术，该技术可用于检测蝙蝠 NN 的修饰及疫苗化。

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生物学

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