从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

本实验的总体目标是从肠道组织中生成人类肠类器官。首先从底层的黏膜下组织中解剖出肠黏膜，实现这一目标。第二步是用EDTA孵育黏膜，以促进上皮与结缔组织的分离。

接下来，将肠隐窝从解离的上皮组织中分离出来。最后，将肠隐窝在基底膜基质中进行培养。最终，通过免疫组织化学技术检测培养的类器官中上皮结构的形成以及特定上皮标志物的表达。

该方法的意义在于，我们现在能够利用患者特异性活检组织生成类器官（OID），这意味着我们现在可以在实验室中利用这些组织来研究肠道疾病及其诊断，而在此前我们从未能够做到这一点。根据文本方案配制缓冲液和试剂后，将基底膜置于冰上解冻，并在组织收到后，提前将24孔板放入37摄氏度、含二氧化碳的培养箱中预孵育。使用不含钙和镁的KO PBS或DPBS清洗组织，直至DPBS变为澄清。

将组织置于盛有冰冻 DPBS 的硅胶涂层玻璃培养皿中，黏膜面朝上，用穆努金针通过拉伸并固定组织。接着，在解剖显微镜下，使用显微解剖剪和尖头弯镊去除黏膜下层及结缔组织。然后，保持黏膜面朝上，将解剖好的黏膜在硅胶涂层玻璃培养皿上展平并用针固定。

使用弯头镊子轻轻刮取黏膜表面。此步骤对于提高制备质量十分必要。用新配制的 2 毫摩尔 EDTA 螯合缓冲液覆盖黏膜。

然后，在解剖显微镜下根据文本方案用冰上洗涤组织三到四次后，使用弯头镊子轻轻刮取黏膜，用移液管释放肠隐窝。轻柔地将隐窝悬液从培养皿中移出，并转移至50毫升锥形管中。随后检查组织，以确保几乎所有隐窝均已从黏膜中去除。

将隐窝悬液通过150微米滤膜过滤两次，并使用显微镜检查滤过物。按照文本方案，在洗涤隐窝悬液并将所需数量的隐窝转移至5毫升圆底管后，以150 ×g、4°C离心10分钟。然后使用预冷的移液器吸头去除上清液，并加入基底膜基质重悬隐窝沉淀。

将50微升基底膜基质中的隐窝悬液缓慢加入预热板的每孔中心位置。在37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育30分钟，使基底膜基质完全聚合。随后，在基底膜基质上覆盖500微升完全型人源迷你肠道培养基，并添加2.5微摩尔的CHIR 90221。

然后，Thien 对组织进行孵育，两天后更换培养基，之后每隔一天更换一次。该图显示了从完整组织中 freshly 分离的隐窝的典型示例。从活检组织中分离的隐窝数量少于完整组织中的隐窝数量。

通常一次活检取两个组织样本。每个活检样本可获得约10平方毫米的组织表面，每次活检平均可得到50至100个隐窝。经过5至6天的培养并在基底膜基质中生长后，隐窝细胞会聚集成球，形成小肠类器官（entero spheres）或结肠类器官（colono spheres），并在第7天进行传代。

此处所示的来自活检组织的肠类器官或OID在接种时以较低密度进行培养，其发育过程相同。因此，通常在培养10至12天后进行传代。如图所示，肠类器官和OID均具有管腔面，并由上皮细胞层覆盖。

在OIDs中可以观察到增殖细胞，它们位于芽尖部位。使用e-cadherin（绿色）染色的OIDs共聚焦成像显示了上皮细胞。该图展示了来自一名囊性纤维化患者以及一名因上皮细胞黏附分子基因先天性突变导致绒毛样肠病患者的肠类器官。

采用此实验流程或类似实时 PCR 或 Western 印迹等方法，可用于回答有关特定基因或探针的进一步问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何稳定地分离人类 CRISPR 组分，从而在实验室中高效构建基因编辑系统，以解答针对患者个体化问题的科学疑问。