Name: 从整体组织和活检建立人类上皮Enteroids和Colonoids的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学习从人体小肠和结肠隐窝建立肠类器官和结肠类器官的方法。该技术利用EDTA解离和基底膜基质培养，支持患者特异性肠道疾病研究与个性化医疗应用。

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我们衷心感谢荷兰发育生物学与干细胞研究所的 Hans Clevers 博士惠赠 TOPflash 细胞。
本项目部分得到了以下资助：NIH-R01DK083325（MAH）；NIH P30 DK078392（消化健康中心）；NIH UL1RR026314（CTSA）。

注意：伦理声明：本文所述所有使用人体组织的实验均已获得辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）机构审查委员会（IRB）的批准（IRB #2012-2858；#2014-0427）。在CCHMC，已从组织捐献者处获得关于组织采集、储存及样本使用的知情同意书。
1. 培养前准备
注意：所有试剂均列于表1中。
<ol>
	<li>制备EDTA储存液：将0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶于超纯H2O中，调节pH至8，用0.22 µm滤器过滤除菌。可选择在室温下长期保存EDTA储存液。</li>
	<li>制备螯合缓冲液：在不含Ca2+和Mg2+的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中加入2%山梨醇、1%蔗糖、1%牛血清白蛋白V组分（BSA）和1×庆大霉素/两性霉素溶液，用0.22 µm滤器过滤除菌。螯合缓冲液需新鲜配制。</li>
	<li>制备Wnt-3A条件培养基：使用细胞系L Wnt-3A（ATCC, CRL-2647）按照生产商说明书自行制备Wnt-3A条件培养基。在培养基中添加2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素、1份N2补充剂、1份B27补充剂、1% BSA，并用0.22 µm滤器过滤除菌。 
	注意：使用TOPflash检测法对每一批Wnt-3A条件培养基进行Wnt活性检测。采用Hans Clevers实验室提供的稳定表达HEK293 TOPflash细胞系，并根据生产商说明书使用Renilla荧光素酶检测试剂盒。以100 ng/ml&#160;人重组Wnt-3A作为对照进行TOPflash检测的归一化处理。确认条件培养基的活性相比对照至少提高10倍。将新鲜制备的Wnt-3A条件培养基分装至15 mL锥形管中，每管10 mL，于-20°C冷冻保存，可稳定保存长达6个月。解冻后的分装样品可在4°C保存最多5天，且活性不下降。</li>
	<li>制备人源类肠道培养基：在Advanced DMEM/F12培养基中添加2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素、1份N2补充剂、1份B27补充剂、1% BSA，并用0.22 µm滤器过滤除菌。 
	注意：将新鲜制备的人源类肠道培养基分装至15 mL锥形管中，每管10 mL，于-20°C冷冻保存，可稳定保存长达3个月。解冻后的分装样品可在4°C保存最多5天，且活性不下降。</li>
	<li>制备完全人源类肠道培养基：在隐窝培养或更换培养基前新鲜配制，取人源类肠道培养基（见步骤1.4），并补充50% Wnt-3A条件培养基（见步骤1.3）、1 µg/ml&#160;R-spondin 1（1 mg/mL储存液按1:1,000稀释）、100 ng/mL Noggin（100 g/mL储存液按1:1,000稀释）、50 ng/mL EGF（500 μg/mL储存液按1:10,000稀释）、500 nM A-83-01（500 M储存液按1:1,000稀释）、10 µM SB202190（30 mM储存液按1:3,000稀释）、10 nM [Leu]15-Gastrin 1（100 µM储存液按1:10,000稀释）、10 mM烟酰胺（1 M储存液按1:100稀释）以及1 mM N-乙酰半胱氨酸（1 M储存液按1:1,000稀释）。 
	注意：完全人源类肠道培养基可在4°C保存最多2天，且活性不下降。</li>
</ol>
2. 从完整组织中分离隐窝
注意：从组织采集开始，必须将样本保存在生理盐水中。建议在运输过程中将组织置于冰上。应尽快进行样本制备以分离隐窝。 
注意：所有试剂列于表1中，工具、设备和耗材列于表2中。
<ol>
	<li>实验开始前准备好所有试剂。将基底膜基质置于冰上解冻，并将24孔板预先放入37°C的CO2培养箱中预温。
	 
	注意：也可在24孔板每孔中央加入15 µl基底膜基质形成薄层，并将其置于37°C的CO2培养箱中。此可选步骤可在聚合过程中使基底膜基质保持液滴状态。</li>
	<li>用预冷的不含Ca2+和Mg2+的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗组织，直至DPBS澄清为止。</li>
	<li>使用直径为0.2 mm的细头图钉，将组织固定在盛有预冷DPBS的硅胶涂层玻璃培养皿上，使黏膜面朝上并展平固定。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用显微解剖剪和细头弯镊去除黏膜下层及结缔组织上的覆盖黏膜（图2A, B）。</li>
	<li>将解剖后的黏膜展平并用图钉固定在硅胶涂层玻璃培养皿上，黏膜面朝上。剩余的黏膜下层和结缔组织可丢弃或用于其他实验（图2C）。</li>
	<li>用弯镊轻轻刮擦黏膜表面。此步骤有助于提高制备质量。
	<ol>
		<li>对于小肠组织，轻轻刮擦以去除绒毛。</li>
		<li>对于结肠组织，轻轻刮擦以去除黏液和碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用预冷的螯合缓冲液清洗黏膜3–4次，以去除绒毛和碎片。</li>
	<li>用新配制的2 mM EDTA螯合缓冲液（将49.6 ml螯合缓冲液中加入200 µl 0.5 M EDTA）覆盖黏膜（200 µl/孔）。</li>
	<li>将培养皿置于冰上，在水平轨道摇床上轻轻振荡30分钟。</li>
	<li>用不含EDTA的预冷螯合缓冲液清洗组织3–4次。清洗后，将黏膜保留在预冷的螯合缓冲液中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用弯镊和精细镊子处理黏膜。用弯镊轻轻刮擦黏膜，以释放肠隐窝。</li>
	<li>用移液器小心地从培养皿中吸取隐窝悬液，并转移至50 ml锥形管中。
	 
	注意：检查组织，确保几乎所有隐窝均已从黏膜上分离。</li>
	<li>将隐窝悬液通过150 µm滤网过滤两次。
	 
	注意：在显微镜下检查滤过液，确认隐窝富集情况（图2D）。</li>
	<li>将隐窝悬液在4°C下以50 ×g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物重悬于5 ml预冷的螯合缓冲液中。</li>
	<li>从步骤2.15所得悬液中，计数每10 µl液滴中的隐窝数量。将所需数量的隐窝转移至5 ml圆底管中。每个24孔板孔接种200–500个隐窝，用于建立肠类器官或结肠类器官。</li>
	<li>将隐窝组分在4°C下以150 g离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将隐窝用于后续培养。</li>
</ol>
3. 从活检组织中分离隐窝
<ol>
	<li>在实验开始前准备好所有试剂。将基底膜基质置于冰上解冻，并将24孔板预先放入37°C的CO2培养箱中孵育。</li>
	<li>用预冷的不含Ca2+和Mg2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗活检组织。</li>
	<li>使用直径为0.1 mm的细针，将活检组织固定在盛有预冷DPBS的硅胶涂层玻璃培养皿上。将黏膜面朝上，拉平并用针固定（图2E）。</li>
	<li>用弯头镊子轻轻刮擦黏膜表面，以去除绒毛和碎片。此步骤对于提高制备质量至关重要。</li>
	<li>用预冷的螯合缓冲液清洗活检组织3–4次，以进一步去除绒毛和碎片。</li>
	<li>用新配制的2 mM EDTA螯合缓冲液（将200 µl 0.5 M EDTA加入49.8 ml螯合缓冲液中）覆盖活检组织（共200 µl）。</li>
	<li>将培养皿置于冰上，在水平轨道摇床上轻轻振荡30分钟。</li>
	<li>用不含EDTA的预冷螯合缓冲液清洗活检组织3–4次。清洗后，将组织保留在预冷的螯合缓冲液中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用弯头精细镊子进行操作。用弯头镊子轻轻刮取黏膜，以释放肠隐窝。</li>
	<li>用移液器小心地将隐窝悬液从培养皿中吸出，并转移至50 ml锥形管中。 
	注意：检查组织，确保几乎所有隐窝均已从黏膜上脱离。</li>
	<li>将隐窝悬液通过150 µm尼龙筛网过滤两次。 
	注意：在显微镜下检查滤过液，确认隐窝富集情况。</li>
	<li>在4°C下以50 ×g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物重悬于1 ml预冷的螯合缓冲液中，并将隐窝悬液转移至1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>在4°C下以150 ×g离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将获得的隐窝用于后续培养。</li>
</ol>
4. 基底膜基质中的隐生现象
<ol>
	<li>使用预冷的移液吸头，将隐窝沉淀（来自步骤 2.18 或 3.15）重悬于基底膜基质中（每 50 µl 基底膜基质含 200 至 500 个隐窝）。</li>
	<li>将 50 µl 含隐窝的基底膜基质悬液逐孔加入预温的培养板中。缓慢将基底膜基质排至孔中央位置。</li>
	<li>将 24 孔板置于 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟，使基底膜基质完全聚合。</li>
	<li>在基底膜基质上覆盖 500 µl 完全人源类肠培养基，其中添加 2.5 µM CHIR99021（将 10 mM 储液按 1:4,000 稀释）和 2.5 µM Thiazovivin（将 10 mM 储液按 1:4,000 稀释）。</li>
	<li>将培养板置于 37°C、5% CO2 培养箱中继续培养。</li>
	<li>每隔 2 天更换一次新鲜的完全人源类肠培养基。</li>
</ol>
5. 培养的肠类器官和结肠类器官的传代。
注意：初次接种后每 7 到 10 天传代一次类肠隐窝器官（enteroids）和类结肠器官（colonoids）。通常将一个孔传代至 3 到 4 个新孔中。
<ol>
	<li>实验开始前准备好所有试剂。将基底膜基质置于冰上解冻，并将24孔板预先放入37°C的CO2培养箱中孵育。</li>
	<li>使用无菌吸头移除培养基，每孔加入1 ml冰冻DPBS。</li>
	<li>用1,000 µl&#160;吸头反复吹打。将溶液转移至新的15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>每1 ml培养基中加入2 ml含5% FBS的人类类肠道培养基。</li>
	<li>在4°C下以50 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用含10 µM Y-27632（10 mM母液1:1,000稀释）的细胞解离酶溶液重悬沉淀。在37°C水浴中孵育5分钟。</li>
	<li>使用配备18 G填充/钝针头的3 ml鲁尔锁接头注射器解离细胞团块。用注射器轻柔地来回吹打溶液10次。</li>
	<li>在4°C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>使用预冷的移液吸头，将细胞沉淀重悬于基底膜基质中。</li>
	<li>在预热的培养板每孔中加入50 µl含隐窝悬浮液的基底膜基质。缓慢将基底膜基质挤出至孔中央。</li>
	<li>将24孔板置于37°C、5% CO2培养箱中孵育20分钟，使基底膜基质完全聚合。</li>
	<li>每孔加入500 µl含10 µM Y-27632（10 mM母液1:1,000稀释）的完全人类类肠道培养基覆盖基底膜基质。</li>
	<li>将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
	<li>2天后，更换为新鲜的含10 µM Y-27632（10 mM母液1:1,000稀释）的完全人类类肠道培养基。此后每隔一天更换一次新鲜完全人类类肠道培养基。</li>
</ol>
6. 培养的肠类器官和结肠类器官的冻存
注意：通常将一个孔中的样品分装至 2-3 个冻存管中进行冷冻。
<ol>
	<li>重复步骤 5.1 至 5.8。</li>
	<li>用冷冻保存液重悬沉淀。将 1 ml 冷冻溶液转移至已标记的冻存管中。将冻存管放入含有 500 ml 异丙醇的冷冻容器中。</li>
	<li>将冷冻容器置于 -80°C 冰箱中冷冻 24 小时，然后将冻存管转移至液氮中保存。 
	注意：类肠体和类结肠体可保存长达 1 年。</li>
</ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).</li>
<li>Shroyer, N. F., Kocoshis, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShroyer%2C+NF+%22Pediatric+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22">Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases</a>. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).</li>
<li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium%3A+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+levels+of+Sox9+expression+mark+colon+epithelial+stem+cells+that+form+colonoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).</li>
<li>Furstenberg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+mouse+jejunal+epithelial+cells+with+CD24+yields+a+population+with+characteristics+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Intestinal+Stem+Cells+Based+on+Surface+Marker+Combinations+and+Colony-Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay.</a> Gastroenterology. , (2013).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5%28%2B%29+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).</li>
<li>Durand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+intestinal+stem+cells+after+Paneth+cell+ablation+induced+by+the+loss+of+transcription+factor+Math1+%28Atoh1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Akcora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CSF-1+receptor+fashions+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche.</a> Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).</li>
<li>Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Rothenberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cKit%28%2B%29+colonic+crypt+base+secretory+cell+that+supports+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice.</a> Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+patch+M+cells+derived+from+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+%27miniguts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts.</a> Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Fuller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells+remain+viable+after+prolonged+tissue+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage.</a> Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Marked+by+the+R-Spondin+Receptor+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5.</a> Gastroenterology. , (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).</li>
<li>Tojo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALK-5+inhibitor+A-83-01+inhibits+Smad+signaling+and+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta.</a> Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).</li>
<li>Gafni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%3A+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3(2013).</li>
<li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+intestinal+stem+cells%3A+applications+for+colorectal+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169(2014).</li>
<li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6(2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该方法提供了一个完整的系统，可重现构成肠道上皮细胞谱系及上皮动态的类器官，为研究肠道上皮生物学提供了有力工具。本文所述方法源自 Sato 和 Clevers 最初在小鼠中建立的方案22，并已成功优化用于高效生成人类小肠类器官和结肠类器官。在此，我们通过显微解剖手动挑选隐窝，以避免任何细胞污染。该方法可直接观察隐窝结构，相较于原始的“震荡”法收集隐窝，具有更高的重复性和时间一致性。其他研究团队也开发了类似技术，采用略有不同的策略，尤其是以胶原酶替代 EDTA 进行螯合处理25。除了隐窝收集方法的差异外，这些技术均依赖特定的培养基，以支持人类小肠类器官在体外培养中的生长22。为了提高隐窝接种时的生长效率，我们在培养初期前两天添加 GSK3 抑制剂（CHIR99021）12。
组织或活检样本的处理至关重要，应在组织到达实验室后立即进行隐窝分离。然而，如先前对小鼠组织所描述的那样，组织采集后最多可在24小时内延迟进行隐窝分离与培养（数据未显示）26。肠道组织应置于完全充满DPBS的锥形管中，以防止组织破损，并在4°C下保存。延迟处理便于组织运输，但运输过程中应避免温度波动。初次隐窝接种所需的总时间约为2小时，其中组织处理需15至30分钟，隐窝分离与接种则需1至2小时。组织的显微解剖是获得纯净隐窝制备物的关键决定因素。然而，也可采用多种方案中所述的手摇法释放隐窝22,23。
尽管人源肠类器官（enteroids）系统与小鼠肠类器官系统具有相似性，但人源肠类器官需要特定分子以增强并长期维持其生长。生长因子EGF、Noggin和R-spondin的使用方式与小鼠上皮类器官类似。然而，Wnt-3A的使用至关重要。我们注意到，使用Wnt-3A条件培养基相较于人重组蛋白，其类器官形成效率及生长效果更佳。同时，我们通过使用糖原合成酶激酶3抑制剂（CHIR99021）证明了培养条件的优化12。重组生长因子可被Wnt-3A、R-spondin和Noggin的条件培养基所替代。表达Wnt-3A的L细胞系可从商业途径获得（ATCC）。其他研究团队已开发出表达R-spondin 123,27、Noggin19以及Wnt-3A/R-spondin3/Noggin28的细胞系。两种小分子抑制剂被用于培养基中，对维持类器官培养至关重要29。A-83-01是一种转化生长因子β和Activin/Nodal受体（activin-like kinase 4、5、7）的选择性抑制剂，SB202190则是一种p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂。这两种抑制剂分别已被用于维持人诱导性多能干细胞的自我更新以及建立人原始态多能干细胞30-32。此外，烟酰胺（nicotinamide）——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的前体物质——对于长期维持肠类器官和结肠类器官的扩增也是必需的22,29。
EDTA 螯合是隐窝制备过程中决定产量的重要步骤。我们已成功使用 2 mM EDTA 处理，但根据组织类型的不同，EDTA 浓度可在 2 mM 至 15 mM 范围内调整。在此情况下，孵育时间需通过实验经验确定。初始接种后，隐窝会变圆并最终形成肠类器官。然而，肠类器官或结肠类器官常表现出“干细胞”表型，形成几乎不含分化细胞的球状结构。此时，可通过去除 Wnt-3A、烟酰胺和 p38 MAPK 抑制剂来启动分化过程。使用如 DAPT 或 DBZ 等 Notch 抑制剂有助于增强肠类器官内的细胞分化22。
该模型重现了肠道生理结构，其中源自干细胞区室的隐窝出芽事件持续发生，同时存在包含吸收性和分泌性分化谱系的绒毛样上皮结构。有趣的是，该系统不含任何间充质细胞，而是通过特定的培养基条件来满足微环境信号需求。
与小鼠模型类似，人类肠类器官可通过分离的肠上皮细胞生成，以检测这些细胞是否具有干细胞功能。多项研究已利用分化簇标记物（CD44、CD24 或 CD166）以及 EPHB2 阳性细胞来富集具有干细胞特性的细胞12,23,33。这些研究共同证明了人类肠类器官培养体系在评估干细胞特性方面的实用性。其他研究者正利用该模型研究肠道疾病，如感染性腹泻病、囊性纤维化或结直肠癌22,34-37。这些研究表明，人类肠类器官是一种可靠的疾病模型，有望实现个体化筛查。人类肠类器官可通过DNA转染或病毒感染进行遗传修饰38，这为研究人类上皮类器官中特定基因的功能或纠正基因突变提供了有力工具。最近，Schwank 及其同事证明了利用 CRISPR/Cas9 系统进行基因组编辑并纠正导致囊性纤维化的 CFTR 基因突变的可能性24。人类肠类器官是研究肠干细胞和上皮黏膜生物学的宝贵体系，同时也作为一种新型实验系统，可用于研究正常和异常的胃肠道生理功能。

胃肠道的上皮衬里处于持续更新状态。这一过程由肠干细胞（ISCs）的增殖所启动，ISCs持续产生子代细胞，以快速替换不断更替的肠上皮。包含ISCs的增殖区局限于隐窝底部。ISCs产生的子代细胞最终分化为吸收性或分泌性谱系。当细胞从隐窝移出并进入绒毛或表面上皮时，在向上迁移的过程中逐步分化，最终脱落进入管腔1。ISCs可生成所有类型的肠上皮细胞，包括肠吸收细胞、微皱褶细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、簇细胞和潘氏细胞。结肠的特征是具有细长的隐窝，主要由结肠细胞和杯状细胞构成，其间散在分布着少量肠内分泌细胞和簇细胞2。
ex vivo 培养系统是研究肠干细胞（ISC）维持和肠道组织稳态的有力工具。然而，组织培养技术难以完全模拟生理条件，且上皮微环境常发生改变，因此其可靠性受限3,4。ISC 研究领域的一项重大进展是建立了利用特定生长因子替代正常肠道微环境信号、以维持和扩增单个小鼠 ISC 的组织培养技术。Sato 等人描述了长期培养条件，其中来自肠上皮的单个隐窝或分离的干细胞可生长形成包含多个类似隐窝结构域的三维上皮结构5-7。这些三维结构可通过分裂持续扩增。有趣的是，来源于原始组织的所有特定肠细胞类型均能生成，并被挤入腔内8。通过对此系统的改进，可从胃、小肠和结肠生成上皮类器官。更具体而言，源自小肠的上皮类器官称为肠类器官（enteroids）9，源自结肠的则称为结肠类器官（colonoids）9,10。这些上皮类器官培养系统已被用于检测分离的单个细胞在体外（in vitro）是否具备干细胞功能，从而评估分离细胞的“干性”5,6,10-15。其他研究者则利用肠类器官和结肠类器官研究单个上皮细胞的功能16-21。因此，肠类器官和结肠类器官培养可用于评估干细胞与非干细胞的功能，为深入理解肠道内基本的细胞间相互作用提供新的视角。
2011年，Sato 及其同事建立了源自人类小肠和结肠的上皮类器官的长期培养体系22,23。除了培养基成分的差异外，人类上皮类肠体和类结肠体与其小鼠对应物具有相同的特征。此外，它们还可从病变组织（如巴雷特食管、腺瘤或腺癌以及囊性纤维化组织）中获得22,24。人类类肠体是研究肠道干细胞和上皮黏膜生物学的宝贵体系，同时也为研究正常与异常的胃肠道生理学提供了新的实验平台3。
本文介绍了从人小肠和结肠隐窝建立类肠器官（enteroids）和类结肠器官（colonoids）的方法（图1）。在此方法学综述中，我们重点阐述了从完整组织和活检样本中获取隐窝的操作步骤。我们回顾了成功培养和维持人类类肠器官与类结肠器官所必需的培养条件，并概述了利用该模型可开展的潜在实验策略。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;（DPBS）</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素/两性霉素B溶液</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A 条件培养基</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12 培养基</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（谷氨酰胺）</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel，GFR，无酚红（基底膜基质）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>人重组 Noggin</td><td>R&amp;D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>人重组 R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>人重组 EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>人 [Leu]15-胃泌素 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>噻唑伏林</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X），含酚红（细胞解离酶）</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze 培养基（冻存培养基）</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶检测</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>人重组 Wnt-3A</td><td>R&amp;D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 TOPflash 细胞系</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

胃肠道上皮不断更新并发生更替。这一过程由肠干细胞（ISCs）及其子代细胞的增殖所启动，这些细胞逐步迁移并向绒毛顶端分化。这些对胃肠道稳态至关重要的过程已通过多种方法得到广泛研究。Ex vivo 技术，尤其是原代细胞培养，已被证明在理解肠上皮功能方面具有广阔前景。目前已建立了一种针对小鼠肠隐窝的长期原代培养系统，可用于生成三维上皮类器官。这些上皮结构包含类似隐窝和绒毛的区域，与正常肠道上皮相似。通常，从小肠来源的称为“类肠器官”（enteroids），从结肠来源的称为“类结肠器官”（colonoids），它们不同于包含间充质组织的类器官。此外，这些类肠器官/类结肠器官可持续产生肠道上皮中正常存在的所有细胞类型。这种in vitro 类器官培养系统正迅速成为研究肠干细胞生物学和上皮细胞生理学的新金标准。该技术最近已被应用于人类肠道的研究。通过使用特定的培养基，已成功建立了来源于人小肠和结肠的上皮类肠器官和类结肠器官。本文中，我们描述了一种从人完整组织或活检样本中建立小肠和结肠隐窝来源培养系统的方法。我们重点强调了对人源类肠器官和类结肠器官成功生长与长期维持至关重要的培养条件。

图2D 显示了从完整组织中新鲜分离隐窝的典型示例（图2D）。从活检样本中分离出的隐窝数量低于完整组织。使用标准容量的带针活检钳时，我们通常在一次进镜过程中进行两次活检取样。每次活检取样可获得约10 mm2的组织表面，平均每份活检样本含有50至100个隐窝（图2F）。
在基底膜基质中培养后，隐窝会聚集成球，形成小肠类器官（enterospheres）和结肠类器官（colonospheres）。通常在接种后5至6天内出现隐窝出芽现象。然而，在基底膜基质中观察到形成类小肠球（enteroids）或类结肠球（colonoids）的球状结构也并不罕见（图3A-C；视频1）。传代可在培养7天后进行，具体时间取决于类器官的大小。从活检组织建立的类小肠球或类结肠球在培养过程中经历相同的发展过程。但由于接种时隐窝密度较低，通常在培养10至12天后进行传代（图4a,b）。类小肠球和类结肠球的培养能够以可重复的方式扩增。
类肠体和类结肠体均具有管腔面，并由上皮细胞衬覆（图5A、B）。在类肠体中可观察到增殖细胞，其位于芽状结构的顶端（图5C、D）。经E-钙黏蛋白（Ecad）染色的类肠体共聚焦成像显示了上皮细胞的分布（图5E）。
无论是源自遗传性或先天性疾病的患者组织，均可建立肠类器官和结肠类器官。图6展示了来自囊性纤维化患者（图6A）以及因上皮细胞黏附分子基因（EpCAM）先天性突变导致绒毛样肠病患者（图6B）的代表性肠类器官。除遗传缺陷外，这些肠类器官在基础状态下未表现出差异。
<img alt="肠隐窝分离示意图；类肠器官培养过程；DNA、蛋白质分析；功能检测。" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 肠隐窝解离及人源小肠类器官与结肠类器官培养的工作流程。 通过EDTA螯合法分离获取人小肠或结肠组织中的隐窝。培养的隐窝可形成小肠类器官（enteroids）和结肠类器官（colonoids）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="整体组织与活检样本对比、显微图像、组织学研究、细胞结构分析。" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 隐窝分离的解剖过程。（A）将小肠标本拉伸并平整固定于硅胶涂层培养皿中。（B）将黏膜层与下方的黏膜下层分离。（C）将分离出的黏膜层拉伸并平整固定于硅胶涂层培养皿中。（D）经EDTA螯合后，隐窝从组织中分离出来。（E）将一份活检样本拉伸并平整固定于硅胶涂层培养皿中。（F）经EDTA螯合后，隐窝从活检样本中分离出来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="隐窝细胞生长示意图；空肠、回肠、结肠。第1、3、7天的显微镜图像显示分化过程。" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 从完整组织建立隐窝培养及人源类肠体和类结肠体。（A）分离后，空肠隐窝接种于基底膜基质中。3至4小时后隐窝开始闭合，并在此之后逐渐膨胀形成肠球状结构。至第7天，空肠类肠体形成。（B）分离与培养后，回肠隐窝行为与空肠隐窝相似，形成回肠类肠体。（C）分离后，结肠隐窝接种于基底膜基质中。隐窝闭合并于7天后形成类结肠体（比例尺：100 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="十二指肠和结肠中微生物在7天内的生长情况，显微镜图像，实验分析。" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 从活检组织培养隐窝并生成人源类肠组织和类结肠组织。（A）分离后，将十二指肠隐窝接种于基底膜基质中。隐窝在接种后3至4小时闭合，随后逐渐膨胀，形成肠类球体。7天后，肠类器官形成。（B）分离并培养后，将结肠隐窝接种于基底膜基质中。隐窝闭合并先形成结肠类球体，7天后发育为结肠类器官（比例尺：100 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="器官组织显微图像；a：形态学，b：组织学，c-e：DAPI/EdU/ECAD荧光分析。" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 人肠类器官的肠系细胞谱系。（A）人肠类器官在培养6天后的形态。（B）图（A）中肠类器官的苏木精-伊红染色切片显示上皮层结构（比例尺：100 µm）。（C-D）经EdU染色（品红色）后的肠类器官共聚焦成像显示增殖细胞的存在。（E）肠类器官的共聚焦成像显示：上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（ECAD，绿色）的表达（比例尺：50 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="囊性纤维化显微镜检查、绒毛样肠病、上皮改变、比较类器官分析。" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 从病变组织建立隐窝培养和人类肠类器官。（A）由囊性纤维化样本建立的肠类器官。（B）由先天性绒毛样肠病样本建立的肠类器官（比例尺：100 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1. 培养中形成的人类肠类器官的肠球体。 32 小时延时视频显示，源自人小肠的肠球体在培养过程中回缩并形成肠类器官。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂名称</td>
			<td>公司</td>
			<td>目录号</td>
			<td>溶剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>评论</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含钙杜氏磷酸盐缓冲液2+，Mg2+ 无钙镁DPBS</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙二胺 
			四乙酸（EDTA）</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>超纯去离子水2O</td>
			<td>0.5 M</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>山梨醇</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>粉末</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蔗糖</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>粉末</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>粉末</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gzntamycin/两性霉素B溶液</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>R-015-10</td>
			<td>-</td>
			<td>500x</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A 条件培养基</td>
			<td>自主研发</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高级DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>-</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX （谷氨酰胺）</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>-</td>
			<td>100X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>-</td>
			<td>100X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 补充剂</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>-</td>
			<td>100X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 补充剂</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>-</td>
			<td>50X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-乙酰半胱氨酸</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>烟酰胺</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基质胶，生长因子减少型，无酚红 （基底膜基质）</td>
			<td>康宁</td>
			<td>356231</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>必需的</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人重组Noggin</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>6057-NG/CF</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>100 μg 毫升</td>
			<td>100 ng/ml</td>
			<td rowspan="3">其他供应商：R&amp;D；Anaspec 和 Preprotech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人重组R-Spondin</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>1 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人重组EGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
			<td>DBPS</td>
			<td>500 μg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>500 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-5MG</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人[Leu]15-胃泌素1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2.5 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2.5 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express 酶（1X），酚红 细胞解离酶</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>用于传代</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>用于传代</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Synth-a-Freeze 培养基 （冻存液）</td>
			<td>Life technologies；Gibco</td>
			<td>A13713-01</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>用于冷冻</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A 细胞系</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Wnt-3A 条件培养基的制备</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>海肾荧光素酶检测</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2710</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Wnt-3A 条件培养基活性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人重组Wnt-3A</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>5036-WN/CF</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>100 μg 毫升</td>
			<td>100 ng/ml</td>
			<td>Wnt-3A 条件培养基活性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 TOPflash 细胞系</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Wnt-3A 条件培养基活性；由 Hans Clevers 实验室惠赠</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 详细试剂清单，包含推荐的生产厂家及目录号。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>仪器</td>
			<td>耗材</td>
			<td>工具</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>15- 和 50 ml 锥形管</td>
			<td>Dumont #5 标准镊子 (F.S.T.; #11251-20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 培养箱</td>
			<td>微量离心管</td>
			<td>Dumont #7 弯头精细镊子 (F.S.T.; #11274-20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体视显微镜</td>
			<td>24 孔板</td>
			<td>精细剪刀 (F.S.T.; #14060-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离心机</td>
			<td>0.22 μm 滤器 (Sartorius)</td>
			<td>Vannas 弹簧剪刀 (F.S.T.; #15018-10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>旋转摇床</td>
			<td>移液管</td>
			<td>直径 0.2 mm 的微量固定针 (F.S.T.; #26002-20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冷冻容器 (Nalgene)</td>
			<td>移液器吸头</td>
			<td>直径 0.1 mm 的微量固定针 (F.S.T.; #26002-10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 硅胶 (Dow Corning)</td>
			<td>150 μm 孔径尼龙筛网 (Dynamic Aqua-supply)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>玻璃培养皿</td>
			<td>5 ml 圆底聚丙烯管 (Falcon)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>移液管助吸器</td>
			<td>18G 钝头填充针 (BD)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微量移液器</td>
			<td>带鲁尔锁扣头的 3 ml 注射器 (BD)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>冻存管</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 隐窝分离与培养所需的详细耗材、工具和设备。

我们介绍了一种从手术组织和活检样本中获取的小肠隐窝和结肠隐窝建立人类肠类器官和结肠类器官的方法。在这篇方法学文章中，我们介绍了成功培养和维持人类肠类器官与结肠类器官所必需的培养模式。

胃肠道上皮不断更新，其细胞持续更替。这一过程由肠干细胞的增殖所启动……

本实验的总体目标是从肠道组织中生成人类肠类器官。首先从底层的黏膜下组织中解剖出肠黏膜，实现这一目标。第二步是用EDTA孵育黏膜，以促进上皮与结缔组织的分离。接下来，将肠隐窝从解离的上皮组织中分离出来。最后，将肠隐窝在基底膜基质中进行培养。最终，通过免疫组织化学技术检测培养的类器官中上皮结构的形成以及特定上皮标志物的表达。该方法的意义在于，我们现在能够利用患者特异性活检组织生成类器官（OID），这意味着我们现在可以在实验室中利用这些组织来研究肠道疾病及其诊断，而在此前我们从未能够做到这一点。根据文本方案配制缓冲液和试剂后，将基底膜置于冰上解冻，并在组织收到后，提前将24孔板放入37摄氏度、含二氧化碳的培养箱中预孵育。使用不含钙和镁的KO PBS或DPBS清洗组织，直至DPBS变为澄清。将组织置于盛有冰冻 DPBS 的硅胶涂层玻璃培养皿中，黏膜面朝上，用穆努金针通过拉伸并固定组织。接着，在解剖显微镜下，使用显微解剖剪和尖头弯镊去除黏膜下层及结缔组织。然后，保持黏膜面朝上，将解剖好的黏膜在硅胶涂层玻璃培养皿上展平并用针固定。使用弯头镊子轻轻刮取黏膜表面。此步骤对于提高制备质量十分必要。用新配制的 2 毫摩尔 EDTA 螯合缓冲液覆盖黏膜。然后，在解剖显微镜下根据文本方案用冰上洗涤组织三到四次后，使用弯头镊子轻轻刮取黏膜，用移液管释放肠隐窝。轻柔地将隐窝悬液从培养皿中移出，并转移至50毫升锥形管中。随后检查组织，以确保几乎所有隐窝均已从黏膜中去除。将隐窝悬液通过150微米滤膜过滤两次，并使用显微镜检查滤过物。按照文本方案，在洗涤隐窝悬液并将所需数量的隐窝转移至5毫升圆底管后，以150 ×g、4°C离心10分钟。然后使用预冷的移液器吸头去除上清液，并加入基底膜基质重悬隐窝沉淀。将50微升基底膜基质中的隐窝悬液缓慢加入预热板的每孔中心位置。在37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育30分钟，使基底膜基质完全聚合。随后，在基底膜基质上覆盖500微升完全型人源迷你肠道培养基，并添加2.5微摩尔的CHIR 90221。然后，Thien 对组织进行孵育，两天后更换培养基，之后每隔一天更换一次。该图显示了从完整组织中 freshly 分离的隐窝的典型示例。从活检组织中分离的隐窝数量少于完整组织中的隐窝数量。通常一次活检取两个组织样本。每个活检样本可获得约10平方毫米的组织表面，每次活检平均可得到50至100个隐窝。经过5至6天的培养并在基底膜基质中生长后，隐窝细胞会聚集成球，形成小肠类器官（entero spheres）或结肠类器官（colono spheres），并在第7天进行传代。此处所示的来自活检组织的肠类器官或OID在接种时以较低密度进行培养，其发育过程相同。因此，通常在培养10至12天后进行传代。如图所示，肠类器官和OID均具有管腔面，并由上皮细胞层覆盖。在OIDs中可以观察到增殖细胞，它们位于芽尖部位。使用e-cadherin（绿色）染色的OIDs共聚焦成像显示了上皮细胞。该图展示了来自一名囊性纤维化患者以及一名因上皮细胞黏附分子基因先天性突变导致绒毛样肠病患者的肠类器官。采用此实验流程或类似实时 PCR 或 Western 印迹等方法，可用于回答有关特定基因或探针的进一步问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何稳定地分离人类 CRISPR 组分，从而在实验室中高效构建基因编辑系统，以解答针对患者个体化问题的科学疑问。

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

从整体组织和活检建立人类上皮Enteroids和Colonoids的

本文描述了一种建立原代小鼠结肠肿瘤类器官的简单方法。该方法利用了结肠肿瘤细胞能够在含有有限生长因子的培养基中存活并生长成类器官，而正常结肠上皮细胞则不能的特性。...

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本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

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类肠器官正在成为研究人类疾病的一种新型模型。本方案描述了如何利用从新生儿组织获得的类肠器官，通过脂多糖（LPS）处理来模拟人类坏死性小肠结肠炎的类肠器官模型。所获得的类肠器官表现出类似于人类坏死性小肠结肠炎的炎症变化。...

一种新型的人类上皮类肠体坏死性小肠结肠炎模型

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

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类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

在本实验方案中，我们描述了如何直接从肠隐窝分离并培养小鼠原代结肠上皮单层细胞。我们提供了在可渗透滤膜上生成汇合单层细胞的实验方法，用于划痕伤口愈合及生物化学研究的汇合单层细胞培养方法，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层细胞培养方法。...

从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。...

体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

本方案详细描述了从胎儿肠道组织建立类肠体（enteroid）这一三维肠道模型的过程。采用上皮生物标志物的免疫荧光成像对模型进行了表征。通过显微注射技术将细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide）施加于上皮顶端，可诱导上皮通透性增加，其程度呈剂量依赖性，并通过荧光标记葡聚糖的渗漏情况进行测定。...

检测胎儿组织来源类肠体的上皮通透性

我们描述了一种从小鼠结肠隐窝中分离并建立三维结肠类器官的实验方案。所建立的结肠类器官可进一步终末分化，以模拟宿主上皮细胞的组成，随后可用于炎症刺激实验，或进一步诱导形成上皮单层细胞模型。...

研究肠道炎症对上皮的影响 体外 已建立的小鼠结肠类器官

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。...

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

学习从人体小肠和结肠隐窝建立肠类器官和结肠类器官的方法。该技术利用EDTA解离和基底膜基质培养，支持患者特异性肠道疾病研究与个性化医疗应用。

从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

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