从整体组织和活检建立人类上皮Enteroids和Colonoids的
2015年3月6日
我们描述了一种从小肠隐窝中建立人肠样体和从手术组织和活检中收集的结肠隐窝中建立结肠样体的方法。在这篇方法学文章中，我们介绍了对人类肠样体和结肠样体的成功生长和维持至关重要的培养方式。
该程序的总体目标是从肠道组织产生人体进入。这是通过首先从下面的粘膜下组织中解剖肠粘膜来实现的。第二步是将粘膜与 EDTA 孵育，以促进上皮与结缔组织的解离。
接下来，肠隐窝与解离的上皮分离。最后，将肠隐窝在基底膜基质中培养。最终，免疫组织化学技术用于显示培养的 OID 的上皮组织以及特异性上皮标志物。
这种方法的意义在于，我们现在可以从患者特定的活检中生成 OID，这意味着我们现在可以在实验室中使用该组织来查看肠道疾病和诊断，这在以前我们从未能够做到。制备缓冲液和试剂后，根据文本方案，在冰上解冻基底膜，并在收到组织后在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中预孵育 24 孔板。使用不含钙和镁的 KO PBS 或 DPBS 洗涤组织，直到 DPBS 澄清。
将组织放入装满冰冷 DPBS 的硅胶涂层玻璃培养皿中，粘膜面朝上，并用细粒针通过拉伸和固定组织来固定组织。接下来，在解剖显微镜下，使用显微解剖剪刀和细尖弯曲镊子从粘膜下层和结缔组织中去除下面的粘膜。然后，将粘膜面朝上，将解剖的粘膜平放在硅胶涂层的玻璃培养皿上
。使用弯曲的镊子轻轻刮擦粘膜表面。此步骤对于提高制剂质量是必要的。用新鲜制备的两毫摩尔 EDTA 螯合缓冲液覆盖粘膜。
然后在冰上洗涤组织后，在解剖显微镜下根据文本方案三到四次，用弯曲的镊子轻轻刮擦粘膜，用移液管释放肠隐窝。轻轻地从培养皿中取出隐窝悬液，并将其转移到 50 毫升锥形管中。然后检查组织，确保几乎所有的隐窝都已从粘膜中去除。
通过 150 微米过滤器过滤隐窝悬浮液两次，并使用显微镜检查流经后洗涤隐窝悬浮液并将所需的隐窝数量转移到 5 毫升圆底管中，根据文本方案，将隐窝部分在 150 Gs 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。然后使用预冷的移液器吸头和基底膜基质重悬去除上清液。地穴颗粒。
通过将基底膜基质缓慢弹出孔中心的基底膜基质，将每孔 50 微升隐窝悬浮液涂抹到预热板上。将板在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 30 分钟，以使基底膜基质完全聚合。然后用 500 微升完全人微型肠道培养基覆盖基底膜基质，并补充有 2.5 微摩尔的 CHIR 9 0 2 2 1。
Thien 在两天后孵育组织更换培养基，此后每隔一天更换一次。该图显示了从整个组织中新鲜分离的隐窝的典型示例。从活检中分离出的隐窝数量少于整个组织中的数量。
两次活检咬合通常一次进行。每次活检咬合都会产生 10 平方毫米的表面，平均每次活检有 50 到 100 个瘸子。在培养和基底膜基质 5 到 6 天后，Crips 聚集形成小肠的肠球和结肠的结肠球，并在 7 天后传代。
从此处显示的活检中建立的进入或 OID 在接种时以较低的密度经历相同的发育。因此，包装通常在培养 10 至 12 天后完成。如此处所示，OID 和 OID 都呈现管腔侧，并衬有上皮。
增殖细胞可以在 OID 中观察到，并且位于芽尖内。用 e catrin 染色的 OID 的共聚焦成像，此处以绿色显示上皮细胞。该图显示了由于上皮细胞粘附分子基因先天性突变而导致的囊性纤维化和簇状肠病患者的进入物生长。
遵循此程序或方法（如实时 PCR 或蛋白质印迹）可用于回答有关目标基因或问题的其他问题。观看此视频后，您应该对如何始终如一地分离人类 Crips 有一个很好的了解，以便能够在实验室中有效地生成入口来回答患者的特定问题。
概述
本文描述了一种从小肠隐窝建立人类肠类结构体和从结肠隐窝建立结肠类结构体的方法。该协议概述了成功生长和维持这些类器官的基本培养模式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 胃肠病学
背景
- 人类肠类结构体和结肠类结构体源自肠道组织。
- 该方法允许对肠道疾病进行患者特异性研究。
- 之前的技术缺乏有效利用患者活检的能力。
- 免疫组织化学被用于分析上皮组织的组织。
研究目的
- 从肠道组织中生成人类类器官。
- 促进肠道疾病和诊断的研究。
- 改善对培养中上皮细胞行为的理解。
使用的方法
- 从黏膜下组织分离肠道黏膜。
- 使用EDTA孵育以进行上皮分离。
- 在基底膜基质中培养肠道隐窝。
- 使用共聚焦成像和免疫组织化学进行分析。
主要结果
- 成功从活检中分离出肠道隐窝。
- 生成模仿肠道结构的类器官。
- 观察到类器官内的增殖细胞。
- 展示了患者特异性类器官的发育。
结论
- 该方法允许高效生成人类肠类结构体。
- 它为研究患者特异性肠道条件开辟了途径。
- 未来的应用包括基因表达分析和疾病建模。
常见问题
Executive Industry Relevance
Human enteroid and colonoid models provide a physiologically relevant system for studying intestinal epithelial biology and disease mechanisms. This approach enables patient-specific disease modeling, supporting target validation and preclinical de-risking in gastroenterology-focused drug discovery programs. The method bridges discovery biology with translational research by generating scalable, reproducible human-derived tissue models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived intestinal epithelial cells that maintain native cellular diversity and polarity.
- Operational Value: Supports functional target validation by modeling disease-relevant epithelial phenotypes from biopsy material.
- Translational Value: Enhances predictive confidence by preserving patient-specific genetic backgrounds in a scalable 3D culture system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized epithelial monolayers and spheroids suitable for high-content imaging and compound screening workflows.
- Quantitative Output: Enables measurement of epithelial organization, proliferation, and differentiation via immunohistochemistry and confocal imaging.
- Reproducibility: Establishes consistent crypt isolation and culture conditions critical for assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Facilitates study of patient-specific intestinal conditions such as cystic fibrosis and tufting enteropathy using biopsy-derived organoids.
- Preclinical Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining epithelial structure and stem cell activity over time.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of organoid phenotypes with clinical biomarkers for risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing human epithelial models for target engagement studies, pathway modulation assays, and toxicity screening prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled manipulation of patient-derived intestinal epithelia.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound screening via standardized crypt seeding and matrix embedding.
- Analytics: Provides imaging-based readouts (e.g., epithelial polarity, proliferation markers) that enable comparative analysis across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving patient-specific mutations and epithelial phenotypes relevant to gastrointestinal disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a renewable platform for multi-project use in target validation, mechanism of action studies, and safety profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through physiologically relevant human epithelial models.
- Operational Value: Standardized dissociation and culture protocols ensure reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early preclinical assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on efficacy and toxicity in human-derived intestinal systems.
Implementation Considerations
- Expertise in tissue dissection, crypt isolation, and 3D culture techniques is required for successful organoid generation.
- Access to basement membrane matrix, defined culture media, and CO2-controlled incubators is essential for consistent organoid formation.
- Standardization of biopsy processing and crypt quantification is necessary for cross-functional collaboration and data comparability.
- Adaptation to different intestinal regions (e.g., ileum vs colon) requires optimization of dissociation and culture conditions.
- Long-term maintenance demands regular passaging and medium changes to prevent differentiation loss and overgrowth.
