通过成熟脂肪细胞在顶壁培养中的去分化生成人类脂肪源性干细胞
2015年3月7日
成熟的脂肪细胞可能通过去分化成为干细胞的丰富来源，从而产生一群均一的成纤维细胞样细胞。使用胶原酶消化法从人体脂肪中分离成熟的脂肪细胞。本实验方案的目标是从人成熟脂肪细胞中获得具有多向分化潜能的去分化脂肪细胞。
成熟的脂肪细胞具有在体外分化为前体细胞的能力。这一过程通过悬浮培养技术实现，该技术将成熟细胞接种于完全充满培养基的培养瓶中，并倒置培养。悬浮的细胞会附着于培养瓶表面，并发生形态学改变，从富含脂质的圆形细胞转变为细长的成纤维细胞样细胞，最终形成均一的细胞群体。
在实验室接收组织样本后，可获取并处理得到细长形细胞群体。根据所需脂肪细胞的数量称取脂肪组织，将适量样本置于50 ml离心管中。用于消化时，每克组织预计可获得约100万个细胞。
每25 cm²培养瓶接种500,000个细胞，每六孔板每孔接种50,000个细胞，加入含胶原酶的KRH工作缓冲液，用剪刀剪碎组织，并在37°C下孵育45分钟。孵育期间，准备导管和注射器装置。用镊子将半透明溶液通过尼龙网过滤至塑料烧杯中。
将细胞悬液轻轻通过滤网并用5 ml KRH工作缓冲液冲洗。将过滤后的细胞悬液转移至50 ml离心管中，使用带注射器的装置。静置成熟脂肪细胞约10分钟。
细胞将通过浮力上浮至缓冲液顶部。从底部缓慢吸出缓冲液。使用注射器和导管加入20 ml KRH工作缓冲液进行洗涤。
重复洗涤步骤两次。收集缓冲液，将脂肪细胞悬液调整至终体积为5 ml，然后使用血细胞计数板进行细胞计数。用补充有20%小牛血清的D-M-E-M-F12培养基填充T25培养瓶至其体积的四分之三，将500,000个成熟脂肪细胞转移至该培养瓶中。用培养基补足体积，并去除液面表面的气泡。
将一个自制的瓶盖拧到烧瓶上。将烧瓶倒置，在含有5%二氧化碳的细胞培养孵育箱中孵育一周。避免移动烧瓶，因为残留的气泡可能会影响细胞的贴壁。
将盖玻片置于孔板底部。将塑料衬套放入孔中，并向孔内加入 8 mL 培养基，确保无气泡产生。
将盖玻片置于套管上，留出空间以便插入移液器吸头。取 50,000 个细胞，将吸头插入盖玻片与套管之间进行注射。将培养板置于含 5% 二氧化碳的细胞培养孵育箱中孵育一周或更短时间。
根据实验设计，细胞至少需要三天时间才能在另一块培养板的盖玻片上贴壁。将盖玻片转移至 2 mL 培养基中继续培养。在持续培养后，可将盖玻片用甲醛固定，用于免疫荧光实验，或用于 DNA-RNA 和蛋白质提取。
成熟脂肪细胞的去分化会导致细胞形态发生显著变化。在此过程中，脂肪细胞会失去其表型特征，并降低通常与其脂质储存功能相关的转录本表达水平。该免疫荧光图像展示了处于不同去分化阶段的脂肪细胞。
呈圆形形态的细胞仍表达成熟脂肪细胞标志物 FABP4，而伸长的细胞则不再表达该标志物，此结论基于文献报道。D 型分化脂肪细胞（常称为 D 型脂肪细胞）可从年轻、年老、瘦弱或 OB 型基础患者的样本中获得。这些细胞具有长期培养能力，并已证实具备多向分化潜能。
我也看好它们在组织工程和细胞治疗中的潜力。它们可能为特定脂肪细胞生理学的后续研究提供一种新模型。
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概述
本研究探讨了成熟脂肪细胞去分化为多能干细胞的过程。通过采用胶原酶消化和封离培养技术，研究人员能够分离并培养这些细胞，从而获得一群均一的成纤维细胞样细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞研究
- 脂肪细胞生物学
- 细胞培养技术
背景
- 成熟的脂肪细胞可以去分化为前体细胞。
- 该过程可通过特定的体外培养方法实现。
- 脂肪细胞的分离对于获取干细胞至关重要。
- 胶原酶消化是细胞分离的标准方法。
研究目的
- 从人成熟脂肪细胞中获取多能性去分化脂肪细胞。
- 建立分离与培养这些细胞的实验方案。
- 研究去分化过程中形态学的变化。
使用的方法
- 使用胶原酶消化法分离成熟脂肪细胞。
- 采用密封培养技术促进去分化。
- 通过细胞形态学评估确认去分化状态。
- 根据组织重量定量细胞得率。
主要结果
- 每克脂肪组织成功分离出约100万个细胞。
- 去分化细胞表现出细长的成纤维细胞样形态。
- 通过所述方法获得了均一的细胞群体。
- 证明了成熟脂肪细胞作为干细胞来源的潜力。
结论
- 成熟的脂肪细胞可被有效转化为多能干细胞。
- 文中所述方法为干细胞研究提供了可靠的途径。
- 本研究有助于加深对脂肪细胞可塑性的理解。
常见问题
行业重要性概述
成熟脂肪细胞去分化为多能干细胞为再生医学和组织工程应用提供了新的细胞来源。该方法能够实现脂肪细胞功能和代谢特性的脂肪库特异性表征，有助于代谢疾病研究中的靶点验证。该技术为生成具有明确多向分化潜能的成纤维细胞样细胞提供了可扩展的平台，有利于临床前模型的构建以及以脂肪细胞为靶向的治疗药物发现中的机制性风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究脂肪细胞可塑性，并在代谢性疾病通路中进行治疗假设的验证。
- 操作价值：通过特定脂肪库的脂肪细胞分离，提供一个可重复的功能性靶点验证系统。
- 科学价值：通过生成去分化细胞的均一细胞群，支持通路解析，提高预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过标准化的胶原酶消化和顶壁培养技术，为后续实验流程制备经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过可控的脂肪细胞产量（约每克组织100万个细胞），确保实验的标准化和可重复性。
- 科学价值：利用成纤维细胞样细胞进行可靠的化合物评估，并以FABP4下调作为去分化标志物加以确认。
转化与临床前研究
- 科学价值：支持针对脂肪细胞生理学的疾病相关系统开发，用于特定部位的研究。
- 操作价值：通过去分化脂肪细胞的长期培养能力，确保从发现到临床前验证的转化连续性。
- 科学价值：通过展示D-脂肪细胞的多向分化潜能和组织工程潜力，促进基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法可整合到从早期靶点验证、先导化合物鉴定直至临床前研究的整个发现流程中，尤其适用于代谢性疾病和再生医学项目。
- 发现生物学：通过体外建模脂肪细胞去分化，支持假设验证和生物学风险降低。
- 筛选：通过标准化的细胞分离和形态学评估，提供可直接用于检测的细胞模型及定量输出结果。
- 分析：提供可量化的检测指标，例如FABP4表达水平的变化，以比较不同条件下脂肪细胞去分化状态。
- 转化研究：通过已证实的去分化脂肪细胞的长期培养能力和多向分化潜能，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复利用的技术能力，用于在多个特定脂肪库的研究中生成脂肪细胞来源的干细胞。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低脂肪细胞表型转换中的机制模糊性，实现可预测的置信度。
- 操作价值：通过明确定义的胶原酶消化和倒置培养方案，实现标准化和可扩展性。
- 战略价值：在先导化合物优化之前，通过实现特定脂肪库的代谢特性表征，支持更优的立项/终止决策。
- 项目组合影响：通过经验证的干细胞产量和分化潜能评估，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备原代脂肪细胞分离和胶原酶消化技术的专业知识。
- 需要具备能够维持倒置培养瓶或6孔板顶面培养的细胞培养基础设施。
- 要求不同研究团队之间进行标准化操作，以确保各实验室间脂肪细胞得率和去分化评估的一致性。
- 在将该方案应用于不同解剖部位的脂肪组织或具有不同供体特征的样本时，需考虑适应性调整。
- 存在一些实际限制因素，例如在倒置培养过程中需精确加注培养基以防止气泡干扰。
