通过成熟的脂肪细胞在天花板文化去分化代人脂肪干细胞
March 7th, 2015
成熟脂肪细胞可能通过去分化代表干细胞的丰富来源，这导致成纤维细胞样细胞群的均匀。胶原酶消化用于从人类脂肪中分离成熟的脂肪细胞。我们方案的目标是从人类成熟脂肪细胞中获得多能、去分化的脂肪细胞。
成熟的 depos 具有在体外分化为前体细胞的能力。这是通过海豹培养实现的，海豹培养是一种技术，其中成熟细胞在培养瓶中培养，培养瓶完全装满培养基并倒置培养。漂浮细胞粘附在培养瓶上并改变其形态，从充满脂质的圆形细胞转变为细长的成纤维细胞样细胞。均匀。
在实验室接收组织样本后，可以获得和治愈细长细胞群。称量脂肪组织，根据所需的脂肪细胞数量，将适当体积的样品放入 50 ml 中。2 用于消化，您可能希望每克组织获得大约 100 万个细胞。
吊架培养是用每 25 厘米培养瓶 500， 000 个细胞和六孔板的每个孔 50， 000 个细胞进行，加入补充有胶原酶的 KRH 工作缓冲液，用剪刀切碎组织，并在 37 摄氏度下孵育制备物 45 分钟。在孵育过程中，准备管道和注射器设置。通过尼龙网将半透明溶液倒入带有镊子的塑料烧杯中。
通过网眼摩擦细胞制剂，并用 5 ml KRH 工作缓冲液精细洗涤。将过滤的细胞悬液转移到 50 ml 两套中，用试管和注射器。让我们将成熟的脂肪细胞静置约 10 分钟。
细胞将通过浮选到达缓冲液的顶部。从底部慢慢吸出缓冲液。使用注射器和管道，加入 20 ml KRH 工作缓冲液进行洗涤。
重复洗涤步骤两次。收集缓冲液，使脂肪细胞悬液的最终体积达到 5 ml，然后使用血细胞计数器对细胞进行计数，用补充有 20% 小牛血清的 D-M-E-M-F 12 将 T 25 培养瓶填充至其体积的四分之三，将 500， 000 个成熟脂肪细胞转移到培养瓶中。用培养基填充培养瓶，并去除顶部表面的气泡。
将发明的瓶盖拧到培养瓶上。将培养瓶倒置在含有 5% 二氧化碳的细胞培养箱中孵育一周。避免培养瓶移动，因为残留的气泡可能会破坏细胞粘附。
将盖玻片放在孔的底部。将塑料衬套加入孔中，并在孔中加入 8 ml 培养基。确保没有气泡。
在衬套上放一个盖玻片，留出空间插入移液器吸头。对 50， 000 个细胞进行采样，并将吸头放在盖玻片和衬套之间进行注射。将板在含有 5% 二氧化碳的细胞培养箱中孵育一周或更短时间。
根据实验设计，细胞至少需要三天才能粘附到不同板中的盖玻片上。将盖玻片倒入 2 ml 培养基中。在继续培养中，盖玻片可以固定在福尔马林中，用于免疫荧光实验或 D-N-A-R-N-A 和蛋白质提取。
成熟脂肪细胞去分化导致细胞形态发生重大变化。在此过程中，脂肪细胞失去其表型并降低通常与其脂质储存功能相关的转录物的表达。该免疫荧光图像代表了处于各种去分化状态的脂肪细胞。
具有圆形形态的细胞仍然表达 FABP 4，这是一种成熟的脂肪细胞标志物，而细长的细胞不再表达它 根据文献。D 分化脂肪细胞，通常称为 D 脂肪细胞，可以从年轻、老年瘦或 OB 基础患者那里获得。它们的长期培养能力和已证明的多效性。
我也喜欢它们在组织工程和细胞治疗方面的潜力。它们可能代表了脂肪细胞生理学后特异性研究的新模型。
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概览
本研究探讨了成熟脂肪细胞向多能干细胞的去分化过程。通过利用胶原酶消化和密封培养技术，研究人员可以分离和培养这些细胞，以获得一种同质的成纤维细胞样细胞群体。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞研究
- 脂肪细胞生物学
- 细胞培养技术
背景
- 成熟脂肪细胞可以去分化为前体细胞。
- 这个过程可以通过特定的培养方法在体外进行。
- 脂肪细胞的分离对于获得干细胞至关重要。
- 胶原酶消化是细胞分离的标准方法。
研究目的
- 从人类成熟脂肪细胞获得多能去分化脂肪细胞。
- 建立分离和培养这些细胞的协议。
- 调查去分化过程中的形态变化。
使用的方法
- 胶原酶消化用于分离成熟脂肪细胞。
- 密封培养技术促进去分化。
- 细胞形态评估以确认去分化。
- 基于组织重量对细胞产量进行量化。
主要结果
- 每克脂肪组织成功分离约100万个细胞。
- 去分化细胞呈现细长的成纤维细胞样形态。
- 通过描述的方法获得了同质的细胞群体。
- 展示了成熟脂肪细胞作为干细胞来源的潜力。
结论
- 成熟脂肪细胞可以有效地转化为多能干细胞。
- 所概述的方法为干细胞研究提供了可靠的方法。
- 本研究有助于理解脂肪细胞的可塑性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Dedifferentiation of mature adipocytes into multipotent stem cells offers a novel source for regenerative medicine and tissue engineering applications. This approach enables depot-specific characterization of adipocyte function and metabolic properties, supporting target validation in metabolic disease research. The method provides a scalable platform for generating fibroblast-like cells with demonstrated multi-potency, facilitating preclinical model development and mechanistic de-risking in adipocyte-focused therapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipocyte plasticity and therapeutic hypothesis testing in metabolic disease pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through depot-specific adipocyte isolation.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by generating homogenous populations of dedifferentiated cells for pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized collagenase digestion and ceiling culture techniques.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via controlled adipocyte yield (approximately 1 million cells per gram of tissue).
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation using fibroblast-like cells with confirmed FABP4 downregulation as a dedifferentiation marker.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system development for post-specific investigation of adipocyte physiology.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via long-term culture capacity of dedifferentiated fat cells.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by demonstrating multi-potency and tissue engineering potential of D-fat cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, particularly for metabolic disease and regenerative medicine programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by modeling adipocyte dedifferentiation in vitro.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through standardized cell isolation and morphology assessment.
- Analytics: Provides measurable readouts such as FABP4 expression changes to compare dedifferentiation states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through demonstrated long-term culture and multi-potency of dedifferentiated adipocytes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating adipocyte-derived stem cells across multiple depot-specific investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in adipocyte phenotype switching.
- Operational Value: Standardization and scalability via defined collagenase digestion and inverted culture protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling depot-specific metabolic property characterization prior to lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through validated stem cell yield and differentiation potential assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary adipocyte isolation and collagenase digestion techniques.
- Necessitates cell culture infrastructure capable of maintaining inverted flask or 6-well plate ceiling cultures.
- Demands cross-team standardization for consistent adipocyte yield and dedifferentiation assessment across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to adipose tissue from different depots or donor characteristics.
- Includes practical limitations such as the requirement for precise media filling to prevent bubble disruption during inverted culture.
