斑马鱼角质形成细胞外植体用于研究皮肤伤口愈合中的集体细胞迁移与再上皮化

本实验的总体目标是建立斑马鱼角质细胞的体外培养体系，用于研究细胞集体迁移和上皮伤口愈合。该目标首先通过从麻醉的成年斑马鱼体表取下附有上皮组织的鳞片来实现。将带有附着组织的鳞片放入培养皿中，以使细胞得以贴壁生长。

然后根据实验设计加入培养基以及相应的处理因素。最后，将细胞在设定的时间段内进行孵育，并通过视频显微镜进行观察。最终，可采用多种检测方法来展示细胞迁移能力或细胞形态的变化，以及随时间推移蛋白质或其他标志物的表达情况。

与现有的转化细胞培养方法相比，该技术的主要优势在于外植体培养属于原代培养，其特性更接近体内细胞的特性。该方法有助于回答上皮伤口愈合领域中的关键问题，例如集体迁移以及上皮-间质转化的作用。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为鳞片可能无法附着于生长表面，或在特定培养皿中无法生长。

本次实验操作将由本实验室的医学学生 Jose Rap Pan、高级研究助理 Chana TI 以及高级研究助理 Agnes Pasquale 演示。为准备本实验，使用市售除氯剂或静置 24 小时的方法，对约 1.5 升自来水进行除氯处理，然后取 500 毫升分别加入三个 1 升烧杯中。将其中一个烧杯标记为用于存放操作前的鱼类，第二个烧杯用于恢复，第三个烧杯用于其他用途。

加入三卡（trica）至终浓度为 100 微克/毫升。为麻醉鱼类，将一个浅盘装满冰。将培养基预热至室温，并准备好干净的珠宝镊子。

用镊子尖浸入70%乙醇中，然后通过本生灯火焰灼烧，使乙醇燃烧去除，从而清洁镊子。捕获所需数量的鱼并放入暂养烧杯中。将其中一条鱼转移至麻醉用烧杯中。

根据文本方案将鱼麻醉后，将其转移至冰上，并水平放置，使尾部朝向持镊子的手。去除鳞片时，将镊子与鱼体平行放置。将镊子尖端置于鳞片边缘，轻轻将镊子的扁平侧压入鱼体侧面，使鳞片从鱼体上翘起。

用镊子夹住鳞片，拔下后不要翻转，直接放入组织培养皿中。重复此操作，从一条大型成鱼身上最多取12片鳞片，避免取自鳃区、侧线和鳍部。将鱼放入恢复烧杯中，并观察以确保其从麻醉状态中恢复。

然后将鱼转移到单独的水族箱中，让鱼恢复21天，以实现鳞片的完全再生。根据实验需要，每个35毫米塑料组织培养处理培养皿中可放置多达20片鳞片，或每个玻璃培养皿中放置4至6片鳞片。

将组织块放入底部培养皿中，轻轻加入1.2毫升完全培养基，使组织块贴附于培养皿底部。将X explant培养物在28摄氏度条件下孵育所需时间，可选择是否进行处理，随后进行显微镜观察。从培养箱中取出含有细胞膜片的培养皿后，将其放置于显微镜载物台上。

使用4倍物镜进行初始对焦，以便于随时间推移进行图像采集。在载物台上标记每张细胞膜片的位置或培养皿的朝向。根据实验方案在不同时间点拍摄细胞膜片的图像；若实验仅需静态图像，则拍摄后将培养皿放回培养箱。

为进行免疫荧光显微镜检测而固定样品时，需在室温下配制并预热相关溶液。为在荧光下观察卵清蛋白（OSE）位点，使用玻璃底35毫米培养皿培养茄子，具体方法如本视频前面所述；无需移除培养基，直接向每皿中加入0.8毫升含4%多聚甲醛的1.1倍磷酸盐缓冲液（1.1×PBS）。于室温孵育5分钟。

然后吸除溶液。向每皿中加入额外的 0.8 毫升固定剂，再次孵育 5 分钟后吸除溶液。除非使用外部配体或表位，否则通过加入 0.5 毫升含 0.2% TRITON X-100 的 1×PBS 溶液孵育 5 分钟以透化细胞。

在去除溶液前，加入0.5毫升含1% BSA的1×PBS，室温孵育1小时，或4摄氏度过夜。孵育结束后，吸去溶液，随后进行抗体染色。或者，加入1至2毫升含1% BSA的1×PB，于4摄氏度保存3至4周。进行免疫荧光实验。

根据此处所示的文字方案，在建立EXPLAN培养后的数小时内，即可观察到角质细胞片从鳞片下方迁移出来。偶尔也可观察到个别角质细胞脱离集体迁移的细胞片，单独进行迁移。细胞片初始的迁移速度非常迅速，但在培养的前48小时内，随着细胞的铺展，迁移速度迅速减慢。

这种快速增加与细胞增殖无关，因为在使用荧光 EDU 标记 24 小时后，仅有约 10% 的细胞显示出细胞分裂的证据，这一比率远低于转化细胞系中的水平。当在 X explan 建立的同时加入处理因素时，某些化合物会改变集体细胞迁移行为。例如，如图所示，某些 MMP 抑制剂在 24 小时后会减小细胞层面积。

在培养过程中，当将含有可溶性 RGD 肽的溶液加入培养基以破坏黏附形成时，细胞片前沿的片状伪足会迅速收缩，随后细胞片前沿发生脱离并回缩。在不到两分钟的时间内，即可评估细胞片内或前沿细胞与跟随细胞内蛋白质的定位情况，整个细胞片可如本图所示进行固定和染色。一旦掌握该技术，若操作得当，可在 10 到 15 分钟内完成。在进行该操作时，需注意：必须在细胞充分黏附于培养皿后，再加入预热的培养基，这是本操作步骤中的关键点。

还可以采用其他方法，如定量PCR（QPCR），以回答其他问题，例如基因表达随时间及（或）处理条件的变化情况。观看本实验操作后，您应能更清楚地了解如何建立表皮嵴外植体培养体系，并将其应用于多种实验操作中。