Name: 指南生成和使用hiPSC派生的NPC的神经系统疾病的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习从hiPSC分化神经祖细胞(NPC)用于神经系统疾病研究的方法。本方案采用双SMAD抑制剂诱导神经玫瑰花结形成，建立可扩增的NPC群体，并通过慢病毒转导进行基因操作，为研究神经发育和疾病机制提供可靠平台。

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Kristen Brennand 是纽约干细胞基金会-罗伯逊研究员。Brennand 实验室获得了脑与行为年轻研究员资助、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01 MH101454 以及纽约干细胞基金会的支持。

1. 人类诱导多能干细胞向神经前体细胞的分化
<ol>
	<li>在人胚胎干细胞（HES）培养基（表1）中培养和扩增hiPSCs，该细胞与小鼠胚胎成纤维细胞（mEF）饲养层共培养，直至形成较大但未融合的克隆，可用于通过拟胚体（EB）中间阶段进行神经分化（图2）。常规hiPSC培养条件已在其他文献中详细描述16,17；简而言之，将hiPSCs在mEF饲养层上用HES培养基培养至融合状态，然后使用胶原酶（1 mg/ml溶于DMEM）进行酶法传代，每7天约以1:3比例扩增一次。</li>
	<li>为制备多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板，使用无菌水配制10 μg/ml多聚-L-鸟氨酸（塑料表面）或50 μg/ml（玻璃表面）包被培养板，在室温下孵育3–24小时。至少用无菌水洗涤一次后，再用无菌PBS配制的5 μg/ml层粘连蛋白在室温下包被3–24小时。 
	注意：若用塑料膜包裹，培养板可在-20 ºC保存长达六个月。</li>
	<li>第1天，使用1 mg/ml IV型胶原酶溶于DMEM/F12中，将未融合的hiPSCs（通常在mEF上培养，或在Matrigel上使用TeSR18等无血清培养基培养的hiPSCs）以大克隆形式从培养板上酶法剥离。 
	注意：在37 ºC孵育1–2小时后，克隆将漂浮于培养皿中。</li>
	<li>轻柔地用DMEM/F12洗涤hiPSC克隆1–2次（通过自然沉降，而非离心），重悬于2 ml/孔N2/B27培养基（表1）中，并转移至非黏附性6孔板中（将3孔合并为1孔）19。 
	注意：过夜后，克隆将形成漂浮的球形细胞团，称为“拟胚体”（EBs）。可观察到明显的细胞死亡。</li>
	<li>第2天，倾斜培养板使EBs沉降，小心吸除培养基并用DMEM/F12洗涤一次以去除碎片，然后加入补充双SMAD抑制剂（0.1 μM LDN193189 和 10 μM SB431542）的N2/B27培养基进行换液12。</li>
	<li>第3–7天，在双SMAD抑制条件下发生神经化过程；检查EBs应呈圆形而非囊状。每隔一天使用补充0.1 μM LDN193189 和 10 μM SB431542的N2/B27培养基对EBs进行换液。</li>
	<li>第7–14天，将EBs接种至多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板后，使用明场显微镜检查，数天内应开始出现神经样菊形团结构（特征为具有顶-底极性的圆形神经上皮细胞簇；图1）。继续每隔一天使用补充0.1 μM LDN193189、10 μM SB431542 和 1 μg/ml 层粘连蛋白的N2/B27培养基对贴壁EBs进行换液。</li>
</ol>
2. 神经玫瑰花环的收获
注意：我们建议使用神经玫瑰花环选择试剂20或类似的筛选试剂通过酶法收获神经玫瑰花环。尽管可以将神经玫瑰花环手动挑选至6孔多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板中，但该方法需要经过 extensive 培训才能掌握，并且根据操作者的技能水平，可能需要在第20天进行第二轮挑选，以进一步富集神经前体细胞并去除非神经细胞类型。
<ol>
	<li>在第14天进行神经玫瑰花环的酶法筛选时，吸除贴壁胚状体（EBs）的培养基，每孔加入1 ml神经玫瑰花环筛选试剂（适用于6孔板）。在37 ºC下孵育1小时。</li>
	<li>使用P1000移液器，轻轻吸除每孔中的酶液。每孔加入1 ml DMEM/F12进行洗涤。</li>
	<li>用P1000吸取消除的1 ml DMEM/F12，迅速将其重新排入同一孔中，从而使玫瑰花环从培养板上脱落。将脱落的玫瑰花环收集至离心管中。</li>
	<li>再加入1 ml DMEM/F12，迅速排入同一孔中以分离残留的玫瑰花环。（不要吹打。尽量避免破坏玫瑰花环聚集体）。将神经玫瑰花环收集至同一离心管中。</li>
	<li>根据需要重复步骤2.4。若玫瑰花环不易脱落，可添加更多酶液并重复该过程（步骤2.1–2.4）。</li>
	<li>以300 × g离心3分钟。吸除洗涤液，将玫瑰花环重悬于2 ml NPC培养基中（表1）。将细胞按1:1比例转移至经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中。</li>
	<li>从第15天至第21天，神经玫瑰花环将逐渐扩增；每隔两天用NPC培养基更换培养液。</li>
	<li>评估神经玫瑰花环的质量，确保培养物中无扁平的成纤维细胞样细胞过度生长。 
	注意：若非玫瑰花环样细胞持续存在，有时可通过手动挑选法挽救NPC培养，仅挑选形态最佳的玫瑰花环转移至Accutase中。在37 ºC下消化15分钟。离心、洗涤后，将细胞接种于含NPC培养基的24孔多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被板中。</li>
</ol>
3. 神经前体细胞的扩增
注意：hiPSC NPCs 可在 Matrigel 或 Poly-L-Ornithine/Laminin 包被的培养板上培养。我们通常使用 Matrigel 包被的培养板，因为其制备更快速且成本较低。
<ol>
	<li>为制备Matrigel包被的培养板，将1 mg冻存的Matrigel在24 ml冷的DMEM/F12培养基中快速解冻并重悬，立即分装至两个六孔板的每个孔中，每孔2 ml。在37 ºC下孵育至少1小时。 
	注意：使用前仅需吸除Matrigel，无需洗涤。</li>
	<li>每两天更换一次NPC培养基，并保持细胞处于极高密度状态，否则它们会自发分化为神经元。 
	注意：尽管较为成熟的NPC通常每周以1:4比例传代，但低代次的NPC可每两周传代一次，传代比例为1:2。</li>
	<li>传代时，首先吸除培养基，向六孔板的每个孔中加入1 ml预热的Accutase（1X）。在37 ºC下孵育10–15分钟。</li>
	<li>将脱离的细胞轻柔转移至含有DMEM/F12培养基的15 ml离心管中，尽量减少机械应力。酶消化期间不要吹打细胞。以1,000 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，将NPC重悬于约每原六孔板孔1 ml的NPC培养基中。 
	注意：预计一个汇合的六孔板孔含有500万至1000万个细胞；可在重新接种前使用血细胞计数板对10 μl细胞悬液进行计数以确认细胞数量。</li>
	<li>重悬后，可将NPC重新接种为NPC、神经元或神经球。若需维持NPC状态，建议每六孔板孔接种约100万至200万个细胞。神经球形成的效率因实验和细胞系而异，通常在非黏附性六孔板中每孔接种20万至100万个细胞时效果最佳；若出现神经球聚集现象，应减少接种细胞数量。若需向神经元分化，建议每六孔板孔接种约20万个细胞，并将NPC培养基更换为神经元培养基。</li>
	<li>应对每一个建立的NPC细胞系进行免疫组织化学验证。在扩增获得足够细胞材料后，使用NESTIN和SOX2抗体对NPC进行标记。经验证的NPC细胞系还应进一步分化为神经元，持续4–6周，并使用βIII-TUBULIN和MAP2AB抗体进行标记。
	<ol>
		<li>用含4%多聚甲醛的PBS在4°C固定细胞10分钟。室温下用含1.0% Triton的PBS对NPC透化处理15分钟，随后在含5%驴血清和0.1% Triton的PBS中室温封闭30分钟。</li>
		<li>在含5%驴血清和0.1% Triton的溶液中加入一抗，4°C孵育过夜。 
		注意：我们推荐以下抗体：山羊抗Sox2抗体（1:200）、小鼠抗人Nestin抗体（1:200）、兔抗βIII-微管蛋白抗体（1:500）、小鼠抗βIII-微管蛋白抗体（1:500）、小鼠抗MAP2AB抗体（1:200）。（图2）。</li>
		<li>用PBS洗涤后，在含5%驴血清和0.1% Triton的溶液中加入相应种属的荧光标记二抗（1:300），室温孵育1–2小时。为显示细胞核，使用0.5 μg/ml DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色，然后用Vectashield封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. NPC 转导
<ol>
	<li>采用离心转导法（将含有病毒的细胞培养板在1,000 × g条件下离心1小时）以提高转染细胞的比例 21吸弃培养基，加入含有相应过表达（或对照）慢病毒（或逆转录病毒）的病毒液，按目标感染复数（MOI）（通常为1–10）进行滴定，并用NPC培养基稀释。每孔6孔板加入1.5 ml病毒液（其他规格的培养板按相应比例调整体积）。将培养板置于平板离心机中，在1,000 × g、37 °C条件下离心1小时。 
	注意：最佳情况下，应在神经前体细胞（NPCs）传代后1-2天内用慢病毒或逆转录病毒载体进行转导。无论使用商用病毒还是实验室制备的病毒，均可通过梯度稀释法预先对病毒批次进行适当滴定，以有助于后续实验。图3).</li>
	<li>为减少细胞死亡，应在离心感染后8小时内更换培养基。 
	注意：通过报告基因荧光可在24小时内检测到病毒整合与外源基因表达。（若病毒不含荧光报告基因，则较难评估；转染成功与否最好通过免疫印迹、免疫组织化学或针对过表达产物的qPCR进行验证。）完全表达可能需要3–7天；可能需要通过追加病毒进行多次旋转感染（spinfection）以提高转染细胞的比例。重复的旋转感染可每日进行，但不必过于频繁。理想情况下，若使用荧光报告基因， &#62;80%的细胞应被标记。</li>
</ol>
5. 神经球迁移实验
注意：神经球会自发形成，其形成方式与NPC扩增过程中使用的酶解分离NPC的方法相同（步骤3.3-3.6），只需将细胞在NPC培养基中进行悬浮培养即可。
<ol>
	<li>简而言之，将解离后的神经前体细胞（NPCs）置于非黏附培养板中，用NPC培养基培养48小时，以生成神经球。图4).</li>
	<li>对于神经球迁移实验，应在挑选神经球前1-2小时，使用冷的NPC培养基而非DMEM，在96孔板中新鲜制备Matrigel包被的培养板。切勿吸除各孔中的Matrigel。</li>
	<li>如最初发表的胚胎干细胞衍生神经球实验方案 22在显微镜下手动挑选NPC来源的神经球，先用NPC培养基洗涤一次以去除细胞碎片，然后将一个神经球转移至经Matrigel包被的96孔板的每个孔中。</li>
	<li>向每个96孔板中的神经球加入额外的0.5 mg Matrigel，用冷的NPC培养基稀释后使用。</li>
	<li>使用移液枪头手动将每个神经球居中放置于孔板的中央。 
	注意：为了减少结果的变异性，应选择大小相近的神经球。</li>
	<li>孵育48小时以允许细胞迁移，随后使用4%多聚甲醛固定细胞，并用所需的免疫组织化学标记物进行染色。</li>
	<li>若需测定放射状迁移，应使用 4x 显微镜物镜对神经球进行整体拍照。分析时应排除任何接触孔边缘或其他神经球的神经球。 
	注意：如果迁移持续时间超过48小时，所产生的径向迁移距离可能过大，无法使用4倍物镜进行成像。</li>
	<li>使用 NIH ImageJ 软件测量每个神经球的平均迁移距离图5）。这可以使用下述任一种分析方法完成：
	<ol>
		<li>径向迁移：
		<ol>
			<li>使用套索工具手动描记迁移最远的细胞边缘，然后使用测量功能（Ctrl+M）计算所得图形的面积。在测量面积之前，请确保 面积 在检查 设置测量参数 位于下方的窗口 分析 表。使用面积测量值及圆面积公式（A=πr2）以确定半径（外）。</li>
			<li>沿原始神经球边缘描记，测量面积并以相同方法计算半径（内径）。通过外径与内径之差计算总径向迁移距离。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞迁移能力最强：
		<ol>
			<li>使用直线选择工具，然后使用测量（Ctrl+M）功能，测量从内层神经球边缘起最远的五个细胞的移动距离。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. , (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已描述了将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为神经前体细胞（NPCs）的方法。NPC是一种神经细胞类型，其中保留了相当一部分hiPSC来源神经元的基因表达特征，并可作为可能参与疾病发病机制的发育通路的替代模型8,11。此外，正如我们所详述的，NPC具有强健的增殖能力且易于进行基因转导，我们认为其可能适用于疾病易感性的分子与生化研究。
尽管我们已有详细的方案用于分化和培养前脑模式化的神经前体细胞（NPCs），但这些方法可轻松调整以生成具有其他细胞命运模式的NPCs。例如，若先用0.5 mg/ml DKK1、10 mM SB431542、0.5 mg/ml Noggin和1 mM环杷明（cyclopamine）处理悬浮的胚胎体（EBs），则可生成海马体模式化的NPCs，这些细胞可在NPC培养基中扩增，并在补充20 ng/ml WNT3A的神经元分化培养基中进一步分化7。或者，通过以100 ng/ml SHH C25II、2 μM Purmorphamine、100 μg/ml FGF8和3 μM CHIR99021替代FGF2，可将NP...

神经元分化后的基因表达研究 体外 由我们从人诱导性多能干细胞（hiPSCs）获得 1 及其他人 2,3 表明hiPSC神经元更类似于胎儿而非成年脑组织。目前，基于hiPSC的模型可能更适合研究神经系统疾病的易感性，而非其晚期特征。我们此前曾报道，精神分裂症患者来源的hiPSC神经元中，有显著比例的基因表达特征在精神分裂症患者来源的hiPSC衍生神经元中是保守的&#160;神经前体细胞（NPCs），表明NPCs可能是研究导致精神分裂症的分子通路的一个有用细胞类型 1我们及其他研究者已报道，在精神分裂症的hiPSC来源的神经前体细胞（NPCs）中存在异常迁移、氧化应激与活性氧物质增加、对亚阈值环境应激的敏感性升高以及线粒体功能受损。 1,4-6以及精神分裂症hiPSC神经元中神经元连接性和突触功能的降低 5,7-10如果导致精神分裂症患者hiPSC来源的神经前体细胞（NPCs）异常迁移和/或氧化应激的分子因素，同样也是精神分裂症hiPSC来源神经元中神经连接减少的基础，那么NPCs可能是一种稳健且具有高度增殖能力的神经细胞群体，可用于研究疾病发生机制。此外，由于能够快速获得大量细胞，且无需等待数周或数月的神经元成熟过程，基于NPC的检测方法适用于更大规模的患者队列研究，并更易于进行高通量筛选。我们认为，hiPSC来源的NPCs可作为研究潜在致病发育通路的替代模型，这一点已在包括精神分裂症在内的多种不同疾病中得到初步验证。 1 和亨廷顿病 11.
为了将神经前体细胞（NPCs）从人诱导多能干细胞（hiPSCs）中分化出来，首先通过双SMAD抑制法进行神经诱导（使用0.1μM LDN193189和10μM SB431542）12。利用这些小分子拮抗BMP和TGFβ信号通路，可阻断内胚层和中胚层的特化，从而加速神经元分化，并在接种后一周内形成可见的神经玫瑰花环结构。神经模式化在此过程中早期即开始发生，可能发生在神经玫瑰花环形成期间及形成后不久。在缺乏其他信号诱导的情况下，这些原始神经细胞会默认向类似前脑前部的命运发展13。在神经玫瑰花环形成后立即开始，并持续贯穿NPC扩增过程，前脑NPCs需在FGF2存在条件下培养8,14。这些细胞具有双向分化潜能，可分化为70–80%的βIII-TUBULIN阳性神经元和20–30%的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞（图1）。大多数前脑hiPSC来源的神经元表达VGLUT1，因此推测为谷氨酸能神经元，尽管约有30%的神经元为GAD67阳性（GABA能）8。
NPCs 通常传代超过十次 体外 同时保持稳定的分化特征，且不积累核型异常。已有研究报道将神经前体细胞连续传代超过40次 15然而，我们发现经过十代以上的传代培养后，神经前体细胞（NPCs）向星形胶质细胞分化的倾向增加。NPCs对多次冻融具有良好的耐受性，且只需在非黏附培养板中培养即可轻松转换为神经球形式生长。NPCs可被病毒载体高效转导，从而快速评估基因扰动所带来的分子与细胞水平变化，并易于扩增以获得足够的材料用于生化研究。此外，由于病毒载体可在对照或患者来源的神经细胞中实现疾病相关基因的稳定过表达和/或敲低，因此可利用该平台研究遗传背景对这些操作的影响。尽管NPCs不适用于需要成熟神经元的突触或基于活性的检测，但对于许多针对患者来源神经细胞的简单分子或生化分析而言，NPCs可能是一种实用的替代方案。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>用于HES培养基</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>用于神经培养基</td></tr><tr><td>KO-血清替代物</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>需进行批次测试</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#17502-048</td><td>需进行批次测试</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#12587-010</td><td>需进行批次测试</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>用PBS + 1% BSA重悬</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>用PBS + 0.1% BSA重悬</td></tr><tr><td>GDNF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;#450-10</td><td>用PBS + 0.1% BSA重悬</td></tr><tr><td>二丁酰环磷酸腺苷</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;#D0627</td><td>用PBS + 0.1% BSA重悬</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>用H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O溶解</td></tr><tr><td>STEMdiff神经类球选择试剂</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&amp;nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>天然小鼠层粘连蛋白，1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>在冰上用冷DMEM以10 mg/ml浓度重悬，每两个6孔板等效面积使用1 mg</td></tr><tr><td>组织培养处理的6孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附6孔板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗Sox2&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc&amp;shy;17320</td><td>使用稀释比为1:200</td></tr><tr><td>小鼠抗人Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>使用稀释比为1:200</td></tr><tr><td>兔抗&amp;beta;III-微管蛋白</td><td>Covance</td><td>PRB&amp;shy;435P</td><td>使用稀释比为1:500</td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;beta;III-微管蛋白</td><td>Covance</td><td>MMS&amp;shy;435P</td><td>使用稀释比为1:500</td></tr><tr><td>小鼠抗MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>使用稀释比为1:200</td></tr><tr><td>板式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter Allegra X-14（配备SX4750板架）</td><td></td></tr></tbody></table>

生成和使用人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞用于神经系统疾病研究的指南

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

神经疾病的尸检研究并不适合确定疾病发生的根本原因，因为许多疾病在症状出现之前已有很长的疾病进展期。由于患者的成纤维细胞和健康对照者的成纤维细胞均可高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSCs），并进一步分化为神经前体细胞（NPCs）和神经元以用于这些疾病的研究，因此现在有可能重现患者在症状出现之前所发生的发育事件。本文介绍一种高效将hiPSCs分化为NPCs的方法，这些NPCs不仅能够进一步分化为功能性神经元，还可稳定传代、经受冻融处理或转换为神经球形式培养，从而实现快速遗传筛选，以鉴定影响细胞表型（包括增殖、迁移、氧化应激和/或凋亡）的分子因子。由患者来源的hiPSC分化而来的NPCs是一种独特的研究平台，特别适用于对基因表达调控所导致的细胞或分子效应进行实证检验。

神经玫瑰花环可通过明场显微镜根据其典型的形态学特征进行识别，表现为具有顶-基极性的神经上皮细胞组成的圆形簇状结构（图1）。尽管神经前体细胞（NPCs）通常在极高细胞密度下培养，但在传代后立即观察，可见略呈金字塔形的胞体以及双极神经突结构（图1D）。经验证的NPCs在大多数细胞中表达NESTIN和SOX2，同时在所有NPC群体中也可观察到βIII-TUBULIN染色，表明部分NPC在培养过程中持续启动神经元分化（图1F）。NPCs表达神经干细胞标志物（如SOX2和PAX6）以及前脑神经前体细胞标志物（如TBR2），而不表达中脑标志物（如LMX1A和FOXA2）（图1G-I）。若NPC群体中存在大量扁平的成纤维细胞样细胞，则提示获得了质量较差的NPCs，这些细胞在后续神经元分化过程中难以产生大量神经元（图2）。
在使用高滴度的慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后，应有超过80%的细胞被载体中包含的荧光报告基因标记（<str...

本方案描述了如何将人诱导性多能干细胞分化为神经前体细胞，以获得稳定且具有增殖能力的神经细胞群体，可用于鉴定多种神经系统疾病发病机制中涉及的发育通路。

神经系统疾病的尸检研究在确定疾病起始的根本原因方面并不理想，因为许多疾病包含漫长的……

本实验的总体目标是利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成神经前体细胞（NPCs），以此作为研究神经系统疾病相关细胞与分子机制的平台。该目标通过以下步骤实现：首先，使用双SMAD抑制剂将hiPSCs诱导分化为神经玫瑰花环结构；第二步，收获这些神经玫瑰花环结构，并使其发育为可扩增的NPC群体。接下来使用离心感染法进行慢病毒转导。该步骤可提高转导效率，用于调控基因表达。最后一步是将神经前体细胞在悬浮培养中生长，使其自发形成神经球。最终，该平台可用于检测多种细胞表型。例如，测量基因操作对神经元迁移的影响。尽管该方法可为细胞迁移等机制提供见解。该方法也可用于研究其他生物学过程，如复制、氧化应激、细胞凋亡和神经突生长。人诱导性多能干细胞或高能多能干细胞的分化可形成可见的神经玫瑰花结，其特征为具有顶端-基底极性的神经上皮细胞组成的圆形簇状结构，可用于在第14天对神经玫瑰花结进行酶法筛选。吸去贴壁胚状体或EBs中的培养基，每六孔板孔中加入1毫升神经玫瑰花结筛选试剂，在37°C下孵育1小时。一小时后，使用P-1000移液器小心地从每个孔中移除酶溶液，并向每孔加入1毫升D-M-E-M-F12培养基。为洗涤集落，收集每孔中的1毫升D-M-E-M-F12培养基，迅速将其重新排回孔内，从而使集落从培养板上脱落。将类胚体收集至一个离心管中。再用移液器吸取1毫升D-M-E-M-F12培养基，迅速吹打至同一孔中，以解离残留的类胚体。注意不要吹打过猛，尽量避免破坏类胚体聚集体。将神经类胚体收集至同一个离心管中。如果收集完所有神经玫瑰花环后，其仍不易脱落，可添加更多的酶，并重复此步骤。将 Falcon 管在 300 G 条件下离心 3 分钟。吸除上清液，重悬细胞。将类胚体悬浮于2毫升神经前体细胞培养基中。将细胞转移至经多聚-L-鸟氨酸包被的6孔板中，在37°C条件下培养一周。本实验室中，神经前体细胞（NPCs）在Matrigel包被的培养板上生长，每两天换液一次，并维持在极高的密度下培养。为了分离神经前体细胞（NPCs），首先吸除培养基，然后每六孔板孔中加入一毫升预热的Accutase，于37摄氏度孵育10至15分钟。轻柔地将脱落的细胞转移至含有D-M-E-M-F12培养基的15毫升离心管中，尽量减少机械应力。酶消化期间不要吹打细胞。通过在1000 × g离心5分钟使细胞沉淀。离心后，吸除上清液，并重悬NPCs。在六孔板的每个原始孔中，加入约 1 毫升 NPC 培养基，经重悬和细胞计数后，每个汇合度良好的孔预计可获得 500 万至 1000 万个细胞。为维持神经前体细胞（NPCs），可将细胞以每孔约 100 万至 200 万个的密度接种至六孔板中。神经球的形成效率因实验条件和细胞系而异，但通常在每孔非黏附性六孔板中接种 20 万至 100 万个细胞时效果最佳；若出现细胞团聚，应减少接种细胞数量，理想情况下应在传代后 1 至 2 天内完成接种。应使用慢病毒或逆转录病毒载体转导NP NPCs，以提高转染细胞的比例。采用旋转感染法。吸出每孔中的培养基，并替换为相应过表达或对照用的慢病毒或逆转录病毒，按目标感染复数稀释后加入。在NPC培养基中，每六孔板每孔使用1.5毫升，于室温下在板式离心机中以1000 ×g离心1小时。离心后，将培养板放回培养箱中，以减少细胞死亡。离心感染后8小时内更换培养基。开始此操作时，先用神经前体细胞培养基清洗神经球一次，以去除细胞碎片。将培养板倾斜至45度角，使神经球沉降，然后尽可能多地吸除培养基，注意不要吸走神经球。随后加入新鲜培养基。接下来，在显微镜下使用 P200 移液器手动挑选由 NPC 衍生的神经球，将一个神经球转移至经基质胶包被的 96 孔板的每个孔中。为减少实验结果的变异性，应挑选大小相近的神经球。向每个 96 孔板中的神经球加入额外的 0.5 毫克基质胶，该基质胶需用冷的 NPC 培养基稀释。使用移液器吸头手动将每个神经球居中放置于孔板的中央位置。让神经球迁移持续进行48小时。使用所需的免疫组织化学标记物对细胞进行固定和染色后，利用显微镜的4倍物镜完整拍摄神经球的整体图像。为测量放射状迁移距离，使用ImageJ软件进行分析。使用套索工具手动描记最远迁移细胞边缘。确保在“分析”选项卡下的“设置测量”窗口中已勾选“面积”选项。然后使用测量功能计算所得图形的面积。利用面积测量值及圆的面积公式，以相同方法确定外半径，方法是描出原始神经球的边缘。测量面积并计算内半径。通过外半径与内半径之差计算总径向迁移距离。这些图像展示了高多能性干细胞（high PSC）神经分化的各个阶段，从高多能性干细胞到胚胎体、神经样集落、神经前体细胞（NPCs），以及经验证的神经元。大多数细胞表达NPC标志物Nestin和神经干细胞转录因子SOX2。在所有NPC群体中均可观察到β3微管蛋白染色。NPCs还表达神经干细胞转录因子PAX6以及前脑前体细胞标志物。TBR2，但不表达中脑标记物如LMX1A和FOXA2。NPCs可分化为70%至80%的β3微管蛋白阳性神经元（绿色显示）以及20%至30%的胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞（红色显示）。高质量的NPCs中，大多数细胞表达Nestin和SOX2；而低质量的NPCs则出现SOX2阴性和Nestin阴性细胞的斑块。由高质量NPCs分化的4周龄神经元表达MAP2AB和β3微管蛋白。在使用高滴度的慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后，超过80%的细胞被荧光报告基因标记。该载体包含的神经球生成元件可产生大小相对均一的神经球群体，这些神经球在培养中可保持健康状态约一周时间。通过定期换液，健康的神经球可表现出显著的神经球迁移现象，如这些明场图像所示，分别为在Matrigel中培养48小时前后的情况。该技术为精神分裂症领域的研究人员探索由人诱导性多能干细胞衍生的神经前体细胞中的神经迁移提供了途径。请注意，使用逆转录病毒可能存在潜在危险，当可能存在病毒时，所有组织培养操作均应在生物安全二级以上条件下进行。

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