指南生成和使用hiPSC派生的NPC的神经系统疾病的研究

该程序的总体目标是从人诱导的多能干细胞或高 PSC 中产生神经祖细胞或 NPC，作为研究导致神经系统疾病的细胞和分子机制的平台。这是通过首先使用双重 smad 抑制剂将高 PSC 分化为神经玫瑰花结来实现的。第二步是收获这些神经莲座丛，让它们生长成可扩增的 N PC 种群。

接下来是慢病毒转导伴旋转感染。提高效率的步骤用于纵基因表达。最后一步是让 NPC 悬浮生长，使它们自发形成神经球。

最终，该平台可用于检测各种细胞表型。例如，测量基因作对神经迁移的影响。尽管这种方法可以提供对细胞机制（例如迁移）的见解。

它还可用于研究其他生物过程，如复制、氧化应激、细胞凋亡和神经突生长。人诱导的多能干细胞或高 PSC 的分化导致可见神经玫瑰花结的形成，其特征是具有 aico 基底极性的圆形神经上皮细胞簇，用于第 14 天神经玫瑰花结的酶促选择。从粘附的胚胎体或 ebs 中吸出培养基，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时的六孔板的每孔中加入 1 毫升神经罗塞特选择试剂。

一小时后。使用 P 1000 移液器手动从每个孔中轻轻去除酶，并在每个孔中加入 1 毫升 D-M-E-M-F 12。要清洗玫瑰花结，请收集 1 毫升 D-M-E-M-F 12 并迅速将其排回孔中，从而将玫瑰花结从板上分离。

将玫瑰花结收集到猎鹰管中吸取另一毫升 D-M-E-M-F 12 并迅速将其排入同一孔中以分离剩余的玫瑰花结。不要 tri 并尽量不要打碎莲座聚集体。将神经玫瑰花结收集到同一个猎鹰管中。

可以添加更多的酶，如果在收集所有神经玫瑰花结后玫瑰花结不容易分离，则重复此过程。将 Falcon 管以 300 G 离心 3 分钟。抽吸清洗液并复苏。

玫瑰花结悬浮在 2 毫升神经祖细胞培养基中。将细胞转移到涂有 poly L 鸟氨酸层压板的六壁板中，并在 37 摄氏度下生长一周。在这个实验室中，神经祖细胞或 NPC 在基质胶板上生长，每隔一天喂食并保持非常高的密度。

要分离 NPC，首先吸出培养基，然后在 37 摄氏度下孵育 10 至 15 分钟的六孔板的每孔中加入 1 毫升温热的 accutane。将分离的细胞轻轻转移到含有 D-M-E-M-F 12 的 15 毫升试管中，并尽可能减少机械应力。在酶中，不要对细胞进行 T 研磨，离心后以 1000 G 旋转 5 分钟使细胞沉淀，吸出上清液并重悬 NPC。

在 6 孔板的每个原始孔中约 1 毫升 NPC 培养基中，在重悬和细胞计数后，预计 6 孔板的每个汇合孔会有 5 到 1000 万个细胞。将 NPC 板的每孔板接种大约 1 到 200 万个细胞，以维持 NPC。神经球形成的效率因实验和细胞系而异，但通常最好地发生在六壁非粘附板的每孔中 200， 000 到 100 万个细胞之间，如果发生聚集，减少细胞数量 理想情况下在分裂后一到两天内。

NP NPC 应使用慢病毒或逆转录病毒载体转导，以增加转染细胞的百分比。使用旋转感染。从每个孔中吸出培养基，并替换为相关的过表达或对照慢病毒或逆转录病毒，这些慢病毒或逆转录病毒的滴度达到所需的感染倍数稀释。

在 NPC 培养基中：使用每孔 1.5 毫升的六孔板，在 1000 G 和室温下离心，在板式离心机中离心 1 小时。离心后，将板放回培养箱中以减少细胞死亡。在 spin 感染后 8 小时内更换培养基。

通过在 NPC 培养基中洗涤 NPC 衍生的 NEUROSPHERES 一次以去除细胞碎片来开始此过程。将板倾斜 45 度角，让神经球沉降，然后在不吸出神经球的情况下去除尽可能多的培养基。更换为新介质。

接下来，使用 P 200 移液器在显微镜下手动挑选 NPC 衍生的神经球，将一个神经球转移到基质胶涂层的 96 孔板的每个孔中。选择大小相似的神经球以减少结果的可变性非常重要。向每个 96 孔板中的神经球中额外添加 0.5 毫克在冷 NPC 培养基中稀释的 matri 凝胶。

使用移液器吸头手动将每个单独的神经球置于孔的中间，允许神经球迁移发生 48 小时。用所需的免疫组织化学标志物固定和染色细胞后，使用 Forex 显微镜物镜完整拍摄神经球。要测量径向偏移，请使用 Image J 软件。

使用手绘选择工具手动描摹最远迁移单元的边缘。确保在 analyze （分析） 选项卡下的 set measurements （设置测量） 窗口中选中该区域。然后使用 measure 函数计算结果形状的面积。

使用面积测量值和圆面积方程式以相同的方式确定外半径，跟踪原始神经球的边缘。测量面积并计算内半径。将总径向偏移量计算为外半径和内半径之间的差值。

这些图像显示了高 PSC 神经分化阶段，从高 PSC 到胚胎体、神经玫瑰花结、NPC 和神经元验证的 NPC 表达、NPC 标志物嵌套和神经干细胞转录因子 SOX 2 在大多数细胞中。β 三微管蛋白染色在所有 NPC 人群中也可见。NPC 还表达神经干细胞转录因子 PAC 6 和 4 脑蛋白祖细胞标志物。

TBR 2 而不是中脑标志物，如 LMX 1 A 和 FOX A 2 NPC 可以分化为 70% 至 80% β 3 微管蛋白阳性神经元（绿色）和 20% 至 30% 神经胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞（红色）、高质量高 PSC。NPC 在大多数单元格中表达 neston 和 SOX 2，而低质量的 NPC 有 SOX 2 阴性补丁，并且仅在阴性单元格中嵌套。与高质量 NPC 不同，4 周龄的神经元快速映射 2 AB 和 beta 3 湍流。

使用高滴度慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后。超过 80% 的细胞被荧光报告基因标记。包含在载体神经球生成中产生了相对均匀大小的神经球种群，这些神经球可以在培养物中保持健康约一周。

通过定期进食，神经球迁移在健康的神经球中强烈发生，如这些明场图像所示，在基质胶迁移 48 小时之前和之后，在其发育后。这项技术为精神分裂症领域的研究人员探索人类诱导的 PL 源干细胞衍生的 NPC 的神经迁移铺平了道路。不要忘记，使用逆转录病毒可能存在潜在危险，当可能存在病毒时，所有组织培养工作都应在 BL 二加条件下进行。