生成和使用人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞用于神经系统疾病研究的指南

本实验的总体目标是利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成神经前体细胞（NPCs），以此作为研究神经系统疾病相关细胞与分子机制的平台。该目标通过以下步骤实现：首先，使用双SMAD抑制剂将hiPSCs诱导分化为神经玫瑰花环结构；第二步，收获这些神经玫瑰花环结构，并使其发育为可扩增的NPC群体。

接下来使用离心感染法进行慢病毒转导。该步骤可提高转导效率，用于调控基因表达。最后一步是将神经前体细胞在悬浮培养中生长，使其自发形成神经球。

最终，该平台可用于检测多种细胞表型。例如，测量基因操作对神经元迁移的影响。尽管该方法可为细胞迁移等机制提供见解。

该方法也可用于研究其他生物学过程，如复制、氧化应激、细胞凋亡和神经突生长。人诱导性多能干细胞或高能多能干细胞的分化可形成可见的神经玫瑰花结，其特征为具有顶端-基底极性的神经上皮细胞组成的圆形簇状结构，可用于在第14天对神经玫瑰花结进行酶法筛选。吸去贴壁胚状体或EBs中的培养基，每六孔板孔中加入1毫升神经玫瑰花结筛选试剂，在37°C下孵育1小时。

一小时后，使用P-1000移液器小心地从每个孔中移除酶溶液，并向每孔加入1毫升D-M-E-M-F12培养基。为洗涤集落，收集每孔中的1毫升D-M-E-M-F12培养基，迅速将其重新排回孔内，从而使集落从培养板上脱落。

将类胚体收集至一个离心管中。再用移液器吸取1毫升D-M-E-M-F12培养基，迅速吹打至同一孔中，以解离残留的类胚体。注意不要吹打过猛，尽量避免破坏类胚体聚集体。将神经类胚体收集至同一个离心管中。

如果收集完所有神经玫瑰花环后，其仍不易脱落，可添加更多的酶，并重复此步骤。将 Falcon 管在 300 G 条件下离心 3 分钟。吸除上清液，重悬细胞。

将类胚体悬浮于2毫升神经前体细胞培养基中。将细胞转移至经多聚-L-鸟氨酸包被的6孔板中，在37°C条件下培养一周。本实验室中，神经前体细胞（NPCs）在Matrigel包被的培养板上生长，每两天换液一次，并维持在极高的密度下培养。

为了分离神经前体细胞（NPCs），首先吸除培养基，然后每六孔板孔中加入一毫升预热的Accutase，于37摄氏度孵育10至15分钟。轻柔地将脱落的细胞转移至含有D-M-E-M-F12培养基的15毫升离心管中，尽量减少机械应力。酶消化期间不要吹打细胞。通过在1000 × g离心5分钟使细胞沉淀。离心后，吸除上清液，并重悬NPCs。

在六孔板的每个原始孔中，加入约 1 毫升 NPC 培养基，经重悬和细胞计数后，每个汇合度良好的孔预计可获得 500 万至 1000 万个细胞。为维持神经前体细胞（NPCs），可将细胞以每孔约 100 万至 200 万个的密度接种至六孔板中。神经球的形成效率因实验条件和细胞系而异，但通常在每孔非黏附性六孔板中接种 20 万至 100 万个细胞时效果最佳；若出现细胞团聚，应减少接种细胞数量，理想情况下应在传代后 1 至 2 天内完成接种。

应使用慢病毒或逆转录病毒载体转导NP NPCs，以提高转染细胞的比例。采用旋转感染法。吸出每孔中的培养基，并替换为相应过表达或对照用的慢病毒或逆转录病毒，按目标感染复数稀释后加入。

在NPC培养基中，每六孔板每孔使用1.5毫升，于室温下在板式离心机中以1000 ×g离心1小时。离心后，将培养板放回培养箱中，以减少细胞死亡。离心感染后8小时内更换培养基。

开始此操作时，先用神经前体细胞培养基清洗神经球一次，以去除细胞碎片。将培养板倾斜至45度角，使神经球沉降，然后尽可能多地吸除培养基，注意不要吸走神经球。随后加入新鲜培养基。

接下来，在显微镜下使用 P200 移液器手动挑选由 NPC 衍生的神经球，将一个神经球转移至经基质胶包被的 96 孔板的每个孔中。为减少实验结果的变异性，应挑选大小相近的神经球。向每个 96 孔板中的神经球加入额外的 0.5 毫克基质胶，该基质胶需用冷的 NPC 培养基稀释。

使用移液器吸头手动将每个神经球居中放置于孔板的中央位置。让神经球迁移持续进行48小时。使用所需的免疫组织化学标记物对细胞进行固定和染色后，利用显微镜的4倍物镜完整拍摄神经球的整体图像。为测量放射状迁移距离，使用ImageJ软件进行分析。

使用套索工具手动描记最远迁移细胞边缘。确保在“分析”选项卡下的“设置测量”窗口中已勾选“面积”选项。然后使用测量功能计算所得图形的面积。

利用面积测量值及圆的面积公式，以相同方法确定外半径，方法是描出原始神经球的边缘。测量面积并计算内半径。通过外半径与内半径之差计算总径向迁移距离。

这些图像展示了高多能性干细胞（high PSC）神经分化的各个阶段，从高多能性干细胞到胚胎体、神经样集落、神经前体细胞（NPCs），以及经验证的神经元。大多数细胞表达NPC标志物Nestin和神经干细胞转录因子SOX2。在所有NPC群体中均可观察到β3微管蛋白染色。NPCs还表达神经干细胞转录因子PAX6以及前脑前体细胞标志物。

TBR2，但不表达中脑标记物如LMX1A和FOXA2。NPCs可分化为70%至80%的β3微管蛋白阳性神经元（绿色显示）以及20%至30%的胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞（红色显示）。高质量的NPCs中，大多数细胞表达Nestin和SOX2；而低质量的NPCs则出现SOX2阴性和Nestin阴性细胞的斑块。由高质量NPCs分化的4周龄神经元表达MAP2AB和β3微管蛋白。

在使用高滴度的慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后，超过80%的细胞被荧光报告基因标记。该载体包含的神经球生成元件可产生大小相对均一的神经球群体，这些神经球在培养中可保持健康状态约一周时间。

通过定期换液，健康的神经球可表现出显著的神经球迁移现象，如这些明场图像所示，分别为在Matrigel中培养48小时前后的情况。该技术为精神分裂症领域的研究人员探索由人诱导性多能干细胞衍生的神经前体细胞中的神经迁移提供了途径。请注意，使用逆转录病毒可能存在潜在危险，当可能存在病毒时，所有组织培养操作均应在生物安全二级以上条件下进行。