指南生成和使用hiPSC派生的NPC的神经系统疾病的研究
2015年2月21日
该协议描述了神经祖细胞如何从人类诱导的多能干细胞中分化出来，以产生一个强大的和可复制的神经细胞群，这可用于识别导致许多神经系统疾病发病机制的发育途径。
该程序的总体目标是从人诱导的多能干细胞或高 PSC 中产生神经祖细胞或 NPC，作为研究导致神经系统疾病的细胞和分子机制的平台。这是通过首先使用双重 smad 抑制剂将高 PSC 分化为神经玫瑰花结来实现的。第二步是收获这些神经莲座丛，让它们生长成可扩增的 N PC 种群。
接下来是慢病毒转导伴旋转感染。提高效率的步骤用于纵基因表达。最后一步是让 NPC 悬浮生长，使它们自发形成神经球。
最终，该平台可用于检测各种细胞表型。例如，测量基因作对神经迁移的影响。尽管这种方法可以提供对细胞机制（例如迁移）的见解。
它还可用于研究其他生物过程，如复制、氧化应激、细胞凋亡和神经突生长。人诱导的多能干细胞或高 PSC 的分化导致可见神经玫瑰花结的形成，其特征是具有 aico 基底极性的圆形神经上皮细胞簇，用于第 14 天神经玫瑰花结的酶促选择。从粘附的胚胎体或 ebs 中吸出培养基，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时的六孔板的每孔中加入 1 毫升神经罗塞特选择试剂。
一小时后。使用 P 1000 移液器手动从每个孔中轻轻去除酶，并在每个孔中加入 1 毫升 D-M-E-M-F 12。要清洗玫瑰花结，请收集 1 毫升 D-M-E-M-F 12 并迅速将其排回孔中，从而将玫瑰花结从板上分离。
将玫瑰花结收集到猎鹰管中吸取另一毫升 D-M-E-M-F 12 并迅速将其排入同一孔中以分离剩余的玫瑰花结。不要 tri 并尽量不要打碎莲座聚集体。将神经玫瑰花结收集到同一个猎鹰管中。
可以添加更多的酶，如果在收集所有神经玫瑰花结后玫瑰花结不容易分离，则重复此过程。将 Falcon 管以 300 G 离心 3 分钟。抽吸清洗液并复苏。
将玫瑰花结悬浮在 2 毫升神经祖细胞培养基中。将细胞转移到涂有 poly L 鸟氨酸层压板的六壁板中，并在 37 摄氏度下生长一周。在这个实验室中，神经祖细胞或 NPC 在基质胶板上生长，每隔一天喂食并保持非常高的密度。
要分离 NPC，首先吸出培养基，然后在 37 摄氏度下孵育 10 至 15 分钟的六孔板的每孔中加入 1 毫升温热的 accutane。将分离的细胞轻轻转移到含有 D-M-E-M-F 12 的 15 毫升试管中，并尽可能减少机械应力。在酶中，不要对细胞进行 T 研磨，离心后以 1000 G 旋转 5 分钟使细胞沉淀，吸出上清液并重悬 NPC。
在 6 孔板的每个原始孔中约 1 毫升 NPC 培养基中，在重悬和细胞计数后，预计 6 孔板的每个汇合孔会有 5 到 1000 万个细胞。将 NPC 板的每孔板接种大约 1 到 200 万个细胞，以维持 NPC。神经球形成的效率因实验和细胞系而异，但通常最好地发生在六壁非粘附板的每孔中 200， 000 到 100 万个细胞之间，如果发生聚集，减少细胞数量 理想情况下在分裂后一到两天内。
NP NPC 应使用慢病毒或逆转录病毒载体转导，以增加转染细胞的百分比。使用旋转感染。从每个孔中吸出培养基，并替换为相关的过表达或对照慢病毒或逆转录病毒，这些慢病毒或逆转录病毒的滴度达到所需的感染倍数稀释。
在 NPC 培养基中：使用每孔 1.5 毫升的六孔板，在 1000 G 和室温下离心，在板式离心机中离心 1 小时。离心后，将板放回培养箱中以减少细胞死亡。在 spin 感染后 8 小时内更换培养基。
通过在 NPC 培养基中洗涤 NPC 衍生的 NEUROSPHERES 一次以去除细胞碎片来开始此过程。将板倾斜 45 度角，让神经球沉降，然后在不吸出神经球的情况下去除尽可能多的培养基。更换为新介质。
接下来，使用 P 200 移液器在显微镜下手动挑选 NPC 衍生的神经球，将一个神经球转移到基质胶涂层的 96 孔板的每个孔中。选择大小相似的神经球以减少结果的可变性非常重要。向每个 96 孔板中的神经球中额外添加 0.5 毫克在冷 NPC 培养基中稀释的 matri 凝胶。
使用移液器吸头手动将每个单独的神经球置于孔的中间，允许神经球迁移发生 48 小时。用所需的免疫组织化学标志物固定和染色细胞后，使用 Forex 显微镜物镜完整拍摄神经球。要测量径向偏移，请使用 Image J 软件。
使用手绘选择工具手动描摹最远迁移单元的边缘。确保在 analyze （分析） 选项卡下的 set measurements （设置测量） 窗口中选中该区域。然后使用 measure 函数计算结果形状的面积。
使用面积测量值和圆面积方程式以相同的方式确定外半径，跟踪原始神经球的边缘。测量面积并计算内半径。将总径向偏移量计算为外半径和内半径之间的差值。
这些图像显示了高 PSC 神经分化阶段，从高 PSC 到胚胎体、神经玫瑰花结、NPC 和神经元验证的 NPC 表达、NPC 标志物嵌套和神经干细胞转录因子 SOX 2 在大多数细胞中。β 三微管蛋白染色在所有 NPC 人群中也可见。NPC 还表达神经干细胞转录因子 PAC 6 和 4 脑蛋白祖细胞标志物。
TBR 2 而不是中脑标志物，如 LMX 1 A 和 FOX A 2 NPC 可以分化为 70% 至 80% β 3 微管蛋白阳性神经元（绿色）和 20% 至 30% 神经胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞（红色）、高质量高 PSC。NPC 在大多数单元格中表达 neston 和 SOX 2，而低质量的 NPC 有 SOX 2 阴性补丁，并且仅在阴性单元格中嵌套。与高质量 NPC 不同，4 周龄的神经元快速映射 2 AB 和 beta 3 湍流。
使用高滴度慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后。超过 80% 的细胞被荧光报告基因标记。包含在载体神经球生成中产生了相对均匀大小的神经球种群，这些神经球可以在培养物中保持健康约一周。
通过定期进食，神经球迁移在健康的神经球中强烈发生，如这些明场图像所示，在基质胶迁移 48 小时之前和之后，在其发育后。这项技术为精神分裂症领域的研究人员探索人类诱导的 PL 源干细胞衍生的 NPC 的神经迁移铺平了道路。不要忘记，使用逆转录病毒可能存在潜在危险，当可能存在病毒时，所有组织培养工作都应在 BL 二加条件下进行。
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概述
本协议描述了从人类诱导多能干细胞（hiPSCs）分化神经祖细胞（NPCs）用于研究神经系统疾病。该过程涉及生成可以扩展和操作用于研究目的的NPCs。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 神经系统疾病
背景
- 人类诱导多能干细胞（hiPSCs）可以分化为各种细胞类型。
- 神经祖细胞（NPCs）对于研究大脑发育和疾病至关重要。
- 了解NPC分化途径可以提供神经系统疾病的洞察。
- 本协议旨在创建可靠的NPCs研究来源。
研究目的
- 从hiPSCs中生成NPCs用于研究神经系统疾病。
- 探索与疾病发病机制相关的细胞和分子机制。
- 为未来神经发育障碍研究提供平台。
使用的方法
- 使用双重SMAD抑制剂将hiPSCs分化为神经胚芽。
- 收集神经胚芽以生长可扩展的NPCs群体。
- 使用旋转感染进行慢病毒转导以操纵基因表达。
- 在悬浮培养中生长NPCs以形成神经球。
主要结果
- 成功从hiPSCs中分化出NPCs。
- 建立了可扩展的NPCs研究群体。
- 证明了慢病毒转导的有效性。
- NPCs在悬浮培养中形成神经球。
结论
- 本协议提供了从hiPSCs生成NPCs的可靠方法。
- NPCs可以用于研究神经系统疾病的机制。
- 该方法可以促进进一步研究治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model early neurodevelopmental events in human cells, providing a scalable platform to interrogate disease mechanisms prior to symptom onset. By generating expandable, genetically tractable NPCs from patient-derived hiPSCs, teams can de-risk target hypotheses through empirical testing of gene manipulation effects on cellular phenotypes such as migration, replication, oxidative stress, and apoptosis. This supports predictive confidence in target validation and informs go/no-go decisions in preclinical neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing molecular consequences of gene expression changes in a human-derived neural system.
- Operational Value: Provides a renewable NPC source for consistent phenotypic screening across genetic perturbations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic manipulation to quantifiable cellular outcomes relevant to neurological disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates neurosphere-forming NPC populations suitable for high-content migration and stress-response assays.
- Operational Value: Enables standardized, scalable neurosphere production for reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces expandable NPCs that can be cryopreserved, passaged, and transitioned to suspension culture for longitudinal phenotypic monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by modeling human neurodevelopmental processes in a dish.
- Disease-Relevant System: Uses patient-derived NPCs to capture genetic background effects on cellular phenotypes, enhancing clinical relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early assessment of target modulation effects on neuronal differentiation and glial fate, informing safety and efficacy profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing a human cellular system to validate targets before committing to medicinal chemistry campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target de-risking by enabling controlled manipulation of gene expression in NPCs and measurement of downstream phenotypic effects.
- Screening: Delivers assay-ready NPCs and neurospheres for quantifying impacts on migration, replication, oxidative stress, and apoptosis following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Generates imaging-based migration metrics (e.g., radial distance via ImageJ) and fluorescent reporter readouts to assess transduction efficiency and phenotypic changes.
- Translational Research: Maintains developmental and disease relevance by using patient-derived cells to model early pathogenic events in neurological disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable NPC platform that can be reused across multiple targets, genetic backgrounds, and phenotypic assays within a neuroscience discovery portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing reliance on post-mortem or non-human models through direct empirical testing in human neural progenitors.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized NPC expansion, cryopreservation, and neurosphere formation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms in human neurons.
- Portfolio Impact: Facilitates data-driven prioritization of targets based on phenotypic rescue or exacerbation in a clinically relevant human cellular system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neural differentiation, and lentiviral transduction techniques.
- Depends on access to poly-L-ornithine/laminin or Matrigel-coated surfaces, neural progenitor media, and centrifugation equipment for rosette harvesting and NPC splitting.
- Necessitates standardized protocols for neurosphere formation and migration assays to minimize variability across experiments and cell lines.
- Requires biosafety level 2-plus conditions when working with lentiviral or retroviral vectors to ensure safe handling.
- Success depends on careful handling to avoid rosette breakage during harvesting and maintaining optimal seeding densities for neurosphere formation.
