Name: 操作和在体外成熟非洲爪蟾卵母细胞，其次是胞浆内单精子注射，研究胚胎发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习非洲爪蟾卵母细胞体外成熟与胞浆内单精子注射技术，用于研究早期胚胎发育。该方法通过降解母体蛋白或过表达目标基因，为发育生物学研究提供高效工具。

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我们感谢 Gurdon 实验室成员的有益讨论。K.M. 是沃尔夫森学院的研究员，由赫歇尔·史密斯博士后奖学金和大不列颠笹川基金会提供资助。Gurdon 实验室的研究由惠康基金会（项目编号 RG69899）和英国医学研究理事会（MRC）向 J.B.G. 提供的资助支持。

注意：所有涉及青蛙的实验均按照英国政府内政部的要求进行。
1. 爪蟾卵母细胞（Xenopus laevis）的制备
<ol>
	<li>在取卵前约一周，使用1 ml无菌注射器和27 G针头，向雌性青蛙的背侧淋巴囊进行皮下注射，每只注射150 U的孕马血清促性腺激素（PMSG）以进行预促排处理。 
	注意：最好选用长时间未产卵（至少半年以上）或从未产卵过的青蛙。</li>
	<li>将预促排处理后的青蛙置于光照可控的房间内，水箱温度设置为18 °C（光照时间：上午7点至晚上7点开启，晚上7点至次日上午7点关闭）。</li>
	<li>在取卵当天，用双蒸水（ddH2O）将10x Modified Barth’s Solution（MBS）稀释10倍，配制1 L的1x MBS溶液，并加入青霉素和链霉素，使其终浓度均为10 μg/ml（即MBS+P.S.）。10x MBS储备液的成分为：880 mM NaCl、10 mM KCl、24 mM NaHCO3、8.2 mM MgSO4·7H2O、3.3 mM Ca(NO3)2·4H2O、4.1 mM CaCl2·6H2O、100 mM HEPES，pH 7.5。</li>
	<li>通过皮下注射120 mg（溶于400 μl）三卡因甲磺酸盐（MS222）对预促排青蛙进行麻醉。将注射后的青蛙置于盛有水的小型水箱中。</li>
	<li>10分钟后，将青蛙翻转以检查其麻醉状态，成功麻醉的青蛙对此操作无反应。若麻醉不完全，可在水箱中加入冰块，并继续等待10分钟。</li>
	<li>从水箱中取出青蛙，仰卧放置于湿润的擦拭布上。</li>
	<li>使用镊子和小型手术剪，在腹部中线侧方的下腹部夹起皮肤并做一小切口（约2 cm），在另一侧也做同样切口。</li>
	<li>剪开皮肤后，用镊子提起肌肉层，并在肌肉层上做切口。</li>
	<li>切开肌肉层后，观察卵巢，并用镊子从切口处将卵巢拉出。</li>
	<li>将取出的卵巢转移至含有MBS溶液的50 ml离心管中。 
	注意：应尽可能从两个切口处收集全部卵巢组织。</li>
	<li>通过放血法处死雌蛙，随后冷冻保存，以便后续妥善处理。</li>
	<li>用MBS+P.S.反复冲洗取出的卵巢数次，直至血液完全清除。然后将卵巢转移至含有MBS+P.S.的9 cm培养皿中。 
	注意：此时可在解剖显微镜下检查卵母细胞的质量。若卵母细胞质量明显较差，例如动物极色素分布不均（图1A），则不应继续操作，而应重新获取新的卵巢。理想的卵母细胞应具有均匀着色的动物半球，且大小大致相同。</li>
	<li>将卵巢组织撕成小块（1–2 cm2），并收集5 ml卵母细胞至新的50 ml离心管中。</li>
	<li>用MBS+P.S.反复冲洗5 ml撕碎的卵巢数次，然后加入MBS+P.S.至总体积为15 ml。</li>
	<li>向卵巢悬液中加入7单位去滤泡酶（见材料清单）。 
	注意：将冻干酶用10 ml双蒸水（ddH2O）溶解（终浓度为28单位/ml），置于冰上30分钟，期间轻轻涡旋混匀数次。分装为250 μl每管，-80 °C保存备用。</li>
	<li>将卵巢组织与酶在摇床上温和振荡孵育1小时（转速15 REV/min，相当于约0.014 ×g）。 
	注意：为几乎完全去除滤泡细胞，通常需要2小时至2小时15分钟的酶解时间。进行卵母细胞核移植实验时需要更长的孵育时间16。</li>
	<li>孵育1小时后，取出少量处理过的卵母细胞（10–20个），转移至含有MBS+P.S.的6 cm培养皿中。在解剖显微镜下观察去滤泡程度。若卵母细胞已彼此分离且至少部分去除了滤泡细胞（图1B），则立即进入下一步终止反应（步骤18）。若卵母细胞仍被大量滤泡细胞包裹，最多可额外孵育15分钟。</li>
	<li>加入大量MBS+P.S.以终止反应，弃去上清液。重复洗涤10次。 
	注意：添加MBS+P.S.时应沿50 ml离心管管壁倾倒，避免直接冲击卵母细胞。在MBS+P.S.中悬浮后，小型未成熟卵母细胞容易漂浮于缓冲液上层，应弃去这些漂浮的小卵母细胞。</li>
	<li>完成洗涤后，将卵母细胞转移至含有MBS+P.S.的9 cm培养皿中。 
	注意：从本步骤开始，应尽可能将卵母细胞保持在16–18 °C环境中，可通过将培养皿置于温控载物台上实现。</li>
	<li>根据Dumont分类法挑选VI期卵母细胞用于后续实验，并转移至新的含有MBS+P.S.的9 cm培养皿中。卵母细胞的转移可使用适当口径的玻璃移液管（口径应大于卵母细胞直径）。 
	注意：高质量的卵母细胞应具有色素均匀的动物半球，动物半球与植物半球之间界限清晰，且大小大致相同（图1C）。VI期卵母细胞为完全成熟的卵母细胞，可对孕酮产生反应（卵母细胞直径约为1.2–1.4 mm）。</li>
</ol>
2. 将反义寡核苷酸或 mRNA 注射到卵母细胞中
注意：本节所有步骤均应在配备温控循环水装置的显微镜载物台或装有冰块的塑料盒上于 16–18 °C 条件下进行。
<ol>
	<li>将200-300个挑选出的卵母细胞转移至一个新的、盛有MBS+P.S.的9 cm培养皿中，用于显微注射操作。 
	注意：每种条件下通常使用200-300个卵母细胞。一次实验总共使用约1,000个卵母细胞。</li>
	<li>准备注射反义寡核苷酸或 mRNA 时，推出微量注射器的金属推杆。</li>
	<li>使用注射器将矿物油注入玻璃毛细管中，并将装有油的玻璃毛细管插入显微注射仪的金属柱塞内。 
	注意：玻璃毛细管由微电极拉制仪拉制而成。这些针头应存放于盒中，避免尖端受损。</li>
	<li>在显微镜下使用小型手术剪尽可能剪切针尖，以获得最小直径的注射尖端。 
	注意：可使用微型熔炉或微移液器磨削器对针尖进行 sharpening。将针尖磨削成 25° 角度可提高穿透卵母细胞壁的能力。</li>
	<li>在解剖显微镜的载物台上放置一小条Parafilm，加入3 μl反义寡核苷酸或mRNA溶液液滴。</li>
	<li>将注射针的针尖插入小液滴中，用待注射的溶液填充针头。 
	注意：如果注射针头的尖端过细，金属推杆的末端应会出现气泡。此时，应更换更大的注射针头尖端，直至不再出现此现象。</li>
	<li>在注射针尖端约0.5 mm处做标记，该标记用于指示注射深度。</li>
	<li>将针尖对准卵母细胞的中心点（生发泡下方），沿赤道边界插入卵母细胞，同时用镊子轻轻夹住注射点对侧的卵母细胞，以防止注射过程中卵母细胞发生不期望的移动。 
	注意：寻找无卵泡细胞的区域（图1B）并从该位置插入针头，因为即使是细针也通常无法穿透卵泡细胞层。</li>
	<li>使用脚踏开关推出 4.6 ng/4.6 nl 或 9.2 ng/9.2 nl 的反义寡核苷酸，或适量的 mRNA（250 pg 至 13.8 ng）。反义寡核苷酸制备的详细步骤见 7.</li>
	<li>将注射后的卵母细胞转移至含有MBS+P.S.并补充0.1% BSA的6 cm培养皿中（卵母细胞孵育液；使用0.45 μm孔径滤器过滤除菌）。</li>
	<li>将卵母细胞在16℃下孵育 °C 或 18 °C 下孵育 1–2 天。 
	注意：注射后的卵母细胞可进行 体外 注射后数小时即出现成熟现象，在这种情况下，优选注射4.6 ng反义寡核苷酸。一般原则是，孵育时间越短，后续胚胎发育效果越好。</li>
</ol>
3. 体外 卵母细胞体外成熟（IVM）
<ol>
	<li>在卵母细胞成熟实验的前一晚，从 -80 °C 冰箱中取出孕酮储备液（30 mM，溶于乙醇），室温下间歇涡旋以溶解沉淀物。 
	注意：孕酮储备液通常在室温下放置 30 分钟至 1 小时。</li>
	<li>在50 ml MBS+P.S.（成熟培养基）中加入5 μl孕酮储备液（使孕酮终浓度为3 μM），在摇床中振荡30分钟，使孕酮在溶液中均匀分布。</li>
	<li>制备琼脂糖包被的6 cm培养皿 体外 成熟处理
	<ol>
		<li>向 50 ml 不含镁和钙的 1x MBS 中加入 1 g 琼脂糖。</li>
		<li>在微波炉中加热溶解琼脂糖。</li>
		<li>向6 cm培养皿中倒入少量琼脂糖溶液，以覆盖皿底。</li>
		<li>等待至少30分钟，直至凝固。</li>
	</ol>
	注意：琼脂糖包被可防止卵母细胞粘附于培养皿。一旦 体外 成熟卵母细胞紧密贴附于培养皿上，因此在从培养皿上分离过程中所受到的刺激极有可能导致卵母细胞被激活。</li>
	<li>向琼脂糖包被的培养皿中加入5-8 ml成熟培养基，将200-300个卵母细胞转移至每个6 cm培养皿中。 
	注意：转移卵母细胞时应尽量减少卵母细胞培养液的携带量。</li>
	<li>在16 °C下孵育16小时。 
	注意：例如，从下午5点开始治疗，至次日上午9点结束。</li>
</ol>
4. 胞质内单精子注射（ICSI）
<ol>
	<li>冷冻精子储备制备 
	注意：以下精子制备应在开始卵母细胞成熟实验前完成，用于ICSI的冷冻精子储备应保存在-80 °C。
	<ol>
		<li>按照步骤1.4至1.11操作，采集雄性青蛙的睾丸，但不要用镊子从切口处拉出脂肪和睾丸，也不需将睾丸从脂肪组织中分离。</li>
		<li>用1× Marc’s Modified Ringers溶液（MMR，100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgSO₄）清洗睾丸4，2 mM CaCl2，5 mM HEPES，pH 7.4）</li>
		<li>用干净的纸巾轻轻滚动已清洗的睾丸以去除脂肪和血管，然后用镊子清除残留的血管。</li>
		<li>将每个睾丸置于含有1 ml 1x MMR的3.5 cm培养皿中。</li>
		<li>用精细剪刀纵向剪开，再用镊子撕成小块，直至无大块残留。</li>
		<li>使用剪去末端的1 ml塑料吸头反复吹打混匀，将1 ml破碎的睾丸溶液转移至玻璃匀浆器中。</li>
		<li>用2-3次研磨将其匀浆，然后将溶液倒入固定在15 ml离心管顶部的50 μm孔径滤器上。让溶液自然滤过。</li>
		<li>重复步骤4.1.7，将剩余切割的睾丸用1 ml 1x MMR重悬。最后，用1x MMR冲洗匀浆器数次，并将冲洗液通过滤膜。</li>
		<li>对另一侧睾丸重复步骤 4.1.5 至 4.1.8，并将两个睾丸合并至一个 15 ml 离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 20 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于 2 ml 1x MMR 中，随后转移至新离心管中。 
		注意：确保无可见的血细胞存在。</li>
		<li>在一支14 ml超透明离心管中制备阶梯梯度。底层：4 ml 30%碘克沙醇；第二层（自下而上）：1 ml 20%碘克沙醇；第三层：5 ml 12%碘克沙醇；上层：含2 ml 1×MMR的睾丸细胞。使用1 ml移液器吸头极其轻柔地逐层叠加梯度液（缓慢加入，避免扰动底层液相）。 
		注意：仅使用一层30%碘克沙醇也适用于仅分离精子。</li>
		<li>使用超速离心机在4 °C下以10,000 x g转速在SW40转子中离心15分钟（减速时无刹车）。</li>
		<li>轻轻将离心管从超速离心机中取出。确认梯度各层之间以及底部沉淀处均存在界面。</li>
		<li>从沉淀中收集精子组分。</li>
		<li>将精子沉淀重悬于1x MMR中以去除碘克沙醇。在4 °C下以800 × g离心20分钟。 
		注意：若离心后上清液中仍有大量精子残留，需将上清液于 4 °C 下以 3,220 × g 再次离心 20 分钟，并收集沉淀的精子。</li>
		<li>弃去上清液，将精子沉淀重悬于1 ml 1×核制备缓冲液（NPB；250 mM蔗糖，0.5 mM三盐酸精脒，0.2 mM四盐酸亚精胺，1 mM EDTA，15 mM HEPES，pH 7.7）中13然后转移至一个Eppendorf管中。</li>
		<li>向1 ml精子溶液中加入50 μl 10 mg/ml的Digitonin溶液（将Digitonin粉末溶于DMSO中配制成50 mg/ml溶液，分装后于-80 °C冻存。使用前用1x NPB将50 mg/ml的储存液稀释至10 mg/ml。未用完的10 mg/ml Digitonin溶液可于-20 °C冻存并重复使用）。</li>
		<li>室温孵育5分钟。</li>
		<li>通过DAPI染色（DAPI终浓度为0.3 µg/ml）检测透化率。若透化细胞比例低于95%，可适当延长孵育时间。 
		注意：有时若同时孵育的精子数量过多（尤其是从多个睾丸收集精子时），可能难以实现透化，此时可能需要额外添加少量皂苷（Digitonin）；例如，若20%的精子未被透化，可额外加入20 μl 皂苷（Digitonin）。</li>
		<li>通过加入10% BSA至终浓度3%来终止透化。</li>
		<li>在 4 °C 下离心细胞。 
		注意：尽量使用较低的离心速度，起始条件为 100 × g 离心 5 分钟。若效果不足，可逐步提高离心速度和/或延长离心时间。</li>
		<li>用含0.3% BSA的1x NPB洗涤细胞，离心速度与步骤4.1.22相同。同时，配制精子保存缓冲液（SSB；2 ml 2x NPB、120 μl 10% BSA、1.2 ml 经高压灭菌的甘油、680 μl H₂O）2O</li>
		<li>向精子沉淀中加入500 μl SSB。用剪口吸头反复吹打数次，以重悬沉淀，避免损伤细胞。</li>
		<li>4 °C 条件下静置过夜以达到平衡。</li>
		<li>用剪切过的枪头将细胞上下吹打数次。</li>
		<li>取几微升样品，用1x MMR或1x PBS稀释10倍，用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>以每微升30,000个精子（或更高浓度）分装，直接于-80 °C冷冻，并以单次使用分装量在-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ICSI至 体外 成熟卵母细胞 
	注意：所有涉及卵母细胞的操作均应在 16–18 °C 下进行。
	<ol>
		<li>准备一支玻璃移液管用于转移成熟卵母细胞。 
		注意：玻璃移液管必须足够粗，以容纳卵母细胞而不造成挤压。</li>
		<li>在将卵母细胞移至含孕酮的培养基中16小时后，将已成熟的卵母细胞转移至盛有MBS+P.S.的6 cm琼脂糖包被培养皿中进行洗涤。 
		注意：重要的是，成熟卵母细胞必须被极其小心地处理。对卵母细胞的粗暴操作可能在精子注射前诱发其自发激活。</li>
		<li>通过观察白色斑点的出现来计数成熟卵母细胞，白色斑点的出现表明生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,图2若成熟率低于80%，则难以获得足够数量的存活胚胎用于后续分析。 
		注意：卵母细胞成熟后，将剩余的卵泡细胞剥离。图2).</li>
		<li>将卵母细胞从 MBS 洗涤液转移至新制的琼脂糖包被的 6 cm 培养皿中，该培养皿内装有注射介质（配制 500 ml：30 g 聚蔗糖（6%）、20 ml 10x MMR 和 500 μl 1,000x 青霉素-链霉素储备液）。</li>
		<li>至少孵育30分钟后，再开始ICSI操作。</li>
		<li>按照步骤2.2-2.4所述设置显微注射仪。 
		注意：通过遵循步骤 2.6 中所述程序，将注射针尖尺寸尽可能减小。针的直径为 20–40 μm。如步骤 2.4 所述对针尖进行斜面处理，可能有助于实现高效注射。</li>
		<li>取出精子分装液，用精子稀释缓冲液（SDB；250 mM 蔗糖，75 mM KCl，0.5 mM 亚精胺，0.2 mM 精胺，200 μM HEPES pH 7.5）稀释精子悬液。 
		注意：稀释倍数可根据针头大小等因素进行调整。初次尝试时，将30,000 精子/μl 的原液稀释120倍，必要时可进一步调整。</li>
		<li>在解剖显微镜的载物台上放置一小条Parafilm。通过移液混合精子注射液，并滴加数微升精子溶液。</li>
		<li>将稀释后的精子悬浮液吸入针头，向载玻片上连续10滴含有0.3 µg/ml DAPI的溶液中每滴注入4.6 nl，并在荧光显微镜下快速计数每次注射所递送的精子数量。 
		注意：每次注射以1-2个精子为宜。如有必要，可进一步稀释精子注射液，并重新检查每次注射的精子数量，直至达到理想浓度。</li>
		<li>推出测试注射液，并用适当浓度的新精子注射液填充。</li>
		<li>向100个成熟卵母细胞中每个注射4.6 nl精子溶液。 
		注意：必须持续注入溶液。首先确定推出4.6 nl所需的时间（通常为1–2秒）。重复以下操作：向卵母细胞中注射，等待数秒，取出针头并在注射溶液中进行模拟注射，再等待数秒，随后向另一卵母细胞注射。持续注射还可防止针尖堵塞。 alternatively，也可使用泵注法13.</li>
		<li>大约注射100次后，排出残留的精子溶液，并重新填充精子溶液（使用同一份精子溶液，但在移取前需上下吹打混匀）。 
		注意：如果针头吸取精子溶液不畅，可剪去针头尖端。若此操作仍无法改善情况，则需更换新的针头。</li>
		<li>重复注射过程，直至所有卵母细胞均完成注射。 
		注意：如果卵母细胞质量良好且注射成功，可在注射后20分钟内观察到卵母细胞收缩。</li>
		<li>将注射后的培养皿转移至 16 °C 或 18 °C&#160;°C 培养箱</li>
		<li>注射后4-5小时，检查ICSI胚胎的卵裂率。 
		注意：这些胚胎的卵裂沟可能不如正常受精胚胎清晰。部分胚胎还表现出异常卵裂，这可能是由于多精入卵所致。</li>
		<li>将已切割的胚胎（包括异常切割的胚胎）转移至孵育培养基中（配制500 ml：20 g Ficoll (4%)、5 ml 10x MMR 和 500 μl 1,000x P.S. 储存液）。</li>
		<li>将胚胎置于16℃培养&#160;在37°C或18°C培养箱中过夜培养。</li>
		<li>次日早晨，将胚胎转移至0.1x MMR中，并统计存活胚胎数量。</li>
		<li>平均而言，约有10%的注射精子的卵母细胞可发育至游动蝌蚪阶段（图3A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本文详细介绍了一种在受精前耗竭母源因子或过表达外源因子的新方法。该系统需要进行两次显微注射，但与宿主转移法7,17不同，无需对青蛙实施手术。从动物福利角度而言，省去青蛙手术步骤是最佳选择。此外，我们无需再考虑用于转移实验的宿主雌性青蛙的质量，这意味着可以排除一个影响实验成功率的生物学变量。因此，在该系统中，从PMSG预处理的青蛙所获得的卵母细胞质量是决定实验成功的关键生物学因素。卵母细胞的质量可在卵巢取出后或去滤泡后进行评估。若在这些阶段观察到任何异常，建议从另一只青蛙重新获取卵巢。另一个可评估卵母细胞质量的时间点是在卵母细胞成熟之后。若经孕酮处理的卵母细胞中，成熟迹象的比例低于80%，则可能无法获得足够数量的胚胎用于后续分析。采用酶法去滤泡替代手工去滤泡，也是该系统减少去滤泡操作劳动强度的另一优势。然而，仍有可能手工去滤泡所获得的胚胎发育效果优于酶法处理。
如图所示 图3，近10%的 体外 成熟卵细胞可发育至游动蝌蚪阶段。这些数据来自13次独立实验，包括已报道的实验。 8 以及新的注射实验。宿主转移法每次处理需要75–150个卵母细胞才能获得有意义的数据，因为移植的卵母细胞中有30–60%可发育至神经胚阶段。17我们的方法通常在每个实验组中起始使用200–300个卵母细胞，因为约有40–60%的卵裂胚胎能够发育至肌肉反应阶段。这些数据表明，两种方法均能支持较为理想的发育率。迄今为止，我们已通过该技术从注射对照mRNA和对照反义寡核苷酸的卵母细胞中获得10只存活的青蛙，表明该方法能够支持胚胎完成变态发育过程。
我们的卵母细胞操作-卵胞浆内单精子注射（ICSI）方法为研究受精后极早期胚胎发育过程中母源因子的作用提供了机会。此外，在受精前过表达染色质修饰因子，可能有助于在受精前对母源染色质进行重编程，从而解析发育所必需的母源染色质状态。该策略也可能与现有的基因编辑系统（如转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）18,19和CRISPR/CAS920,21）良好结合，因为这些工具可在受精前即实现表达。因此，我们的新方法在未来具有广泛的应用潜力。

Xenopus laevis 是一种被广泛使用的强大模式生物，用于研究发育过程1。这是因为 Xenopus 的卵细胞异常大（直径约 1.2–1.4 mm，而哺乳动物卵细胞直径约为 0.1 mm），且数量丰富。卵细胞中含有母体合成并储存的各类组分，足以支持胚胎发育至中囊胚转换期（MBT，发生在 8–8.5 期，此时胚胎具有 4,000–8,000 个细胞）。MBT 伴随着合子基因组的激活，从而产生指导后续发育的胚胎基因产物。
许多研究旨在鉴定对发育至关重要的母源因子。大量研究依赖于将反义寡核苷酸（寡核苷酸）包括吗啉代寡核苷酸注射到受精胚胎中，此时可在原肠胚阶段观察到母源蛋白的降解2-4。另一种方法是将mRNA注射至受精胚胎，以干扰基因功能或追踪过表达蛋白的命运。然而，对单细胞期胚胎的注射通常不会影响母源蛋白在MBT之前极早期胚胎阶段的表达水平。
Heasman 和 Wylie 建立了宿主转移方法以解决这一问题5。在该方法中，人工去滤泡的卵母细胞被注射反义寡核苷酸后，移植到宿主雌性个体中6。蛋白质在受精前即被下调，从而可研究下调蛋白在早期胚胎发育中的作用。这种母源蛋白耗竭方法已帮助鉴定出多种母源蛋白独特的发育功能，相关综述见文献7。
在本报告中，我们详细介绍了近期开发的一种方法，该方法可在无需人工去滤泡和宿主移植的情况下，实现受精前母源mRNA的耗竭或过表达8手动去卵泡耗时较长，且宿主转移通常需要熟练的技术以及动物手术的特定许可，这限制了母源蛋白耗竭方法的频繁使用。酶法去卵泡可替代手动去卵泡和宿主转移 9,10 胞浆内单精子注射（ICSI）11-13，分别。ICSI 技术最初被用于制备转基因青蛙的卵细胞 12精子和胚胎细胞核也被移植到 体外 成熟的两栖动物卵母细胞 11,14,15在此，我们展示了将精子注射到卵母细胞中的逐步方法 体外 预先注射了反义寡核苷酸或mRNA的成熟卵母细胞

<table><tbody><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）&amp;nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu 注射用粉末与溶剂</td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS222）</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>Liberase TM 研究级</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>用于卵母细胞去滤泡。储存于 -20&amp;nbsp;&amp;#176;C。</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Alpha laboratories</td><td>7&amp;rdquo; Drummond #3-000-203-G/XL</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪&amp;nbsp;</td><td>SUTTER Instrument</td><td>Model D-97</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>用于 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 成熟及卵胞浆内单精子注射（ICSI）</td></tr><tr><td>14 ml 超透明离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>用于精子纯化</td></tr><tr><td>OptiPrep 密度梯度介质（碘克沙醇）</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>用于精子纯化</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>细胞通透化试剂</td></tr><tr><td>摇床</td><td>Hybaid&amp;nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>用于卵母细胞去滤泡</td></tr><tr><td>解剖显微镜（体视变倍显微镜）</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>用于卵母细胞采集和显微注射</td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m 孔径滤器</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>用于精子纯化</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>用于精子纯化</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 或 210261</td><td>用于卵母细胞采集及去滤泡反应</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>用于精子纯化</td></tr><tr><td>90 mm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>易握型细胞培养皿，60&amp;nbsp;×&amp;nbsp;15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>易握型细胞培养皿，35&amp;nbsp;×&amp;nbsp;15 mm</td><td>FALCON</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

操作与 体外 成熟 非洲爪蟾 卵母细胞，继以胞质内精子注射，用于研究胚胎发育

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

两栖动物的卵被广泛用于研究胚胎发育。早期胚胎发育由卵子发生过程中积累的母源性储存因子驱动。为了研究这些母源性因子在早期胚胎发育中的作用，理想的方法是从胚胎发育的最初阶段就开始调控其功能。传统的基因干扰方法是通过将反义寡核苷酸（寡核苷酸）或 mRNA 注射到受精卵中，分别实现特定蛋白质的表达下调或过表达。然而，这些方法通常需要数小时以上才能影响蛋白质的表达，因此在胚胎发育早期阶段，基因功能的干扰效果不佳。本文介绍一种可在受精前改变母源性蛋白质表达水平的实验系统。 Xenopus laevis 从卵巢中获取的卵母细胞通过酶消化法去除滤泡细胞。在生发泡（GV）期，将反义寡核苷酸或mRNA注射至去滤泡细胞的卵母细胞中。这些卵母细胞是 体外 成熟至减数第二次分裂中期（MII期）的卵母细胞，随后进行卵胞质内单精子注射（ICSI）。通过该方法，最多可达10%的ICSI胚胎能够发育至游动蝌蚪阶段，从而可对特定基因的敲低或过表达进行功能检测。该策略可为研究母源性储存因子在早期胚胎发育中的作用提供有效途径。

使用ICSI胚胎的胚胎发育 体外 成熟卵母细胞进行了检测（图3A）。GV期卵母细胞发育至MII期的成熟率存在差异，主要取决于卵母细胞的质量。在条件良好的实验中，几乎100%的GV期卵母细胞可对孕酮产生反应，并表现出卵母细胞成熟的迹象，最终发育为处于MII期的卵子。所有成熟的卵母细胞均接受ICSI操作，约25%的注射卵子发生卵裂（图3A，对照组随机寡核苷酸注射卵母细胞 n = 13，未注射寡核苷酸卵母细胞 n = 7）。由对照组寡核苷酸注射卵母细胞和未注射卵母细胞发育而来的卵裂胚胎中，分别约有60%或80%发育至囊胚/原肠胚阶段。在发育至囊胚/原肠胚阶段的胚胎中，寡核苷酸注射样本中约有一半的胚胎质量良好（几乎无异常卵裂和凋亡迹象），而在未注射样本中，82%的囊胚/原肠胚胚胎质量良好图3A最后，寡核苷酸注射样本中分别有41%和11%的分裂胚胎达到肌肉反应期和游动蝌蚪期，而未注射样本中分别为60%和29%。图 3A）。这些ICSI胚胎是正常胚胎与异常胚胎的混合物（图3B。其中一些会经历变态发育并成长为成熟的青蛙8这些结果表明，将反义寡核苷酸注射到生发泡期卵母细胞中，随后进行体外成熟和卵胞浆内单精子注射，能够实现高效的早期胚胎发育。尽管反义寡核苷酸注射本身会降低胚胎发育率，但我们仍然可以获得足够数量的胚胎用于多种实验目的，例如检测发育率、逆转录聚合酶链反应、蛋白质印迹等。
<img alt="Microscope image of microinjection in embryo cells, illustrating early cell division stages." src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：典型示例 Xenopus laevis 优质或劣质卵母细胞用于 体外 成熟实验。（A） 质量较差的卵母细胞示例。例如，出现斑块状色素沉着的卵母细胞不用于后续实验。每个 非洲爪蟾 卵母细胞的直径约为1.2-1.4 mm。 (B) 部分去滤泡的卵母细胞。卵母细胞的右半侧覆盖有滤泡细胞，可通过血管的存在加以识别。箭头所示为无滤泡细胞的区域，注射针由此处注入。 (C) 高质量卵母细胞的示例，其大小均一，动物极着色均匀，且动物极与植物极之间具有清晰的对比度。
<img alt="卵母细胞成熟过程；显微镜图像显示卵母细胞成熟前后的状态。" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2: Xenopus laevis 卵母细胞成熟前后的形态。 卵母细胞成熟后，动物极顶部出现明显的白色斑点，滤泡细胞脱落。每个 Xenopus laevis 卵母细胞的直径约为 1 mm。
<img alt="Embryo development chart with tadpole images; compares cleavage rates, blastula, and muscular response data." src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3：由ICSI产生的胚胎发育情况 体外 成熟卵母细胞。（A） ICSI胚胎各阶段发育情况总结。卵母细胞注射对照组乱序反义寡核苷酸（对照寡核苷酸注射）或未注射（无注射），随后进行体外成熟（IVM）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）。各阶段对应的胚胎数量显示在柱状图上方。数据以均值±标准误（SEM）表示。N = 4–13次独立实验/不同雌性个体。 (B) 存活的ICSI胚胎示例。这些尾芽期胚胎来自一次实验，该实验以约200个卵母细胞作为起始材料。

我们描述了操作Xenopus laevis未成熟卵母细胞、卵母细胞体外成熟为卵子以及胞质内精子注射的方法。in vitro成熟为卵子以及胞质内精子注射的方法。该方案可在受精时实现某些母源蛋白的降解和目的基因的过表达，因此对于研究特定因子在早期胚胎发育中的作用具有重要价值。

两栖动物的卵被广泛用于研究胚胎发育。早期胚胎发育由母源性储存因子驱动，这些因子在卵子发生过程中积累。

以下实验的目的是在蛙卵受精时敲低卵母细胞中储存的母源蛋白，或过表达目标蛋白。该目标通过将反义寡核苷酸或mRNA注射到经酶处理去除了外膜的未成熟卵母细胞中，从而实现特定蛋白的降解或过表达。第二步，将卵母细胞转移至含有孕酮的培养液中，以诱导卵母细胞成熟为卵子。接下来将精子注射到体外成熟的卵子中，以观察基因敲低或过表达对胚胎发育的影响。最终，注射了寡核苷酸的卵母细胞发育为能游动的蝌蚪，是基因敲低或过表达的功能性检测。该技术相较于现有的宿主转移等方法的主要优势在于，我们可以跳过青蛙手术过程，直接采用标准实验流程。在含有 MBS 加 ps 的 9 厘米培养皿中收集覆盖于 SAC 上的健康细胞。然后将卵巢撕成 1 至 2 厘米见方的小块。取约 5 毫升撕碎后的卵巢组织连同细胞，转移至新的 50 毫升离心管中。然后用含PS的MBS缓冲液冲洗组织数次，并将卵收集到15毫升新鲜的含PS的MBS缓冲液中。现在，向悬浮液中加入7单位的去卵膜酶，并在温和振荡条件下孵育悬浮液，直至卵至少部分去膜。此孵育过程至少需要一小时。加入 MBS 加 Ps 液体以终止反应。将溶液沿管壁加入，不要直接加到细胞上。让组织沉淀后，弃去上清液和试剂。微小且未成熟的细胞会漂浮，也应弃去。洗涤后，此洗涤步骤共需重复10次。将细胞转移至含MBS加ps的9厘米培养皿中。将培养皿转移至解剖显微镜下，此后尽可能将卵母细胞维持在16至18摄氏度。使用Dumont分类法，用玻璃移液管挑选质量良好的六期卵母细胞，并将其收集至另一含有MBS加ps的新培养皿中。高质量的卵母细胞应在动物半球具有均匀的色素分布，并且动物半球与植物半球之间界限清晰。它们的大小也应基本一致，直径应在1.2至1.4毫米之间。每次注射收集约200至300个细胞，每个实验共计约1000个细胞。O位点的质量是成功的关键。如果在制备过程中卵泡出现异常，建议您从另一群鸡中选取一个卵巢进行校正并重新开始。在准备注射反义寡核苷酸时，将微量注射器的金属推杆调至最低位置，并将一支充满油的玻璃毛细管套在金属推杆上。在解剖显微镜下，使用小型手术剪刀剪去针尖的末端。尽可能制作更细小的枪头。接下来使用激光。在显微镜载物台上放置一条对苯二甲醛，然后在其上加入三微升核酸溶液，浓度为每微升一微克。用此方法填充针头尖端。如果困住空气，应将开口扩大。现在在注射针头尖端约半毫米处做一个可见标记。然后开始注射卵细胞，先注射一个，找到一个无滤泡细胞的区域，以便针头能够在此处穿透。将针尖对准生发泡下方的中心点，沿赤道边界插入。同时，用镊子在相对的一侧固定住卵细胞。现在使用脚踏开关控制，推出溶液，推出4.6至9.2纳克的反义寡核苷酸，或250皮克至13.8纳克的信使RNA。注射完所有细胞后，将其转移至培养介质中，孵育数天，以使变化发生。在蛋白酶体中。随后，将细胞连同少量培养基转移至六厘米的琼脂糖包被培养皿中，每个培养皿含有五到八毫升成熟培养基。然后让细胞在此培养基中发育16小时，再进行精子注射。本方案中必须预先准备冷冻保存的精子储备。孵育16小时后，请参照文字方案进行成熟度评估。用MBS加PS溶液，将细胞非常小心地转移至六厘米卵胶包被培养皿中以冲洗下来。若细胞操作不当，可能在ixy前自发激活。现在，计数成熟的卵母细胞，并观察是否有白色斑点，白色斑点表明卵母细胞的生发泡已经破裂。如果优质卵母细胞比例低于80%，则整体健康状况不足以耐受受精（ixy）操作。如符合标准，则继续进行。半小时后，用新的培养皿装入注射液，轻柔地将所有细胞转移至该培养皿中。随后使用与寡核苷酸注射相同的注射器制备方法，将成熟细胞与精子溶液进行注射。理想情况下，每 4.6 纳升注射液中应含有一个或两个精子。为了测试该注射溶液，制备浓度为每毫升0.3微克DPI的DPI溶液液滴，并向每个液滴中注射4.6纳升。然后通过荧光显微镜计数每个液滴中的精子数量。在确认精子浓度后，向细胞中注射4.6纳升的精子溶液。确保注射溶液所需的时间保持一致，并以稳定的速度注射卵母细胞，尽量减少注射之间的停顿。每注射100次后，更换一次精子溶液。所有成熟卵母细胞注射完毕后，将培养皿孵育4至5小时，然后进行检查。对于已经发生卵裂的胚胎，其卵裂沟可能不如正常受精胚胎清晰，应将所有已卵裂的胚胎转移至培养液中，过夜培养。次日，将存活的胚胎转移至0.1 XMMR溶液中，以观察ixy胚胎的发育情况。使用体外成熟卵母细胞的实验效果良好，几乎所有生发泡期卵母细胞均对孕酮产生反应，并表现出成熟的迹象。约25%的卵母细胞发生了卵裂。60%至80%的卵裂胚胎发育至原肠胚阶段，其中约三分之一进一步发育至游动蝌蚪阶段。ixy胚胎包含正常与异常胚胎的混合物，表明将反义sogo注入生发泡期卵母细胞后，经过体外成熟（IVM）和Dixie处理，可实现早期胚胎发育。观看本视频后，您应能充分理解如何在因子分解前对母体蛋白进行操作。

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操作和<em&gt;在体外</em中&gt;成熟<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;卵母细胞，其次是胞浆内单精子注射，研究胚胎发育

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