Name: 使用李斯特菌单细胞基因评估受感染小鼠培养和心脏殖民化中心脏细胞的细菌入侵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习评估单核细胞增生李斯特菌对心脏细胞的体外和体内入侵方法。该方案利用小鼠模型和细胞培养技术，帮助研究人员深入了解细菌在心脏组织中的定植机制及致病性。

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本研究由公共卫生服务基金 AI41816 和 AI099339（N.E.F.）以及 NIAID 资助的 F31AI094886-01（P.D.M.）支持。研究内容仅由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。

1. 单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）菌株的保存与培养条件
<ol>
	<li>通过高压灭菌脑心浸出液琼脂（BHI）并将其倒入培养皿中，制备固体培养基。将平板在室温下过夜干燥，然后在37 °C下再次过夜干燥。</li>
	<li>使用无菌接种环，从先前制备的冷冻保存菌种（在BHI液体培养基中含20%甘油，于-80 °C保存）或从含有已分离菌落的琼脂平板中获取少量单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）样本。</li>
	<li>采用无菌操作技术，对样本进行划线以获得单菌落分离。确保在交叉划线之间对接种环进行灭菌，以防止过多的交叉污染，并确保被评估菌株的单个菌落得以分离。将平板在37 °C下培养过夜。</li>
	<li>使用无菌接种环挑取一个分离菌落，接种至14 ml聚苯乙烯管中的2 ml BHI液体培养基（不含琼脂）中。</li>
	<li>进行检测或感染实验时，将液体培养物在37 °C培养箱中静置（不振荡）培养过夜；若用于保存培养的分离菌株，则在37 °C下以180–200 rpm振荡培养过夜。可通过向培养物中加入甘油至终浓度20%，并将密封的试管长期保存于-80 °C，以实现菌种保藏。</li>
</ol>
2. H9c2 心肌样细胞的保存与培养条件
<ol>
	<li>购买或获取 H9c2 细胞的冻存株，以及含高糖和丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺（Glut）和青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液（PSG）。&#160;FBS、Glut 和 PSG 应在 -20 °C 保存，而 DMEM 可在 4 °C 保存。建议在冷冻前将 FBS 分装至 50 ml 锥形管中。</li>
	<li>在超净工作台内，解冻两份 FBS 分装液。将其中一份加入一个 500 ml 的 DMEM 瓶中，配制成含 10% FBS 的 DMEM 混合液。向此混合液中加入 6 ml Glut，并将最终溶液储存在 4 °C。该溶液可标记为“不含抗生素的 DMEM”（DMEM –Ab）。</li>
	<li>向第二个 500 ml 的 DMEM 瓶中加入另一份 50 ml 的 FBS 分装液。向此溶液中加入 6 ml PSG，并在 4 °C 保存。该溶液可标记为“含抗生素的 DMEM”（DMEM +Ab）。</li>
	<li>在超净工作台内，从 DMEM +Ab 中取出 10 ml，加入一个 25 cm² 组织培养瓶中。</li>
	<li>将培养瓶留在超净工作台内，从液氮中取出一份冻存的 H9c2 细胞，迅速将冻存管放入 37 °C 水浴中，直至细胞完全解冻。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒冻存管进行消毒，然后放回超净台内。为尽量减少细胞在高浓度 DMSO 中的暴露时间，迅速将全部细胞悬液加入含 10 ml DMEM +Ab 的培养瓶中。&#160; 此操作可充分稀释 DMSO，以保证细胞过夜存活和贴壁。</li>
	<li>将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的组织培养孵箱中过夜。</li>
	<li>次日早晨，检查细胞层以确认其已贴壁。此时细胞贴壁率通常在 80–100% 之间。</li>
	<li>在组织培养超净台内，用真空泵吸除培养瓶中的培养基，仅保留瓶内的细胞。</li>
	<li>向细胞中加入约 2 ml 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，轻轻晃动约 3 秒。</li>
	<li>将培养瓶倒置，使胰蛋白酶溶液不再接触单层细胞，然后用真空泵吸除胰蛋白酶。</li>
	<li>向细胞中加入第二份 2 ml 的胰蛋白酶溶液，并将培养瓶转移至倒置显微镜下。在轻轻晃动培养瓶的同时观察细胞，确保单层细胞完全分散。</li>
	<li>一旦单层细胞完全分散，立即返回组织培养超净台，向细胞悬液中加入 4 ml DMEM +Ab。</li>
	<li>取 2 ml 细胞悬液加入一个含有 23 ml DMEM +Ab 的 50 ml 组织培养瓶中。轻轻晃动培养瓶，然后将其置于步骤 7 所述条件的组织培养孵箱中。</li>
	<li>每日观察细胞，直至其达到约 80% 汇合度（约每毫升 2.0–4.0 × 105 个细胞）。非常重要的是，细胞不可过度汇合，因为当长期缺乏 FBS 时，细胞可能分化为骨骼肌成肌管14，而这种分化可能影响细菌侵袭能力。&#160; 需密切监测细胞状态，若细胞汇合过度，则应重新开始使用新的细胞冻存管。</li>
	<li>当细胞达到 80% 汇合度后，可按上述方法传代至另一个 50 ml 培养瓶，或用于侵袭实验的准备。</li>
</ol>
3. 准备H9c2细胞进行侵袭实验
<ol>
	<li>在组织培养超净台中，使用真空抽吸法移除已达到80%汇合度的50 ml H9c2细胞培养瓶中的培养基。</li>
	<li>向单层细胞中加入4 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，立即用真空抽吸法移除。</li>
	<li>向培养瓶中再加入另一份4 ml的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并将培养瓶转移至倒置显微镜下观察单层细胞的分散情况。</li>
	<li>待细胞完全分散后，将培养瓶移回超净台，向其中加入4 ml DMEM –Ab培养基。通过移液器反复吹打溶液，确保将细胞从培养瓶底部完全脱离。</li>
	<li>完成细胞重悬后，将全部细胞悬液转移至一个50 ml锥形离心管中。</li>
	<li>取20 µl该悬液，使用血细胞计数板计数每毫升中的细胞数量。</li>
	<li>确定细胞浓度后，通过向新鲜DMEM –Ab培养基中加入适量的细胞悬液，将细胞浓度调整至2.25 × 104 个细胞/ml。调整后的溶液总体积应为25 ml。</li>
	<li>在超净台内，将玻璃盖玻片浸入90%乙醇中进行消毒，随后快速通过火焰灼烧灭菌。每块盖玻片消毒后立即放入24孔组织培养板的各个孔中，每孔一块。</li>
	<li>待所有孔中均放入盖玻片后，使用25 ml移液器向每孔加入1 ml稀释后的细胞悬液，并用无菌针头将每块盖玻片轻轻压至孔底。</li>
	<li>使用倒置显微镜检查各孔，确保每孔中的细胞数量相近。将24孔板置于37 °C、5% CO2 和95%湿度的组织培养孵箱中过夜培养。</li>
	<li>次日早晨，观察各孔，确认盖玻片上贴壁的成肌细胞数量相近，且盖玻片未在孔中漂浮。&#160;</li>
</ol>
4. 为侵袭实验制备单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）菌株
注意：所有实验室操作均按照美国疾病控制与预防中心生物安全二级指南进行。
<ol>
	<li>准备24孔板用于检测后，使用无菌接种环挑取待检测细菌侵袭能力的菌株单菌落，并分别接种到含有2 ml BHI肉汤的14 ml试管中。</li>
	<li>将接种后的试管置于37 °C、倾斜45°的培养箱中，静置（不振荡）过夜培养。</li>
	<li>次日早晨，从培养箱中取出培养管，短暂涡旋振荡，以确保细菌均匀悬浮。</li>
	<li>使用分光光度计在600 nm波长下测定培养液的光密度。读数前务必用无菌BHI肉汤将分光光度计调零。</li>
	<li>对于L. monocytogenes，光密度值与每毫升细菌浓度直接相关，光密度1.000相当于每毫升1.0 × 109 CFU。</li>
	<li>计算感染2.25 × 104个细胞所需接种2.25 × 106个细菌（MOI = 100）的培养物体积。</li>
	<li>吸取所需体积的培养物，转移至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>在19,000 × g下离心3分钟，弃去上清液。将离心管开口端轻触纸巾，以去除附着在管口的残留培养基。</li>
	<li>用1 ml无菌PBS重悬细菌沉淀，并涡旋振荡以确保充分混匀。该悬液每20 µl应含有约2.25 × 106 CFU（即1.125 × 108 CFU/ml）。</li>
</ol>
5. 进行侵袭实验
<ol>
	<li>在进行侵袭实验的前一天，按照第3节所述方法准备H9c2细胞的24孔板，同时按照第4节所述方法将所需的单核增生李斯特菌（Listeria）菌株接种于无菌BHI肉汤中。</li>
	<li>根据第4节中的方案，将待检测侵袭能力的菌株重悬于PBS中。注意：此时可通过将各样品进行梯度稀释后涂布于固体培养基上，经隔夜培养后计数菌落，以测定感染滴度。</li>
	<li>将至少20 µl PBS-细菌溶液加入24孔板的各个孔中。注意每种菌株至少需要三个独立的孔以实现三复孔检测，因此最多可同时检测8种菌株。</li>
	<li>加入细菌后，轻轻摇动培养板，使每个孔内的样品均匀分布，并将24孔板放回培养箱中，在37 °C、95%湿度及5% CO2条件下孵育45分钟。</li>
	<li>在孵育期间，按第2节方法准备一份DMEM – Ab（不含抗生素的DMEM）分装液，即取25 ml DMEM – Ab置于50 ml Falcon管（或等效容器）中。</li>
	<li>向25 ml DMEM – Ab分装液中加入庆大霉素，使其终浓度为15 µg/ml（加入7.5 µl的50 mg/ml储备液）。将DMEM – Ab +Gent溶液置于37 °C水浴中，持续保温45分钟孵育过程。</li>
	<li>将25 ml PBS分装至50 ml Falcon管中，并在45分钟孵育期间置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>45分钟孵育结束后，取出24孔板并置于生物安全柜中，用真空抽吸法移除各孔中的含菌培养基，不同菌株之间需更换玻璃移液管头。</li>
	<li>向每孔中加入约1 ml PBS，以洗涤去除细胞表面松散附着的细菌，随后用真空抽吸法移除PBS。</li>
	<li>完全移除PBS后，向每孔中加入1 ml DMEM – Ab +Gent。庆大霉素仅能杀死位于细胞外的细菌，因此细胞内存活的细菌不受影响。</li>
	<li>将24孔板重新放回培养箱中，继续孵育1小时。</li>
	<li>在1小时孵育期间，准备14 ml聚丙烯管，每管加入1 ml无菌ddH2O。每张盖玻片需对应一管，因此对于一块24孔板，共需准备24管。</li>
	<li>1小时孵育结束后，从培养箱中取出24孔板并置于生物安全柜中，同时将第5.12步准备的试管一并移入。</li>
	<li>使用无菌镊子将每张盖玻片从对应孔中取出，并立即放入单独的试管中。每次操作不同盖玻片前，务必用乙醇浸泡镊子并火焰灭菌，以防止交叉污染。</li>
	<li>所有盖玻片取出并分别放入试管后，丢弃24孔板。</li>
	<li>返回实验台，将每支试管涡旋振荡5–10秒。</li>
	<li>从每支试管中取出部分液体，分别加入96孔板的各个孔中，然后使用1:10梯度稀释法对各样品进行连续稀释，直至1:1,000稀释度。</li>
	<li>使用预热且干燥的LB平板，将各稀释系列样品点样于琼脂平板上。可使用多通道移液器从每个样品的稀释系列中取5–10 µl进行点样。</li>
	<li>同时从每个未稀释的样品中取20 µl，直接点样于另一块LB琼脂平板上（与稀释系列分开）。此较大体积可用于计数侵袭能力较弱的菌株。</li>
	<li>所有样品点样完成后，丢弃含有盖玻片的14 ml试管。用Parafilm密封96孔板，并将其放入冻存盒中于-80 °C保存，以备后续重铺使用。</li>
	<li>让点样液滴完全干燥。将平板置于生物安全柜中并打开盖子可显著加快干燥过程。</li>
	<li>待液滴完全干燥后，将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日早晨，计数稀释系列中菌落数量易于统计的点样区域（菌落数约为5至50个）的菌落数量（图1），并利用该系列数据计算每种检测菌株在每张盖玻片上的细菌数量。&#160;</li>
</ol>
6. 为小鼠感染制备单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）菌株
<ol>
	<li>感染前一晚，使用灭菌接种环挑取所需菌株的单菌落，分别接种于含有 2 ml BHI 肉汤的 14 ml 试管中。</li>
	<li>将接种后的试管置于 37 ˚C、倾斜 45˚ 的培养箱中，静置（不振荡）过夜培养。</li>
	<li>次日早晨，从培养箱中取出培养管，短暂涡旋振荡，以确保细菌均匀悬浮。</li>
	<li>使用分光光度计在 600 nm 波长下测定培养液的光密度。测定前务必用无菌 BHI 肉汤将分光光度计调零。（对于L. monocytogenes，光密度与每毫升细菌浓度呈正比，光密度 1.000 相当于每毫升 1.0 × 109 CFU）</li>
	<li>计算每只动物感染所需的培养液体积。通常注射体积为 200 μl PBS，含单个菌株 10,000 CFU，即所需浓度为 5.00 × 104 CFU/ml。</li>
	<li>取每种最终稀释液 5 μl，直接涂布于 LB 琼脂平板上。&#160; 于 37 °C 过夜培养，以确认接种所用浓度。</li>
	<li>稀释后 1 小时内完成每种 CFU 悬液的注射（见下文）。</li>
</ol>
7. 接种 L. monocytogenes 通过尾静脉注射将细菌注入小鼠体内并评估肝脏、脾脏和心脏中的细菌载量
注意：所有动物实验均按照美国疾病控制与预防中心（CDC）生物安全二级标准进行。&#160; 通常提前一周订购小鼠，并以每笼5只进行合笼饲养。注射前，小鼠需在新实验室环境中适应四天。本实验使用6至8周龄的雌性Swiss-Webster小鼠，在屏障环境中饲养，每笼5只，饲喂非限制性饮食。
<ol>
	<li>每次准备一笼小鼠，移去笼盖及食水盒，并将鼠笼置于加热灯下五分钟。此步骤可使尾静脉扩张，便于注射操作。</li>
	<li>取出一只动物，将其放入固定装置（或剪去末端的 Falcon 管）中，以在注射期间固定动物。</li>
	<li>使用酒精棉片清洁注射部位，并等待酒精挥发。此操作不仅可消毒局部区域，还可进一步扩张尾静脉。</li>
	<li>使用配备 27.5 号针头的 1 ml 注射器，将 200 μl 所需菌液轻柔地注入尾静脉。</li>
	<li>使用纱布按压注射部位以止住可能出现的出血，并将动物放入洁净的鼠笼中。</li>
	<li>对剩余动物及不同菌株重复上述操作。务必在每笼动物上标注其所接种的菌株。</li>
	<li>每日观察动物状态，对出现明显病态的动物及时取出并实施安乐死。&#160;若无动物出现病征，则允许感染持续 72 小时后统一处死所有动物。</li>
	<li>实施安乐死时，使用瓶装 CO2 进行麻醉直至呼吸完全停止，随后进行颈椎脱位以确认动物死亡。</li>
	<li>处死后，将动物转移至组织培养超净台进行解剖。</li>
	<li>使用解剖板，用粗针固定动物四肢，并喷洒 70% 乙醇至动物体表完全湿润。</li>
	<li>沿腹部和胸部向后剪开皮肤，采用从阴道口向上延伸至剑突，并继续向两侧腋窝延伸的 Y 形切口。</li>
	<li>向后拉开皮肤，并移除固定四肢的针头以保持解剖视野开放。</li>
	<li>轻柔切开腹膜，暴露肠道、胃、肝脏和脾脏。</li>
	<li>首先切断肝脏顶部的肝静脉和冠状韧带，开始剥离肝脏。位于肝脏下方、连接肝脏与小肠起始段以及背部肌肉的其他韧带也需一并切除。</li>
	<li>将肝脏放入含有 5 ml 无菌 ddH2O 的 50 ml Falcon 管中。</li>
	<li>随后分离脾脏，轻柔剪断其血管和韧带以取出脾脏。脾脏较肝脏更易取出。将脾脏放入另一含有 5 ml 无菌 ddH2O 的 Falcon 管中。</li>
	<li>定位膈肌，沿肋骨轻柔剪开以暴露胸腔。从剑突沿胸骨剪至颈部水平，打开胸腔，暴露心脏和肺脏。</li>
	<li>使用镊子轻轻夹住心脏心尖部，提起心脏使主动脉和肺动脉处于张力状态，剪断这些血管以分离心脏。</li>
	<li>将心脏放入含有 5 ml 无菌 ddH2O 的 50 ml Falcon 管中。</li>
	<li>丢弃动物尸体，并对每只动物重复上述操作，每次取出器官时均使用含有 5 ml 无菌 ddH2O 的洁净 Falcon 管。</li>
	<li>所有器官取出后，清洁工作台并返回实验台。</li>
	<li>准备一组 5 支试管，用于清洗和消毒每组五只小鼠的各器官匀浆器（即 一组 5 支试管用于 5 个肝脏，5 支用于 5 个脾脏，5 支用于 5 个心脏）。每组试管中，4 支加入 30 ml 无菌 ddH2O，1 支加入 30 ml 90% EtOH。</li>
	<li>使用 TissueMaster（或等效匀浆器），在匀浆器运行状态下，按以下顺序将其探头浸入步骤 7.21 准备的试管中进行清洗：</li>
	<li>第 1 管（ddH2O） 
	            第 2 管（ddH2O）中 5 秒 
	            第 3 管（EtOH）中 5 秒 
	            第 4 管（ddH2O）中 5 秒 
	            第 5 管（ddH2O）中 5 秒</li>
	<li>使用匀浆器匀浆一个肝脏，至少持续 2 分钟，或直至无可见组织块残留。使用镊子清除探头上的大块残渣。</li>
	<li>重复步骤 7.22 所述的清洗流程。</li>
	<li>对其他肝脏重复匀浆操作，确保每次处理肝脏后均按步骤 7.22 所述方法清洗探头。</li>
	<li>所有肝脏完全匀浆后，丢弃用于肝脏的清洗管（1–5）。</li>
	<li>对脾脏和心脏同样重复匀浆/清洗流程，确保每组器官使用一套新的清洗管。若清洗管在操作过程中变浑浊，应立即丢弃并更换新管以完成该组操作。</li>
	<li>所有器官匀浆完成后，对匀浆器进行最后一次清洗循环，并充分干燥后存放。</li>
	<li>将每种器官匀浆液约 200 μl 分别加入 96 孔板的独立孔中。</li>
	<li>对器官样本进行系列稀释，以 1:10 梯度稀释至 1:10,000（肝脏和脾脏）或 1:1,000（心脏）。</li>
	<li>将稀释系列点样于预热的 LB 琼脂平板上。同时取每种未稀释器官匀浆液 20 μl，分别涂布于独立的 LB 琼脂平板，用于计数定植量较低器官的菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>丢弃含有匀浆后器官的 Falcon 管，用封口膜包裹含有稀释系列的 96 孔板，并置于 -80 °C 冻存盒中保存。</li>
	<li>让点样液滴自然干燥。将平板置于超净台中并移除盖子可加快干燥过程。</li>
	<li>液滴干燥后，将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日清晨计数每点的菌落数量，并根据稀释梯度计算每个器官中的总细菌数。</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+hot+dogs+to+host+cells%3A+how+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes+regulates+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression.</a> Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).</li>
<li>Drevets, D. A., Bronze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+epidemiology%2C+human+disease%2C+and+mechanisms+of+brain+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).</li>
<li>Farber, J. M., Peterkin, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes.+a+food-borne+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen.</a> Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+how+Listeria+monocytogenes+targets+and+crosses+host+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers.</a> Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+listeriosis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Human listeriosis and animal models.</a> Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).</li>
<li>Bou Ghanem, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathog. 8, e1003015(2012).</li>
<li>Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+infection+with+signature-tagged+Listeria+monocytogenes+reveals+organ-specific+growth+and+dissemination+routes+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs.</a> Infect Immun. 80, 720-732 (2012).</li>
<li>Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subpopulations+of+Listeria+monocytogenes+with+enhanced+invasion+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells.</a> J Med Microbiol. , (2011).</li>
<li>Adler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+pseudotumor+of+the+heart+caused+by+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection.</a> J Infect. 58, 161-163 (2009).</li>
<li>Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocarditis+due+to+Listeria%3A+description+of+two+cases+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature.</a> Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).</li>
<li>Brouqui, P., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocarditis+due+to+rare+and+fastidious+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocarditis due to rare and fastidious bacteria.</a> Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).</li>
<li>Brusch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+infections+in+the+immunosuppressed+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Cardiac infections in the immunosuppressed patient.</a> Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).</li>
<li>McCue, M. J., Moore, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocarditis+with+microabscess+formation+caused+by+Listeria+monocytogenes+associated+with+myocardial+infarct%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct.</a> Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).</li>
<li>Menard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+L-type+calcium+channel+expression+during+retinoic+acid-induced+differentiation+of+H9C2+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells.</a> J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).</li>
<li>Czuprynski, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+silage%2C+sandwiches+and+science%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Health+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science.</a> Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).</li>
<li>Grundler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li>
<li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776%2C+a+cardiotropic+serovar+4b+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552(2012).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

单核细胞增生李斯特菌 是一种广泛存在且已被充分表征的人类病原体，能够引起多种不同的疾病表现15该细菌此前已被报道具有跨越屏障的能力，例如血脑屏障和胎盘-胎儿屏障，从而分别到达并定植于中枢神经系统和发育中的胎儿。 体内 生物体定植这些组织的能力通常由另一种能力补充 体外 侵入构成靶器官的代表性培养细胞的能力。例如，脉络丛上皮细胞的侵入与该生物体定植中枢神经系统的能力相关。16；绒毛滋养层外植体已被用于代表母胎屏障17本方案中描述的方法可用于评估细菌在体外培养的心脏细胞中的侵袭能力，以及比较不同分离株在心脏中的定植情况与在肝脏和脾脏中定植的相对水平。
本方案包含多个关键步骤，其中最为关键的是使用正确浓度的细菌菌落形成单位（CFU）感染生长在盖玻片上的组织培养细胞或感染动物。如果不同孔之间或动物之间的细菌CFU数量未得到准确控制，则无法对样品进行直接比较。为确保细菌CFU数量的准确估算，必须通过将最终稀释液直接涂布于培养基平板上进行培养，来反复核对用于制备接种物的稀释系...

Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性胞内病原菌，可在易感人群中引起严重疾病，包括老年人、孕妇、艾滋病病毒/艾滋病患者以及接受化疗的个体1。这些人群的感染通常是由于摄入了受污染的食品所致，且大多数感染与大规模食源性暴发相关2,3。在人类和其他哺乳动物中，L. monocytogenes 能够穿过小肠上皮屏障，并被转运至肝脏4,5。动物模型研究表明，摄入的细菌可在肠绒毛内复制，并通过门静脉进入肝脏，或经肠系膜淋巴结扩散进入血液循环，从而通过血行播散至肝脏和脾脏6,7。在肝脏和脾脏中，该细菌能够介导其被专业吞噬细胞以及定居的实质细胞摄取，并迅速在这些器官内建立感染。随着细菌载量的增加，大量细菌重新释放进入血液，进而可进一步定植于中枢神经系统和胎盘（如存在）等易感组织。这些部位的定植导致了人类单核细胞增生李斯特菌病最常见的临床表现，包括脑膜炎、脑炎以及胎儿流产2。
最近研究发现，L. monocytogenes 的某些亚群具有更强的能力侵入并在心肌组织中复制8。心脏受累的表现多样，可从心内膜炎和心包炎，到伴有传导异常的暴发性心肌炎9-13。每年由 L. monocytogenes 引起的心脏病例总数较低，但由于此类感染表现通常未被充分认识，实际数量可能被低估。病原体对心脏的定植通常需要宿主存在易感因素，例如既往瓣膜损伤或人工心脏瓣膜。然而，已有研究发现某些 L. monocytogenes 分离株能够在无任何心脏损伤和/或异常的情况下，在感染动物的心脏中定植，这一特性尤为显著8。
此处描述了 体外 和 体内 用于评估感染动物心脏组织中细菌定植的方法，包括在组织培养中进行侵袭实验以及活体动物感染实验。这些方法不仅有助于鉴定能够在感染动物心脏组织中定植的菌株，也有望用于鉴定促进细菌侵入心肌细胞和/或导致心脏病理变化的细菌基因产物。这些方法便于比较不同菌株之间的心脏趋向性。本文所述方法中， 单核细胞增生李斯特菌 10403S 被用作非嗜心性菌株的典型代表，临床分离株 07PF0776 被用作嗜心性菌株的代表性例子。选择这两种菌株旨在为细菌侵袭心肌细胞的能力提供比较依据。 体外 感染小鼠心脏的定植 体内分离株07PF0776是从一名HIV阳性患者脑室间脓肿中分离得到的临床分离株，该脓肿导致患者发生致死性心律失常。8. 单核细胞增生李斯特菌 分离株的毒力潜力可能存在差异，且鉴于其倾向于 单核细胞增生李斯特菌 对免疫抑制者和孕妇具有感染风险，属于这些人群的个体在评估不同临床分离株时应谨慎行事。

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI 肉汤基础培养基</td><td>237200</td><td>2 kg 脑心浸液粉末（不含琼脂）</td></tr><tr><td>Difco</td><td>琼脂</td><td>214510</td><td>2 kg 颗粒状琼脂</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI 琼脂</td><td>241810</td><td>2 kg 脑心浸液琼脂粉（含 7.5% 琼脂）</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB肉汤基础培养基</td><td>12975-084</td><td>2 kg LB液体培养基干粉（不含琼脂）</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>玻璃盖玻片</td><td>12-545-80</td><td>12 mm 玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24孔组织培养板</td><td>35-3047</td><td>24孔，等离子处理过的组织培养板</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14 mL 聚苯乙烯管</td><td>352051</td><td>14 ml 聚苯乙烯管</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96孔U型底板</td><td>35-3077</td><td>未经组织培养处理的96孔板</td></tr><tr><td>康宁</td><td>0.05% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA（1×）</td><td>25-052-CI</td><td>组织培养用胰蛋白酶EDTA储存液</td></tr><tr><td>康宁</td><td>DMEM（高糖，高丙酮酸）</td><td>15-013-CU</td><td>不含FBS、谷氨酰胺和抗生素的DMEM培养基</td></tr><tr><td>康宁</td><td>青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液</td><td>30-009-CI</td><td>用于组织培养的青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺储备液混合物</td></tr><tr><td>康宁</td><td>庆大霉素</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml 链霉素组织培养储备液</td></tr><tr><td>Cellgro（康宁）</td><td>L-谷氨酰胺</td><td>25005197</td><td>不含抗生素的L-谷氨酰胺储备液</td></tr><tr><td>丹维尔</td><td>75 cm² 培养瓶</td><td>T1225</td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养处理过的锥形瓶</td></tr><tr><td>丹维尔</td><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>2013004</td><td>1.5 ml 微量离心管</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 心肌成肌细胞</td><td>CRL-1446</td><td>大鼠心肌成肌细胞</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>胎牛血清</td><td>SH30070.63</td><td>胎牛血清</td></tr></tbody></table>

评估细菌在培养的心脏细胞中的侵袭能力及感染小鼠心脏定植情况的方法 单核细胞增生李斯特菌

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性兼性胞内病原体，可导致免疫功能低下者、老年人及孕妇发生严重的侵袭性感染。人类单核细胞增生李斯特菌病最常见的临床表现包括脑膜炎、脑炎以及胎儿流产。尽管相关报道较少，但侵袭性 L. monocytogenes 感染累及心脏仍是一个重要的继发性病变。即使接受治疗，由心脏受累引起的死亡率仍可高达35%，然而目前对 L. monocytogenes 在心肌组织中的定植及其所致病理变化知之甚少。此外，最近研究发现，L. monocytogenes 的某些亚群具有更强的能力侵入并在心肌组织中增殖。本实验方案详细描述了可用于评估 L. monocytogenes 分离株心肌趋向性（cardiotropism）的体外（in vitro）和体内（in vivo）方法。文中提供了在组织培养条件下感染H9c2大鼠心肌母细胞以及测定感染小鼠心脏中细菌定植情况的方法。这些方法不仅有助于识别在感染动物中心肌组织具有定植潜力的菌株，还可能促进发现促进细菌侵入心肌细胞和/或驱动心脏病理改变的细菌基因产物。此外，这些方法也支持对多种 L. monocytogenes 菌株之间心肌趋向性的直接比较。

L. monocytogenes 的部分分离株在细胞培养和小鼠感染模型中表现出对心肌细胞更强的侵袭能力。图1展示了将菌液点种于琼脂培养基后细菌菌落可能呈现的形态。该方法可在不使用大量琼脂平板的前提下，准确评估样品中的菌落形成单位（CFU）。图2展示了一项基于组织培养的实验示例，比较了菌株10403S与菌株07PF0776侵入心肌细胞的能力。经庆大霉素处理后，从感染07PF0776菌株的H9c2心肌细胞中回收的细菌CFU数量是感染10403S菌株组的两倍以上。使用该实验方法，通常可观察到嗜心性菌株的侵袭能力差异达2至4倍。图3展示了感染后第3天从小鼠肝脏、脾脏和心脏组织中回收细菌的示例。用嗜心性菌株07PF0776或菌株10403S感染小鼠后，从肝脏和脾脏中回收的细菌数量相近；然而，感染07PF0776菌株的小鼠更可能从心脏中检测到细菌，且该器官中的细菌载量更高。
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单核细胞增生李斯特菌 可导致孕妇胎儿感染以及易感人群的脑膜炎。某些细菌亚群可定植于心脏组织，引起患者及实验动物的心肌炎。本文介绍了一种用于评估的实验方案 单核细胞增生李斯特菌 心肌细胞侵袭 体外 感染动物心脏定植情况。

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性兼性胞内病原体，可在免疫功能低下个体中引起严重的侵袭性感染……

本实验的总体目标是利用体内和体外心脏定植及心肌细胞侵袭模型，提供评估微生物感染心肌细胞的高效方法。首先培养细菌，收集细菌细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤和重悬。随后，将生长在玻璃盖玻片上的心肌细胞单层暴露于细菌悬液中以建立感染，或将细菌悬液通过尾静脉注射接种至小鼠体内。然后将心肌细胞在含有庆大霉素的环境中孵育，以杀灭细胞外的细菌，随后进行细胞裂解以回收细菌。感染后的动物在感染后两到三天内监测其健康状况，随后处死并分离目标器官。最后，将细胞和器官悬液进行梯度稀释，并采用点种平板法进行接种，以测定与细胞或目标器官相关的活菌数量。最终，在增菌培养基上计数细菌菌落，以确定在组织培养中生长的细胞对心肌细胞侵袭的效率，或动物中心脏感染的效率与范围。尽管该方法可用于研究不同临床和环境分离的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）引起侵袭性心脏疾病的能力，但也适用于其他能够靶向心脏组织的微生物病原体；此外，该方案也可经修改后用于研究其他感兴趣的器官或组织。在进行侵袭实验的前一天，准备24孔板的H9c2细胞，并按照文本方案所述，用目标李斯特菌菌株接种无菌的BHI肉汤培养基。将待测菌株用 PBS 重悬后，取至少 20 微升 PBS 菌液加入 24 孔板的孔中。轻轻摇动孔板，使样品在各孔中均匀分布，并将孔板置于 37°C、95% 湿度和 5% 二氧化碳条件下孵育 45 分钟。孵育结束后，将孔板移回生物安全柜，使用带吸头的移液器吸除每孔中的液体。然后向每个孔中加入一毫升预热的 PBS，以洗涤盖玻片。最后，使用带抽吸功能的移液器将孔中的 PBS 吸出。接着，向每个孔中加入一毫升含有庆大霉素的 DMEM，该庆大霉素将仅杀死仍位于细胞外的细菌。将培养板放回培养箱，继续孵育1小时。随后在超净工作台内，用镊子将每个盖玻片从其孔中取出，放入预先准备好的含有1毫升无菌ddH₂O的14毫升离心管中。在更换盖玻片之间，将镊子浸入乙醇并灼烧，以防止污染。短暂涡旋振荡每支试管后，从每管中取出等份样品，转移至96孔板的孔中。随后将每个样品进行连续稀释，稀释倍数分别为10倍、100倍和1000倍。接着在预热的干燥LB平板上，将各稀释液点样至平板表面。待液滴完全干燥后，将平板置于37°C培养箱中过夜，次日早晨观察结果。计数每个点上的菌落数量，并利用该系列数据计算每种受试菌株每张盖玻片上的细菌数量，用于将单核细胞增生李斯特菌接种至小鼠体内。将一只动物放入固定装置中，以便在注射过程中固定动物。使用酒精棉片清洁注射部位并扩张尾静脉。然后使用1毫升注射器和27.5号针头，向小鼠尾静脉缓慢注射200微升所需培养物。注射后如有出血，可用纸巾按压止血，再将动物放入清洁的笼具中。根据生物安全柜下的文本操作规程，在动物处死后最多72小时内，将其固定在解剖板上，并用70%乙醇浸润动物体表。在腹部和胸部做Y

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用李斯特菌单细胞基因评估受感染小鼠培养和心脏殖民化中心脏细胞的细菌入侵

测量感染小鼠中的细菌载量和免疫反应 单核细胞增生李斯特菌

来源： McMullen, P. D., Freitag, N. E. 利用培养的心脏细胞评估细菌侵袭及感染小鼠心脏定植 单核细胞增生李斯特菌. 视频实验杂志 (2015)本视频演示了将单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

通过尾静脉注射后定量小鼠心脏中的细菌载量 单核细胞增生李斯特菌

本视频展示了一种在胎盘组织中建立感染模型以研究感染传播的方法。ex vivo 胎盘器官培养物被单核细胞增生性李斯特菌（Listeria...

一种在离体器官培养中建立细菌感染模型的技术

本视频展示了从感染并经灌流的小鼠脑组织中定量可培养细菌载量的方法 单核细胞增生李斯特菌.

评估小鼠大脑中细菌定植情况 单核细胞增生李斯特菌 感染

本文介绍了一种利用单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

通过摄入污染食物在小鼠中经口传播Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性细菌病原体，常被用作研究胞内寄生现象的主要模型。在小干扰RNA筛选背景下对晚期 L. monocytogenes...

成像 InlC 分泌以研究细菌病原体Listeria monocytogenes的细胞感染

可视化 肺炎链球菌 心脏微损伤及其后续心脏重塑

本方案描述了如何用单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）EGD 菌株感染 C57BL/6J 小鼠，以及在感染后通过自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤 T（NKT）细胞和适应性 T...

Listeria monocytogenes 实验感染作为研究宿主干扰素-γ反应的模型

一种用于肠出血性大肠杆菌感染的 小鼠模型的详细实验方案 E. coli 使用生物发光标记细菌来研究肠出血性大肠杆菌（EHEC）定植的方法被展示。通过非侵入性方式检测这些生物发光细菌 体内...

检测小鼠体内肠出血性Escherichia coli定植的非侵入性体内生物发光系统

Listeria monocytogenes 对大脑的感染

我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。...

利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

学习评估单核细胞增生李斯特菌对心脏细胞的体外和体内入侵方法。该方案利用小鼠模型和细胞培养技术，帮助研究人员深入了解细菌在心脏组织中的定植机制及致病性。

评估细菌在培养的心脏细胞中的侵袭能力及感染小鼠心脏定植情况的方法单核细胞增生李斯特菌

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