使用李斯特菌单细胞基因评估受感染小鼠培养和心脏殖民化中心脏细胞的细菌入侵
May 27th, 2015
李斯特菌单细胞基因 导致孕妇胎儿感染和易感人群脑膜炎。 细菌的亚种群可以殖民心脏组织，导致患者和实验室动物心肌炎。 在这里，我们提出了一个协议，描述了如何评估 L.单细胞基因 心脏细胞 入侵体外 和心脏殖民化感染动物。
该程序的总体目标是提供使用心脏定植和心肌细胞侵袭的体内和体外模型评估心肌细胞微生物感染的有效方法。这是通过首先培养细菌培养物并收集、洗涤和复苏，将细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中来实现的。接下来，在玻璃盖玻片上生长的单层心脏细胞被细菌悬浮液感染，或者使用尾静脉注射将细菌悬浮液接种到小鼠体内。
然后将心肌细胞在庆大霉素存在下孵育以杀死细胞外细菌，然后进行细胞裂解以恢复。在感染后 2 到 3 天监测细菌或受感染动物的健康状况，然后处死以分离靶器官。最后，使用点镀方法稀释和接种细胞和器官悬液，以确定与细胞或靶器官相关的活细菌的数量。
最终，在螺旋培养基上计数细菌菌落，以确定组织培养物中生长的细胞的心肌细胞侵袭效率或动物心脏感染的效率和程度。虽然这种方法可用于研究不同的临床和环境分离株单核细胞增生导致侵袭性心脏病的可能性。它也可以应用于能够靶向心脏组织的其他微生物病原体，或者可以修改方案以研究其他感兴趣的器官或组织 在进行侵袭测定前一天，准备 24 孔板的 H 九 C 两个细胞，并用所需的李斯特菌菌株接种无菌 BHI 肉汤，如文本方案中所述。
在 Resus 悬浮要在 PBS 中测试的细菌菌株后，将至少 20 微升 PBS 细菌溶液加载到 24 孔板的孔中。轻轻摇动板，使样品均匀分布在每个孔中，并在 37 摄氏度、95% 湿度和 5% 二氧化碳下孵育板 45 分钟。孵育后，返回生物安全柜，使用吸力移液管从每个孔中吸出培养基。
然后向每个孔中加入 1 毫升加热的 PBS 以清洗盖玻片。最后，使用带吸力的移液管从孔中吸出 PBS。接下来，向每个孔中加入 1 毫升含有庆大霉素的 DMEM，庆大霉素只会杀死那些留在细胞外的细菌。
将板放回培养箱中，再孵育一小时。然后在引擎盖下，用镊子从孔中取出每个盖玻片，并将其放入先前准备好的 14 毫升管中，该管含有 1 毫升无菌 ddh 2 o。将镊子浸入乙醇中，并在盖玻片之间燃烧以防止污染。
短暂涡旋每根试管后，从每根试管中取出一份等分试样，然后转移到 96 孔板的孔中。然后准备每个样品的连续稀释液，从 1 到 10 到 1000。然后在预热的干燥 lb 板上，斑点干燥后将每个稀释液点在螺旋钻上，第二天早上将板放入 37 摄氏度的培养箱中过夜。
计算每个点的菌落数，并使用该系列计算评估将 L 单核细胞增生接种到小鼠中的每种菌株的每个盖玻片的细菌数。将一只动物放入安全带中，以便在注射过程中约束动物。使用酒精垫清洁注射部位并扩张尾静脉。
然后用 1 毫升注射器和 27.5 号针头，轻轻地向小鼠的尾静脉注射 200 微升所需的培养物。在将动物放入新笼子之前，请使用纸巾止住注射可能引起的任何出血。在牺牲动物长达 72 小时后，根据生物安全柜下的文本协议，将动物固定在解剖块上，并使用 70% 乙醇使其饱和。
在腹部和胸部做一个 Y 形切口，从阴道口一直延伸到剑突，一直延伸到每只手臂的腋窝。拉回皮肤。从腿上取下针头并用它们固定。
打开解剖，轻轻切开腹膜，露出肠道、胃、肝脏和脾脏。切开肝脏顶部的肝静脉和冠状韧带，并去除肝脏下方连接到小肠第一段和背部肌肉组织的额外韧带。将肝脏放入 50 毫升试管中的 5 毫升无菌 DD H 2 O 中。
接下来，切掉脾脏的脉管系统和韧带并取出，然后将其放入含有 5 毫升 DDH 2 o 的单独管中。现在找到横膈膜并沿着胸腔轻轻切开，以便看到胸部穿过剑突和胸骨切开，直到颈部以打开胸部，露出心脏和肺。使用镊子轻轻抓住心脏的心尖并抬起它，以在主动脉和肺血管中产生张力。
然后切开血管以释放心脏并将其放入单独的水管中。准备匀浆器后，根据文本方案，将一个肝脏匀浆至少两分钟或直到器官的可见部分消失。使用镊子清除探头上的任何大碎屑。
一旦所有器官样品均质化，为肝脏和脾脏样品准备 1 到 10 到 10， 000 的连续稀释液，为心脏点板准备 1 到 10 到 1000 的连续稀释液，将稀释液放在预热的 LB 螺旋板上。未稀释的样品可以接种在单独的板上，以确保板干燥后器官得到充分感染，将板放入 37 摄氏度的培养箱中。使用 perfil 包裹 96 孔板的稀释样品，并在第二天放入零下 80 摄氏度的冰箱中。
计算菌落数并使用稀释度计算每个器官的细菌总数。此处显示的是基于组织培养的测定的实例，该分析比较了菌株 1 0 4 0 3 s 侵入心脏细胞的能力与菌株 0 7 PF 0 7 7 6 的两倍多 0 7 7 6。与感染 1 0 4 0 3 s 的细胞相比，庆大霉素处理后从感染的 H 9 C 两个心脏细胞中回收细菌 CFU。
该图显示了感染小鼠感染后三天肝脏、脾脏和心脏中细菌的恢复情况，感染了各株 0 7 PF 0 7 7 6 或菌株 1 0 4 0 3 s，导致从感染小鼠的肝脏和脾脏中回收的细菌数量相当。然而，感染 0 7 PF 0 7 7 6 的小鼠更有可能从心脏产生可检测数量的细菌，并在该程序之后在该器官中表现出更大的细菌负荷。其他方法（如基于荧光的显微镜和器官组织学）可用于回答其他问题，例如细菌细胞间扩散和组织单层的功效，或免疫细胞募集到感染部位的动力学。
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概述
本协议概述了在体外和体内评估单核细胞增生李斯特菌侵入心脏细胞的方法。它详细说明了细菌培养、心脏细胞感染和感染动物监测的过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 传染病学
- 心脏病学
背景
- 单核细胞增生李斯特菌被认为会导致人类严重感染。
- 它可能通过心脏组织定植导致心肌炎。
- 了解其侵入机制对开发治疗方法至关重要。
- 本研究集中于评估体外和体内模型。
研究目的
- 提供研究单核细胞增生李斯特菌心脏细胞侵入的协议。
- 评估受感染动物模型中的心脏定植。
- 提高对心脏组织微生物感染的理解。
使用的方法
- 培养细菌和制备细胞悬液。
- 用细菌悬液感染心脏细胞单层。
- 通过尾静脉注射将细菌接种到小鼠体内。
- 监测受感染的动物并分离目标器官进行分析。
主要结果
- 成功展示了心脏细胞的感染。
- 从受感染组织中分离出活细菌。
- 该方法允许有效监测感染的进展。
- 对单核细胞增生李斯特菌的致病性获得了洞见。
结论
- 该协议提供了研究心脏感染的可靠方法。
- 研究结果有助于理解单核细胞增生李斯特菌的行为。
- 未来的研究可以在这一方法基础上获得更多洞见。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of Listeria monocytogenes invasion in cardiac cells and heart tissue enables mechanistic de-risking of pathogen-host interactions relevant to infectious disease portfolios. This protocol supports early discovery and translational research by providing standardized, reproducible methods for comparing strain-specific cardiotropism and identifying bacterial determinants of tissue invasion. Such approaches inform target validation and risk-adjusted advancement decisions in anti-infective R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of L. monocytogenes strains for cardiac tissue invasion potential.
- Supports identification of bacterial gene products mediating cardiac cell entry and colonization.
- Facilitates mechanistic de-risking of host-pathogen interactions in disease-relevant systems.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vitro and in vivo models for cardiac infection studies.
- Delivers reproducible, quantitative colony-forming unit (CFU) readouts for assay standardization.
- Enables screening of multiple bacterial isolates for cardiotropism in parallel workflows.
- Supports downstream evaluation of anti-infective candidates in physiologically relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cardiac cell invasion data with in vivo heart colonization outcomes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted progression of candidate interventions targeting cardiac infection.
- Supports biomarker discovery for cardiac tissue infection when combined with additional analyses.
- Provides a platform for mechanistic studies of immune response and tissue pathology in infected models.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, screening, and translational research by enabling quantitative assessment of bacterial invasion from cell culture to animal models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on strain-specific invasion mechanisms and gene function in cardiac infection.
- Screening: Provides standardized, quantitative CFU outputs for comparing multiple isolates or interventions.
- Analytics: Enables statistical analysis of invasion efficiency and tissue colonization across experimental groups.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo infection outcomes, supporting preclinical decision-making.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other pathogens or tissue targets as supported by the protocol.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of cardiac infection.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible infection models for cross-study comparison.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate strains, targets, or interventions for cardiac infection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, tissue culture, and animal handling for protocol execution.
- Needs access to biosafety infrastructure, cell culture facilities, and animal research capabilities.
- Demands rigorous cross-team standardization of infection, sampling, and plating procedures.
- Adaptable to other pathogens or tissue types with protocol modifications as described.
- Dependent on quantitative CFU readouts and statistical analysis for robust interpretation.
