Name: 质谱途径研究蛋白质结构和相互作用的冻干粉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习固态氢氘交换质谱和光解标记质谱技术，用于分析冻干粉中蛋白质的高分辨率构象与相互作用。这些方法可揭示固态制剂中的结构完整性，为蛋白质配方设计提供关键信息。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM085293（项目负责人：E. M. Topp）以及普渡大学药学院提供的经费支持。

1. 样品制备与冻干
<ol>
	<li>将所需体积的肌红蛋白（Mb）储备液在适当的缓冲液中透析，并通过0.22 µm的无菌滤膜过滤。</li>
	<li>在适当的缓冲液中配制所需体积的辅料和光亮氨酸（L-2-氨基-4,4-叠氮戊酸；pLeu）储备液。将储备液通过0.22 µm的无菌滤膜过滤。</li>
	<li>使用蛋白质、辅料、pLeu和缓冲液的储备液，按照表1所示配制制剂。</li>
	<li>将样品通过0.22 µm的无菌滤膜过滤，以去除步骤1.3中形成的任何颗粒。将样品分别分装至2 ml玻璃小瓶中，每瓶0.2 ml。在ssPL-MS研究中为激活pLeu，需使用对紫外光（365 nm）透明的玻璃小瓶。</li>
	<li>将小瓶放入冻干机中，并设计合适的冻干程序以启动冻干过程。
	<ol>
		<li>此处，先在-40 °C下冷冻样品，然后在-35 °C和70 mTorr真空条件下进行12小时的初级干燥，再在25 °C下进行12小时的次级干燥。也可采用其他冻干程序或干燥方法（例如，喷雾干燥）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在封盖前，用氮气对含有冻干样品的小瓶进行回填。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">配方</td>
			<td colspan="5">冻干前的组成（mg/ml）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mb</td>
			<td>海藻糖</td>
			<td>山梨醇</td>
			<td>pLeu c</td>
			<td>钾、磷酸盐，pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MbT a</td>
			<td>1.7</td>
			<td>3.4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MbS a</td>
			<td>1.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.4</td>
			<td>-</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MbT + pLeu b</td>
			<td>1.7</td>
			<td>3.4</td>
			<td>-</td>
			<td>14.3 x 10-3 至 1.43</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MbS + pLeu b</td>
			<td>1.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.4</td>
			<td>14.3 x 10-3 至 1.43</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：冻干 Mb 制剂的组成。 a 用于 ssHDX-MS 研究的制剂。 b 用于 ssPL-MS 研究的制剂。 c L-2-氨基-4,4-叠氮戊酸或光交联亮氨酸（pLeu）。将 pLeu 以五种不同浓度（14.3 × 10-3 至 1.43 mg/mL），即相对于 Mb 的 1 倍、10 倍、20 倍、50 倍和 100 倍摩尔过量，分别与 MbT 和 MbS 制剂共冻干。
2. 完整蛋白质的ssHDX-MS
<ol>
	<li>在干燥器的下部隔室中，向预先放置的 200 ml D2O 中加入过量的 K2CO3（约 440 g）。将干燥器密封，于 5 °C 平衡至相对湿度（RH）稳定在约 43%。通过选择不同的饱和盐溶液，可获得其他感兴趣的 RH 值23,24。</li>
	<li>将未加盖的含有冻干蛋白的小瓶置于干燥器的上部隔室，以启动 ssHDX 反应。将干燥器密封，在 5 °C 下孵育，使氢氘交换发生（图 2A）。</li>
	<li>在不同时间点平行采集三份 ssHDX 样品。对于 Mb 制剂，在 1、2、4、8、16、32、56、92 和 144 小时共九个时间点采集样品。</li>
	<li>从干燥器中取出小瓶后立即加盖，并通过液氮速冻淬灭反应。将小瓶在 -80 °C 下保存，直至进行质谱分析。</li>
	<li>采用合适的高分辨液相色谱-质谱（LC-MS）方法分析样品。设计或购置合适的冷藏 LC 系统，以最大限度减少分析过程中的反向交换。使用此前报道的柱温控制系统和 LC-MS 方法25。 
	注意：由于酰胺质子交换速率依赖于 pH 和温度，蛋白中掺入的氘可与流动相中的氢发生交换（“反向交换”），导致信息丢失。尽管淬灭缓冲液和 HPLC 溶剂的酸性 pH（pH 2.5）可在很大程度上减少反向交换，但通过合适的柱温控制系统将温度降低（≤0 °C）可进一步防止蛋白发生反向交换。</li>
	<li>将样品环和蛋白捕获柱连接至自动控制脱盐和洗脱过程的阀门。通过向质谱仪注入 TOF 低浓度调谐混合物，在 m/z 范围 200-3,200 内校准质谱仪。完整蛋白分析无需使用固定化胃蛋白酶柱和分析柱。</li>
	<li>将冷藏系统的温度设为 ≤0 °C，并等待系统达到约 0 °C 的稳定工作温度。</li>
	<li>将样品从 -80 °C 快速转移至液氮中，用于质谱分析。使用镊子小心地从液氮中取出每个小瓶，并向小瓶中加入特定体积的冰浴淬灭缓冲液（含 0.2% 甲酸（FA）（pH 2.5）和 5% 甲醇的水溶液），重新溶解样品。</li>
	<li>使用控制软件设定合适的 HPLC 和质谱方法。对于 Mb 制剂，在蛋白捕获柱中以 5% 乙腈、95% 水和 0.1% 甲酸（FA）对含 20 pmol Mb 的样品脱盐 1.7 分钟，然后在 3.3 分钟内采用梯度洗脱至 80% 乙腈、20% 水和 0.1% FA。在 m/z 范围 200-3,200 内采集质谱数据。</li>
	<li>为确定完整蛋白的质量，使用步骤 2.9 的方法，在水溶液中采集未氘化蛋白样品（即 未经 ssHDX 处理的蛋白）的数据。</li>
	<li>使用数据分析软件对原始谱图进行去卷积，获得未氘化和氘化样品的质量。此处，设定 Mb 质量分析的质量范围为 15,000-18,000 Da，质量分辨率为 1.0 Da，峰高阈值为 90%。</li>
	<li>通过从每个交换时间点的氘化蛋白质量中减去未氘化蛋白质量，计算完整蛋白（此处为 Mb）中掺入的氘原子数。</li>
	<li>使用以下公式（公式 1）计算相对于理论最大值的氘摄取百分比 
	<img alt="氘摄取公式；公式显示蛋白酰胺分析中交换的氘原子百分比。" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"> 
	其中可交换酰胺总数 = 氨基酸总数 – 脯氨酸残基数 – 2（“2”用于校正快速发生反向交换的 N-末端氨基和酰胺氢）。</li>
	<li>使用合适的指数方程拟合 ssHDX 动力学数据。双指数方程（公式 2）通常是能够合理拟合 ssHDX 数据的最简模型。在本研究中，对 MbT 和 MbS 的数据采用双指数模型拟合，将氘分配至“快速”和“慢速”交换池。 
	<img alt="氘摄取公式；N_fast, N_slow, 指数项；动力学，蛋白分析。" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 2"> 
	其中 Nfast 和 Nslow 分别为“快速”和“慢速”交换池中可交换酰胺的数量，kfast 和 kslow 为与两个池相关的表观一级速率常数。</li>
</ol>
3. 肽段水平蛋白质的ssHDX-MS分析
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 至 2.8 进行 ssHDX 实验，但在步骤 2.6 中进行如下修改：将固定化胃蛋白酶柱和分析柱按照先前报道的方法连接至阀门25 将连接到阀门的蛋白捕获柱更换为肽段捕获柱。校准质谱仪，设定质荷比范围为100至1,700。 
	注意：在复溶步骤（步骤 2.8）中，可在淬灭缓冲液中加入还原剂和变性剂，以促进胃蛋白酶对含二硫键蛋白的消化例如单克隆抗体</li>
	<li>使用控制软件设置合适的高效液相色谱（HPLC）和质谱分析方法。对于肌红蛋白（Mb）制剂，将含有 20 pmol Mb 的样品在线用 0.1% 甲酸（FA）进行酶解，随后在肽段捕获柱中以 10% 乙腈、90% 水和 0.1% FA 溶液捕获并脱盐 1.7 分钟。在 4.0 分钟内通过梯度洗脱，将肽段以 60% 乙腈、40% 水和 0.1% FA 的流动相洗脱至分析柱。在 m/z 100−1,700 范围内采集质谱数据。</li>
	<li>通过未氘代蛋白质样品的串联质谱（MS/MS）分析鉴定胃蛋白酶消化片段。使用质谱分析软件，将肽段碎片离子的实验质量与自定义数据库中预测的肽段碎片质量进行比对。设定质量截断值（例如 10 ppm）以鉴定误差较低的质量。对于匹配的肽段，制备包含以下信息的列表：（i）肽段序列，（ii）电荷态，（iii）保留时间。</li>
	<li>使用第 3.3 步生成的列表，对每个胃蛋白酶消化片段进行作图，并确定每个片段中掺入的氘原子平均数。此过程可通过使用合适的氢氘交换质谱（HDX-MS）数据分析软件实现。24.</li>
	<li>为计算每个肽段的氘代摄取百分比并对ssHDX动力学数据进行拟合，请执行步骤2.13和2.14。在本研究中，MbT和MbS制剂中六个非冗余胃蛋白酶消化片段的HDX动力学数据均采用双指数关联模型进行拟合（公式2）。</li>
</ol>
4. 完整蛋白质的ssPL-MS分析
<ol>
	<li>启动光解标记反应时，首先打开紫外交联仪，使灯管预热 5 分钟。确保紫外光源配备波长为 365 nm 的灯管，以激活 pLeu 中的重氮杂环丙烷基团。 
	警告：当灯管开启时，切勿打开紫外交联仪的门。若光源未被防紫外线玻璃门封闭，须保护眼睛和皮肤免受紫外光照射。</li>
	<li>在打开门之前，先关闭紫外交联仪。灯管关闭后，取下含有冻干制剂的瓶盖，并将样品瓶放入紫外交联仪腔室内，如图 2B所示。用紫外光照射样品 40 分钟。</li>
	<li>通过执行步骤 4.1 至 4.3 进行对照实验，包括：(i) 未添加 pLeu 冻干的样品；(ii) 使用水重悬 pLeu 后冻干的样品。</li>
	<li>盖上瓶盖，将样品瓶在 -20 °C 下保存，直至进行质谱分析。</li>
	<li>通过加入适量质谱级去离子水重悬固体样品，使终浓度达到 2 µM。</li>
	<li>开始样品分析时，按照步骤 2.6 和 2.9 操作。 
	注意：由于共价标记不存在回交现象，ssPL-MS 无需使用特殊的冷藏液相色谱系统。</li>
	<li>为测定蛋白质的天然质量，按照步骤 2.9 对未经 ssPL 处理的蛋白质样品进行数据采集。通过步骤 2.11 所述方法对原始谱图进行去卷积，获得未标记和标记样品的质量。</li>
	<li>使用以下公式计算所掺入 pLeu 的数量： 
	<img alt="掺入 pLeu 数量的计算公式 \(M_L-M_N/115\)；用于蛋白质合成分析的方程。" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 3"> 
	其中 ML 为标记蛋白质的质量，MN 为天然蛋白质的质量，115 为单个 pLeu 掺入后向天然蛋白质增加的平均质量（Da）。需注意，标记反应过程中会失去 N2（28 Da）。pLeu 的单一同位素质量为 143.07。</li>
	<li>根据提取离子色谱图中的峰高，计算含有不同数量标记的蛋白质群体的百分比： 
	<img alt="百分比计算公式，%Lᵢ = (PHᵢ/(PHᵢ + PHᵤ)) × 100，公式表示。" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 4"> 
	其中“i”表示标记的数量，PHi 表示标记蛋白质 Li 的峰高，PHu 表示质谱检测到的未标记蛋白质的峰高。</li>
</ol>
5. 肽段水平的 ssPL-MS 蛋白质分析
<ol>
	<li>按照步骤 4.1 至 4.4 进行 ssPL 操作。</li>
	<li>对于肽段水平的分析，将固体样品重悬于碳酸氢铵缓冲液（100 mM，pH 8.0）中。</li>
	<li>复溶后，按蛋白质与胰蛋白酶10:1的摩尔比将标记的蛋白质溶液与胰蛋白酶混合，并在 60 °C 16 小时。</li>
	<li>通过向样品中加入水中的0.1% FA，使终浓度达到，从而终止反应 2 µM 蛋白</li>
	<li>将样品环、肽捕获柱和分析柱连接至与HPLC系统相连的阀门。</li>
	<li>使用控制软件设置合适的高效液相色谱（HPLC）和质谱方法。对于 Mb 制剂，将 20 pmol 消化后的蛋白质注入样品环中，用含 5% 乙腈、95% 水和 0.1% 甲酸的溶液对肽段进行脱盐处理 1.5 min，脱盐在肽段富集柱中完成；随后在分析柱中以梯度洗脱，22 min 内乙腈比例从 5% 升至 55%，水相从 95% 降至 45%，并持续含 0.1% 甲酸。在整个洗脱过程中采集质谱信号，质荷比（m/z）范围为 100–1,700。</li>
	<li>使用 ExPASy 等在线工具制备肽-pLeu 加合物的理论质谱列表26 结合先前从完整蛋白质分析中计算得到的 pLeu 数量，包含至少 4 个未发生切割的肽段。注意标记反应会伴随 N 端的丢失2因此，肽段-pLeu 加合物的质量 = 未标记胰蛋白酶肽段的质量 + n（pLeu 的质量）－ n（N 的质量）2），其中“n”表示掺入的pLeu数量。 
	注意：如果完整蛋白质的质谱分析显示出多达三种标记的蛋白质群体，则每条肽段最多可考虑三个可能的pLeu标记。对于分子量为1,000 Da的肽段，含有一个pLeu修饰的肽段-pLeu加合物的理论分子量为1,000 + 1(143) - 1(28) = 1,115 Da。类似地，含有两个pLeu和三个pLeu的肽段-pLeu加合物的理论分子量分别为 等等。 1,230 Da，1,345 Da 等等。分别。</li>
	<li>使用质谱分析软件将第5.7步生成的理论质量列表与实验观测到的质量进行匹配。设定一个质量截断点（例如，50 ppm）以鉴定低误差质量。</li>
	<li>对于匹配的肽段，使用步骤4.8下的公式（公式3）确定实际掺入的pLeu数量，其中ML 和 MN 分别为标记肽和天然肽的质量。</li>
</ol>

<ol><li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+Markets+and+Manufacturing+Technologies+for+Protein+Drugs%22">Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs</a>. , BCC Research. BIO021D(2013).</li>
<li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li>
<li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+some+practical+advice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li>
<li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li>
<li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li>
<li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+pharmaceutical+solids%3A+preparation%2C+characterization+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li>
<li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li>
<li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li>
<li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+%28NIR%29+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li>
<li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+state+chemistry+of+proteins%3A+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+%28hGH%29+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li>
<li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids%3A+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li>
<li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody%2Fmannitol+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H%2FD-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li>
<li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody%2C+on-line+proteolysis%2C+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid.+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li>
<li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li>
<li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li>
<li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li>
<li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+of+the+National+Bureau+of+Standards%22%5BJournal%5D)">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8(1977).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li>
<li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H%2FD+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li>
<li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+%28ssHDX-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li>
<li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li>
<li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839(2013).</li>
<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2FD+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics%3A+is+there+a+need+for+a+top-down+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li>
<li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

多项研究表明，冻干样品中的局部环境会影响蛋白质的降解5,29,30。然而，由于缺乏高分辨率的分析方法，建立蛋白质结构与固态稳定性之间的直接关系一直不可行。将现有的高分辨率方法（如氢氘交换和光交联）应用于冻干粉末时，需要对溶液中的实验方案进行修改，并谨慎解读数据。氢氘交换质谱（HDX-MS）和光交联质谱（PL-MS）已成功用于监测固态中蛋白质的构象。本文及其他研究27,28,31-33的结果表明，这些方法能够在固态环境中以高分辨率监测蛋白质构象。尽管数据分析中的关键步骤与溶液中标记方法并无差异34-36，但在实验设计和数据解读过程中，固态化学标记仍需特别注意若干重要因素。
标记试剂的选择必须基于其尺寸和标记机制。氘的尺寸较小，可轻松探及肽主链；而相对较大的pLeu则仅限于对侧链进行标记。ssHDX和ssPL均对任何氨基酸无偏好性，因此标记程度仅取决于主链和侧链在基质中的暴露程度。为了有效探测固态下蛋白质的构象，必须严格控制影响标记过程的外部因素。在冻干固体中，标记试剂的总量及其空间分布与水溶液中不同。
在ssHDX中，固体基质中D2O的含量可能影响蛋白质的去折叠（或部分去折叠）、再折叠以及氘交换速率。这与溶液HDX不同，后者通常将蛋白质样品用大量D2O稀释。通过仔细筛选水分含量对ssHDX速率的影响，有助于确定理想的相对湿度（RH）条件。为了控制水分吸附速率，并避免在含有吸湿性辅料（例如蔗糖和海藻糖）的制剂中粉末塌陷，ssHDX可在冷藏条件下（2–8 °C）进行。我们先前关于水分影响的研究表明，随着水分含量增加，交换速率和程度均有所提高，符合预期。在我们的多数研究中，5 °C下43%的中等相对湿度被证明可在合理时间内有效区分不同制剂24。反应通常持续至达到平台期，以确保水分吸附及向固体内部扩散不再限制HDX速率。使用较小的固体量（预冻干体积≤2 mL）也有助于确保在交换初期D2O蒸气吸附基本完成。尽管ssHDX-MS可提供有关固态蛋白质构象的定量信息，但在某些情况下，数据解释不能完全依赖ssHDX研究。例如，样品中观察到的氘摄取减少（相对于对照）可能源于蛋白质结构保持更完整，或样品中存在大量蛋白质聚集体。在此情况下，ssHDX数据的解释需结合其他互补方法的结果。在多种肌红蛋白（Mb）制剂中观察到氘代质谱峰展宽现象27,28。这可能由多种因素引起，如部分去折叠蛋白群体的存在、样品的空间异质性，或D2O浓度的空间梯度。然而，ssHDX-MS未能区分这些因素，仍需进一步研究。
由于ssPL-MS与其他方法相比相对较新，因此需要持续了解其应用范围和局限性。在ssPL中，光交联剂与蛋白质共冻干。缺乏水分限制了固体基质中各组分的流动性，而ssHDX中因水分吸附可能导致的部分结构松弛现象在ssPL中不会发生。这使得ssPL的标记局限于光交联剂附近的区域。然而，与HDX-MS不同的是，对共价标记蛋白质进行MS/MS分析可提供残基水平的结构信息。由于ssPL标记是共价且不可逆的，不会发生反向交换，因此样品可在无需担心标签丢失的情况下进行制备和分析。为了促进标记试剂在固态基质中的扩散并提高标记效率，ssPL可在逐渐增加相对湿度（% RH）的条件下进行。通过提高光反应性试剂的浓度也可改善pLeu的摄取。蛋白质与pLeu的摩尔比可根据需要进行调整。通常，pLeu相对于蛋白质使用100倍的摩尔过量即可确保充分的标记。然而，过高的pLeu浓度可能导致固体基质中蛋白质三级结构的破坏。因此，除了标记动力学和制剂组成外，pLeu浓度的选择还必须以维持蛋白质结构完整性为依据。由于pLeu非特异性地标记X-H基团（其中X = C、N、O），含有类似标记位点的辅料可能显著影响蛋白质的标记程度。目前尚未明确辅料对pLeu可用于蛋白质标记的干扰情况。已知由二氮杂环丙烯活化生成的卡宾并不具有残基特异性，但有研究报道其对Asp和Glu存在偏好性36。尽管了解残基特异性相互作用是有益的，但肽段水平的信息同样具有价值，可用于设计能够阻断固态下高暴露区域的辅料。ssPL-MS可提供详细的定性信息，但尚需获取定量数据，并建立可靠的分析指标，以比较多种冻干体系之间的制剂差异。
使用位点特异性标记物结合串联质谱分析可进一步将分辨率提升至氨基酸水平。例如，可使用2,3-丁二酮作为标记试剂对精氨酸（Arg）进行标记， N用于Lys的羟基琥珀酰亚胺衍生物 N-烷基马来酰亚胺衍生物可用于半胱氨酸，以精确绘制冻干粉末中的分子相互作用。然而，这些试剂对pH值依赖性强，其反应在固态下可能不如光解标记那样易于控制。另一种方法是利用营养缺陷型细胞系、位点特异性突变或侧链衍生化，将光交联剂整合到蛋白质序列中。
我们先前的ssHDX-MS和ssPL-MS研究已表明，蛋白质的标记程度取决于所用辅料的种类和用量24,27,28,31-33,37,38。肌红蛋白（Mb）与盐酸胍（Gdn.HCl）共冻干后的ssHDX-MS结果显示，其氘代摄取量高于与低分子量糖类共冻干的Mb32。在另一项独立的ssPL-MS研究中，与蔗糖共冻干的Mb相比，与Gdn.HCl共冻干的Mb对光解标记表现出更强的保护作用33。此外，ssHDX-MS获得的定量测量结果与蛋白质在长期储存过程中的稳定性高度相关28。这些研究表明，蛋白质的ssHDX或ssPL能够反映其在冻干粉末中结构保留的程度。我们认为，冻干粉末中二级结构的保留为侧链与pLeu的标记提供了有利环境，同时保护了酰胺氢免于发生氘交换。然而，未来仍需对这些方法所提供的信息内容进行更详细的比较。尽管要确立ssHDX-MS和ssPL-MS作为制剂筛选工具的实用性，最终还需将其应用于多种蛋白质，但我们近期的研究结果支持其更广泛的应用。随着进一步的发展，这些方法有望在生物制药行业中广泛用于固态蛋白质制剂的表征。

蛋白质药物是生物制药行业中发展最快的领域，为以往难以治疗的疾病（包括激素失调、癌症和自身免疫性疾病）提供了有前景的新疗法1。2012年，全球生物治疗药物市场达到1380亿美元，预计到2018年将达到1790亿美元2。与传统的小分子药物相比，蛋白质分子更大且更脆弱，因此更容易发生多种类型的降解3。为了确保足够的保质期和稳定性，蛋白质药物通常被配制成冻干（i.e.，冷冻干燥）的固体粉末。然而，蛋白质在固态下仍可能发生降解，特别是如果其天然结构在冻干过程中未能得以保持4,5。只有在具备足够分辨率、可用于探测固态蛋白质构象的分析方法时，才能切实验证其结构是否得以保留。
核磁共振波谱法6和X射线晶体学7是常用于在溶液和结晶固体中评估蛋白质结构的高分辨率方法8。由于辅料的性质及所用加工方法的影响，冻干蛋白制剂通常为非晶态而非晶态9。缺乏均一性和微观有序性使得上述技术在分析非晶态固体中蛋白质时难以适用。傅里叶变换红外光谱（FTIR）10、拉曼光谱11和近红外光谱（NIR）12已被生物制药行业广泛用于比较冻干粉末中蛋白质的二级结构与其天然溶液状态结构。然而，这些方法分辨率较低，仅能提供有关二级结构整体变化的信息。利用FTIR进行的固态结构表征与长期储存稳定性之间的相关性显示较弱13,14或较差15。这些局限性凸显了建立适用于检测固态蛋白质结构扰动的高分辨率方法的必要性。
化学标记结合蛋白酶解和质谱分析已成为监测水溶液中蛋白质结构和分子相互作用的有力方法。在药物研发中，氢氘交换质谱（HDX-MS）已被用于抗原-抗体相互作用中的表位定位16,17，受体-药物相互作用的定位18，监测翻译后修饰对蛋白质药物构象的影响19，以及在生物类似药开发中比较批次间的差异20。类似地，光激活配体已被用于鉴定药物靶点，并确定药物-受体相互作用的结合亲和力和特异性21,22。为了将这些方法的应用扩展到冻干制剂，本课题组开发了固相氢氘交换质谱（ssHDX-MS）和固相光解标记质谱（ssPL-MS），以高分辨率研究冻干样品中的蛋白质构象及辅料相互作用。
在固相氢氘交换质谱法（ssHDX-MS）和固相光标记质谱法（ssPL-MS）中，蛋白质在冻干固体中于理想反应条件下进行标记，随后将样品重新溶解，并通过质谱分析，可选择是否进行蛋白酶消化。ssHDX-MS 提供有关蛋白质主链对氘蒸气暴露程度的信息，而 ssPL-MS 则提供有关侧链微环境的信息（图1）。因此，这两种方法可为固态下蛋白质构象提供互补的信息。本文以肌红蛋白（Mb）为模型蛋白，提供了利用 ssHDX-MS 和 ssPL-MS 研究冻干固体中蛋白质的一般实验方案（图2）。我们展示了这两种方法区分含有两种不同辅料配方之间差异的能力。
<img alt="蛋白质折叠示意图展示了在氘代水中发生的氘代和紫外标记过程。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：ssHDX 和 ssPL 通过不同的标记机制测定冻干固体中蛋白质的结构。（A）在氢-氘交换（HDX）过程中，蛋白质骨架酰胺氢根据蛋白质结构和 D2O 的可及性与氘发生交换。在固态下，氘交换的速率和程度取决于 D2O 的吸附水平、蛋白质的流动性（去折叠和再折叠事件）以及固体基质中赋形剂的性质。（B）在光标记（PL）过程中，365 nm 的紫外照射会引发 pLeu 中的二氮杂环丙烷功能基团生成高活性的卡宾中间体，该中间体可非特异性地插入任意 X-H 键（X = 任一原子），或加成到邻近的 C=C 双键上。在固态下，标记的速率和程度取决于标记试剂的局部浓度、照射时间、蛋白质结构以及固体基质中赋形剂的性质。图 A 和图 B 分别展示了蛋白质骨架和侧链上可能发生的最大理论标记程度。
<img alt="固态HDX与光解标记示意图；冻干蛋白质，质谱分析。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：冻干制剂中蛋白质的固态氢氘交换质谱（A）与光解标记质谱（B）示意图。

<table><tbody><tr><td>马肌红蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0630-5G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-海藻糖二水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T9531</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#240850</td><td></td></tr><tr><td>L-光-亮氨酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>#22610</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P0662</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3786</td><td></td></tr><tr><td>氧化氘</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>#DLM-4-PK</td><td>替代产品（货号：151882，Sigma-Aldrich）</td></tr><tr><td>固定化胃蛋白酶</td><td>Applied Biosystems</td><td>#2-3132-00</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>#V511A</td><td>也可额外使用糜蛋白酶（货号：#V1062，Promega）</td></tr><tr><td>水，Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>#7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#34998</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28905</td><td></td></tr><tr><td>ESI-TOF 校准液</td><td>Agilent Technologies</td><td>#G1969-85000</td><td>高度易燃液体</td></tr><tr><td>蛋白质微捕获柱</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25108/03</td><td></td></tr><tr><td>肽段微捕获柱</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25109/02</td><td></td></tr><tr><td>分析柱</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>VirTis AdVantage Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备五个 365 nm 灯的交联仪</td><td>Stratagene Corp.</td><td>Stratalinker 2400</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪（HPLC）</td><td>Agilent Technologies</td><td>1200 系列 LC</td><td>用于氢氘交换质谱（HDX-MS）的冷藏液相系统</td></tr><tr><td>电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱仪（ESI-qTOF MS）</td><td>Agilent Technologies</td><td>6520 qTOF</td><td></td></tr><tr><td>HDExaminer（HDX-MS 数据分析软件）</td><td>Sierra Analytics</td><td></td><td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td></tr></tbody></table>

质谱技术在冻干粉末中研究蛋白质结构与相互作用的应用

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

酰胺氢/氘交换（ssHDX-MS）和侧链光解标记（ssPL-MS）结合质谱分析，可用于表征蛋白治疗药物的冻干制剂，具有重要价值。在进行标记后，再辅以适当的蛋白酶消化，可实现对蛋白质结构和相互作用的肽段水平定位。由于蛋白质的结构单元由氨基酸主链和侧链形成的化学键网络所稳定，因此对氨基酸残基中特定原子的标记可提供有关蛋白质结构与构象的信息。与常规用于研究冻干固态蛋白的方法（例如，FTIR）相比，ssHDX-MS 和 ssPL-MS 能提供定量且位点特异性的信息。氘掺入程度及动力学参数可关联到快速和慢速交换的酰胺池（Nfast，Nslow），并直接反映冻干制剂中蛋白质折叠和结构的程度。稳定的光解标记不会发生反向交换，这是相较于 ssHDX-MS 的一项优势。本文中，我们以肌红蛋白（Mb）为模型蛋白，针对含有海藻糖或山梨醇的冻干制剂，详细描述了 ssHDX-MS 和 ssPL-MS 两种方法的实验方案。

本研究采用ssHDX-MS和ssPL-MS方法，考察了辅料对冻干肌红蛋白制剂构象及固态相互作用的影响。表1列出了本研究中使用的蛋白质和辅料的浓度。文中展示了按照上述方案制备的冻干肌红蛋白经ssHDX-MS和ssPL-MS分析所得的代表性结果。
完整蛋白质水平的氘掺入
ssHDX-MS 能够在完整蛋白水平上区分 Mb 的不同制剂。经 144 小时 ssHDX 后，MbS 制剂的完整 Mb 解卷积质谱显示其氘代摄取量高于 MbT 制剂（图 3A）。平均而言，MbS 的氘代摄取量比 MbT 高 46%（表 2）。
<img alt="质谱数据；去卷积质量分析，氘代摄取随时间变化曲线。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：完整 Mb 的固相氢氘交换质谱（ssHDX-MS）：(A) 经 144 小时 ssHDX 后，MbT（实线）和 MbS（虚线）两种制剂中氘代完整 Mb 的去卷积质谱图。未氘代完整 Mb 的去卷积质谱图也一并展示（点线）。(B) 完整 Mb 在 MbT（实线）和 MbS（虚线）制剂中的 ssHDX 动力学。ssHDX 的时间进程采用 Graph Pad Prism 软件 5 版本拟合为双相指数关联方程（n = 3，± 标准差）。
在早期时间点（1–4 小时），完整 MbS 和 MbT 的氘代动力学相似，但随着孵育时间延长（8–144 小时），MbS 显示出更高的氘交换水平（图 3B）。这表明在较低相对湿度和温度条件下进行固态氢氘交换（ssHDX）时，选择较长的孵育时间点尤为重要。此外，D2O 的吸附与扩散过程可能影响早期时间点的 ssHDX 速率。我们先前的研究表明，ssHDX 中的水分吸附在数小时内即可完成，此后对交换动力学的贡献极小。因此，所观察到的交换速率和程度并不仅仅反映 D2O 吸附过程27,28。图 3B 中较小的误差棒（表示三次独立 ssHDX-MS 样品的标准偏差）表明该实验具有高度可重复性。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>氘吸收率 (%) b</td>
			<td>Nfast c</td>
			<td>kfast c</td>
			<td>Nslow c</td>
			<td>kslow c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MbT a</td>
			<td>15.9 ± 0.5</td>
			<td>13.1 (0.8)</td>
			<td>0.43 (0.03)</td>
			<td>11.0 (0.9)</td>
			<td>0.019 (0.001)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MbS a</td>
			<td>23.2 ± 0.5</td>
			<td>15.4 (0.7)</td>
			<td>0.49 (0.04)</td>
			<td>19.2 (0.6)</td>
			<td>0.024 (0.002)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 变化 d</td>
			<td>46%</td>
			<td>18%</td>
			<td>14%</td>
			<td>75%</td>
			<td>26%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：Mb制剂在ssHDX研究中氘摄取量的定量测量。 a 组成成分见表1。 b 在5 °C、43%相对湿度条件下进行144小时HDX后，完整Mb相对于理论最大值的氘摄取百分比（n = 3，均值 ± 标准差）。 c 通过非线性回归拟合ssHDX-MS动力学数据确定的参数。完整Mb的氘交换过程按双指数关联模型（公式2）进行拟合。括号中的数值为回归参数的标准误差。 d 测量值的变化百分比计算公式为：100 × [(MbS的数值 – MbT的数值) / (MbT的数值)]。
MbT 和 MbS 的氘吸收动力学回归参数（Nfast、Nslow、kfast 和 kslow）见表 2。尽管 MbS 的 Nfast 和 Nslow 值均大于 MbT，但 Nslow 值的差异大于 Nfast 值的差异。具体而言，MbS 的 Nfast 值比 MbT 高 18%，而 Nslow 值则高出 75%。这表明 MbT 中较小的 Nslow 值可能是由于 Mb 结构的更高保留程度，或在 MbS 中暴露于 D2O 的辅料对酰胺基团提供了保护作用。然而，其详细机制尚不明确。两种制剂的速率常数（kfast 和 kslow）非常相似。
肽段水平的氘吸收
胃蛋白酶消化后，共鉴定出52个肽段。本研究分析中使用了6个非冗余片段，对应肌红蛋白（Mb）序列的100%。通过使用重叠片段，可获得更多信息，此前本课题组已对此有所报道24。计算了每个肽段的氘代摄取百分比，并绘制了144小时样品的结果（图4A）。这6个胃蛋白消化片段的氢氘交换（HDX）动力学呈双指数行为（图4B），表明酰胺氢存在发生“快速”和“慢速”交换的亚群。
<img alt="氘吸收分析，Mb 胃蛋白酶片段；图表，时间依赖性吸收，研究动力学。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：Mb 在肽段水平的 ssHDX-MS 分析：(A) Mb 在 MbT（灰色）和 MbS（白色）制剂中，经过 144 小时氢氘交换后，6 个非冗余胃蛋白酶片段的氘吸收百分比。（B）Mb 在 MbT（实线）和 MbS（虚线）制剂中 6 个非冗余胃蛋白酶片段的 ssHDX 动力学。ssHDX 的时间过程使用 Graph Pad Prism 软件 5 版本拟合为双相指数关联方程（n = 3，± 标准差）。
非冗余肽段的回归参数如图5所示。由于拟合得到的肽段片段速率常数并非各个酰胺键速率常数的平均值，因此胃蛋白酶解片段的观测速率常数无法与完整蛋白的速率常数呈线性关联。在MbS制剂中，大多数胃蛋白酶解片段（除片段56-69外）的Nfast值略高于MbT制剂中的对应值（图5A）。类似地，kfast值在不同制剂之间以及肌红蛋白（Mb）分子的不同区域之间总体差异较小（图5B）。然而，MbS制剂中所有片段的Nslow和kslow值均显著高于MbT制剂（图5C和图5D）。MbS制剂中Nslow和kslow的显著升高可能反映了“慢”交换池中酰胺基团具有更高的流动性。
<img alt="肌红蛋白肽段动力学比较图；Nfast、Kfast、Nslow、Kslow 数据分析结果。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：Mb 肽段的ssHDX动力学参数：Nfast (A)、kfast (B)、Nslow (C) 和 kslow (D) 值，由 Mb 在 MbT（灰色）和 MbS（白色）制剂中六个非冗余胃蛋白酶肽段的ssHDX-MS动力学数据经非线性回归分析获得（n = 3，± 标准误差）。
完整蛋白质水平的光解标记
在存在20倍过量pLeu的情况下，Mb经辐照后形成了多种Mb-pLeu加合物，通过LC-MS检测证实（图6A）。对MbT在20倍pLeu存在下辐照40分钟后的去卷积质谱显示，最多出现3个标记峰，其质量较未标记的Mb分别增加了+115、+230和+345 Da。在相同条件下以20倍pLeu辐照MbS，在完整蛋白水平上观察到的pLeu结合较少，LC-MS检测到最多两个标记产物峰。
<img alt="去卷积质谱分析及标记百分比与辐照时间的关系，[pLeu]。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6：完整肌红蛋白的ssPL-MS分析：（A）使用20倍过量（5% w/w）pLeu标记的MbT（实线）和MbS（虚线）的去卷积质谱图。天然Mb（冻干并在无pLeu条件下辐照）的去卷积质谱图以点线表示。U表示辐照后仍保持未标记状态的蛋白质群体。携带1、2和3个pLeu标记的蛋白质群体分别表示为1L、2L和3L。（B）在不同pLeu浓度下，MbT（实心圆）和MbS（空心圆）制剂中完整Mb的ssPL-MS动力学。所有样品均辐照40分钟。误差棒位于符号内部。（C）在含100倍过量pLeu（20.7% w/w）条件下冻干并辐照的MbT（实心圆）和MbS（空心圆）制剂中，完整Mb的ssPL-MS动力学随辐照时间的变化。误差棒位于符号内部。
在动力学研究中，随着照射时间的延长，MbT 和 MbS 的标记蛋白百分比均呈指数增长（图 6B）。在每个照射时间点，MbS 的 pLeu 摄取量均低于 MbT。两种制剂似乎均在 40 分钟时达到平台期。因此，动力学研究可用于确定实现 pLeu 完全活化所需的照射时间。还研究了标记动力学与 pLeu 浓度的关系（图 6C）。对于 MbT 和 MbS，标记蛋白百分比均随 pLeu 浓度的增加而升高。然而，在 pLeu 浓度为 20.7% w/w 时，MbT 的 pLeu 摄取量下降。这可能是由于高浓度 pLeu 导致其被排斥在蛋白表面之外所致。因此，应开展不同 pLeu 浓度的研究，以选择合适的 pLeu 浓度，从而在蛋白表面实现充分标记的同时避免表面排斥现象。本研究中，选择 20 倍过量的 pLeu 用于后续的肽段水平研究。
MbS标记减少的总体现象表明其侧链对含有pLeu的基质可及性较差。这与在山梨醇存在下发生构象变化导致标记减少的结果一致。
肽水平的光解标记
根据完整蛋白质标记研究，选择20倍过量的pLeu，以在肽段水平上比较MbT和MbS。标记后的样品经胰蛋白酶消化后进行LC-MS分析。在MbT和MbS样品中均检测到共40个肽段，覆盖Mb序列的100%。在某些情况下，若赖氨酸和/或精氨酸残基被大量标记，胰蛋白酶消化可能导致蛋白质序列覆盖度受限。为提高序列覆盖度，可使用胰蛋白酶与糜蛋白酶的混合物对标记蛋白进行消化。
<img alt="显示螺旋区域的蛋白质结构图；标记的片段为32-42、134-139、146-153。" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7：肌红蛋白（Mb）在肽段水平的ssPL-MS分析：在海藻糖（A）和山梨醇（B）存在下，使用20倍过量的pLeu（5% w/w）标记Mb的示意图。标记后的蛋白质经胰蛋白酶消化，将鉴定到的标记肽段映射至Mb的晶体结构（PDB编号1WLA）。标记区域和未标记区域分别以洋红色和绿色表示。
使用胰蛋白酶消化的ssPL-MS可提供有关被标记肽段的定性信息。由于在完整蛋白水平上存在不同的标记群体、pLeu标记的广泛性机制以及标记与未标记肽段之间电离效率的差异，因此在消化后难以获得ssPL-MS的定量数据。然而，这些定性信息仍可揭示蛋白质在肽段水平上的构象变化。本研究中，MbT和MbS两种制剂均显示出在整个蛋白质表面大部分区域存在pLeu摄取。与MbS相比，MbT中的肽段片段32-42、134-139和146-153显示出pLeu标记（图7）。这表明这些氨基酸的侧链暴露于pLeu，因为这些区域的螺旋结构在MbT基质中保持完整。相比之下，MbS基质中这些区域对pLeu标记的保护作用则与这些区域的结构扰动一致。
总体而言，ssHDX-MS 和 ssPL-MS 的结果表明，这些方法可提供关于冻干蛋白制剂中骨架（ssHDX-MS）和侧链（ssPL-MS）暴露情况以及赋形剂效应的互补性高分辨率肽段水平信息。

本文介绍了针对固态粉末中蛋白质的固态酰胺氢/氘交换质谱法（ssHDX-MS）和固态光解标记质谱法（ssPL-MS）的详细实验方案。这些方法可提供非晶态固态中蛋白质构象及其相互作用的高分辨率信息，可能对制剂设计具有重要意义。

酰胺氢/氘交换（ssHDX-MS）和侧链光解标记（ssPL-MS）结合质谱分析可为……

本实验的总体目标是利用氢氘交换结合侧链裂解标记与质谱技术，以高分辨率监测蛋白质的结构。该目标首先通过在不同辅料存在下对蛋白质进行冻干实现。在固态氢氘交换过程中，将冻干后的蛋白质置于密封的干燥器中，在受控的相对湿度和温度条件下暴露于重水蒸气中。对于裂解标记，将蛋白质与赋形剂和光反应试剂共同冻干。然后用紫外光照射小瓶，使试剂共价结合到蛋白质上。对于每种方法，均将样品重新溶解，并在完整蛋白质和肽段水平上通过质谱仪进行分析。这两种方法可提供互补的信息。对于蛋白质结构高度保留的制剂，其氘代水平降低而裂解标记增强；而对于结构发生扰动的制剂，则表现出氘代水平升高而裂解标记减弱。化学标记技术，如氢氘交换与光交联结合质谱分析，近年来已被应用于研究蛋白质在活体支持材料中的结构与相互作用。与现有的圆二色谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FDIR）等方法相比，这些技术的主要优势在于能够在固态下以高分辨率探测蛋白质的结构及其所处环境。首先，将200毫升重水（D₂O）加入干燥器的下层室中，并加入400克碳酸钾，以制备饱和溶液。将陶瓷干燥板放入干燥器内，密封干燥器使其保持气密状态。在5°C条件下静置平衡，使其达到接近43%的稳定相对湿度。随后，将装有冻干蛋白质且未加盖的样品管置于干燥器的上层室中，密封干燥器，并在5°C下孵育。为启动氢氘交换反应以采集样品，需在将小瓶从干燥器中取出后立即盖紧瓶盖，随后通过液氮快速冷冻小瓶以淬灭反应。将小瓶保存在负80摄氏度条件下，直至进行质谱分析。采用高分辨率质谱分析样品，以最大限度减少反向交换。 液相色谱系统在冷藏箱内的配置是怎样的？首先安装仪器，将样品环和蛋白质捕获柱连接至控制脱盐和洗脱过程的阀门。接着，通过将低浓度调谐混合液注入质谱仪，并将质荷比范围设定为200至3,200，对系统进行校准。然后将冷藏系统冷却至约零摄氏度的稳定工作温度。配制含有0.2%甲酸和5%甲醇的水溶液淬灭缓冲液，并将其置于冰上预冷。将样品转移至液氮后，小心取出一个样品瓶，加入两毫升淬灭缓冲液以重新溶解样品。接下来加载适当的高效液相色谱和质谱方法。为分析此处的样品，在蛋白质捕获柱中用5%乙腈和0.1%甲酸对20皮摩尔的肌红蛋白进行1.7分钟的脱盐处理。然后在3.3分钟的梯度中洗脱蛋白质，乙腈比例逐渐增加至80%，并含0.1%甲酸。注入样品，并在 200 至 3,200 质荷比范围内采集质谱。为确定完整蛋白质的质量作为参考，使用相同方法分析一个未经修饰的蛋白质样品。通过数据处理软件对原始谱图进行去卷积，获得蛋白质质量。对于肌红蛋白样品分析，设置质量范围为 15 至 18 千道尔顿，质量分辨率设为 1 道尔顿，峰宽阈值设为 90%。对于肽段分析，采用与完整蛋白质相同的方案制备样品。当样品准备就绪可进行分析时，将固定的肽柱和分析柱连接至阀门，并将蛋白捕获柱更换为肽段捕获柱。系统的肽段校准操作与完整蛋白质的校准类似，但需将质荷比范围设置为100至1700，随后将制冷系统冷却至约0摄氏度的稳定工作温度。系统校准完成后，设定相应的高效液相色谱（HPLC）和质谱分析方法。将20皮摩尔的肌红蛋白在Pepin柱上用含0.1%甲酸的水溶液进行消化，设定方法程序：使用含10%乙腈和0.1%甲酸的溶液将肽段富集并脱盐至肽捕获柱中，持续1.7分钟；随后在4分钟内采用梯度洗脱，乙腈浓度逐步升至60%，同时保持0.1%甲酸浓度，以洗脱肽段。接下来，进样并采集质荷比范围为100至1700的质谱数据。利用串联质谱分析未标记的肽段样品，以鉴定肽片段。然后将实验测定的片段与软件生成的预测质量进行比对。接下来，将质量截断值设为10 ppm，以排除匹配肽段中误差较大的质量值。记录肽段序列的电荷态及其保留时间。利用编译后的肽段数据，通过数据分析软件计算每个胃蛋白酶片段所结合的氘原子平均数量。首先，按照文本方案中的指示，将含有辅料和亮氨酸的蛋白质进行冻干。样品制备完成后，打开装有365纳米紫外灯的紫外交联仪，并让紫外灯预热五分钟。待光源预热完成后，关闭灯源，将装有配方的未加盖小瓶放入交联仪腔室内。用紫外光照射样品40分钟，并设置不含光反应性亮氨酸的样品作为对照。照射结束后，盖上瓶盖，将小瓶于-20摄氏度保存，直至进行质谱分析。通过加入质谱级蒸馏水，使蛋白终浓度达到2微摩尔，以制备用于分析的样品。接下来，使用与完整氘代蛋白质相同的质谱方法分析样品，但不要使用带制冷功能的液相系统。采集未标记蛋白质样品的质谱数据，以确定该蛋白质的天然分子量。对肽段水平分析的数据进行处理，方法与 DERATED 样品相同。首先，对完整蛋白质进行固态光解标记，并在负20摄氏度下保存。接着，用100毫摩尔每升的碳酸氢铵缓冲液重悬样品，使最终蛋白质浓度达到10微摩尔每升。将样品与胰蛋白酶按蛋白质与胰蛋白酶10:1的摩尔比混合，并在60摄氏度下孵育16小时。在此期间，将样品环、肽捕获柱和分析柱连接至高效液相色谱系统阀门。蛋白质消化完成后，加入含0.1%甲酸的水溶液终止反应，使最终蛋白质浓度达到2微摩尔。接下来，使用高效液相色谱（HPLC）和质谱方法对系统进行编程。在此步骤中，将20皮摩尔经消化的肌红蛋白注入肽捕获柱，并用含5%乙腈和0.1%甲酸的溶液脱盐1.5分钟，随后在22分钟内将乙腈浓度梯度升至55%以洗脱肽段，同时在质荷比100至1700范围内采集质谱数据。使用在线工具计算肽段的理论质量。将光反应性亮氨酸加合物与之前从完整蛋白质分析中获得的光反应性亮氨酸数量进行比对。包含至少四个未完全切割的肽段。在 Excel 中创建肽段-光反应性亮氨酸加合物的质谱峰列表。接下来，通过设定一个截断点来匹配理论质量列表与实验观测到的质量，以鉴定误差较小的质量峰。在氢氘交换过程中，蛋白质的去折叠使其氢原子被氘原子取代，而保持结构稳定的蛋白质则不易发生氘交换。当对含有塔罗糖和含有山梨醇的肌红蛋白制剂进行固态氢氘交换质谱分析时，含有山梨醇的制剂显示出高出46%的氘摄取量，表明在冻干过程中，山梨醇中的肌红蛋白结构受到更大程度的扰动。光敏亮氨酸可与可接触的氨基酸侧链发生交联。对含山梨醇和TLOs的肌红蛋白制剂进行固态光解质谱分析，结果显示TLOs制剂中的光敏亮氨酸结合量高于对照制剂，表明在TLOs制剂中氨基酸侧链仍保持可接触性。氢氘交换和裂解标记均利用市售试剂和 readily available 质谱仪器，用于表征任意处方中固态蛋白质。从样品制备到完成数据分析的总时间记录少于两周。观看本视频后，您应能充分理解如何获取有关蛋白质结构的高分辨率信息，以及其在设计稳定冻干蛋白制剂中的重要性。

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

质谱途径研究蛋白质结构和相互作用的冻干粉

质谱技术已被证明是分析大型蛋白质复合物的有力工具。该方法能够揭示多亚基复合物的组成、化学计量比和整体结构。本文将逐步介绍如何进行结构质谱分析，并表征大分子结构。...

通过结构质谱分析大型蛋白质复合物

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

蛋白质复合物的结构对其功能至关重要。结合多种质谱技术已被证明是研究其组装过程的有力手段。本文提供了化学交联和天然质谱的技术方案，并展示了这两种互补技术如何帮助阐明多亚基蛋白质复合物的结构架构。...

结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

质谱法（MS）已成为研究大分子组装体结构与动态的重要工具。本文整合了基于质谱的方法，用于探究蛋白质复合物的形成及配体结合。...

通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

本文介绍了如何利用小角X射线散射（SAXS）获取代表大分子结构的低分辨率分子包络信息。当SAXS与X射线晶体学和核磁共振等高分辨率结构技术结合使用时，可提供溶液中多结构域蛋白及大分子复合物的详细结构信息。...

利用小角X射线散射研究溶液中大分子的结构

兰肽合成酶在肽类天然产物的生物合成过程中催化多步反应。本文介绍了一种连续的自下而上的氢氘交换质谱（HDX-MS）工作流程，可用于研究兰肽合成酶以及其他参与肽类天然产物生物合成的类似酶的构象动态。...

一种用于研究肽类生物合成酶的氢-氘交换质谱（HDX-MS）平台

本文描述了基于焦碳酸二乙酯的共价标记实验步骤，并结合质谱检测方法。焦碳酸二乙酯可直接与目标蛋白质或蛋白质复合物混合，从而修饰溶剂可及的氨基酸残基。经过蛋白酶消化及液相色谱-质谱分析后，即可鉴定出被修饰的残基。...

通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。...

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

学习固态氢氘交换质谱和光解标记质谱技术，用于分析冻干粉中蛋白质的高分辨率构象与相互作用。这些方法可揭示固态制剂中的结构完整性，为蛋白质配方设计提供关键信息。

质谱技术在冻干粉末中研究蛋白质结构与相互作用的应用

探索更多视频