质谱技术在冻干粉末中研究蛋白质结构与相互作用的应用

本实验的总体目标是利用氢氘交换结合侧链裂解标记与质谱技术，以高分辨率监测蛋白质的结构。该目标首先通过在不同辅料存在下对蛋白质进行冷冻干燥来实现。在固态氢氘交换过程中，将冷冻干燥后的蛋白质置于密封的干燥器中，在受控的相对湿度和温度条件下暴露于重水（D₂O）蒸气。

对于裂解标记，将蛋白质与赋形剂和光反应试剂共同冻干。然后用紫外光照射小瓶，使试剂共价结合到蛋白质上。对于每种方法，均将样品重新溶解，并利用质谱仪在完整蛋白质和肽段水平上进行分析。

这两种方法可提供互补的信息。对于蛋白质结构高度保留的制剂，其氘代摄取减少而裂解标记增加；而对于结构发生扰动的制剂，则表现出氘代摄取增加而裂解标记减少。化学标记技术，如氢氘交换与光交联结合质谱分析，近年来已被应用于研究蛋白质在活体支持物中的结构与相互作用。

与现有的圆二色谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FDIR）等方法相比，这些技术的主要优势在于能够在固态下以高分辨率探测蛋白质的结构及其环境。首先，将200毫升重水（D₂O）加入干燥器的下层室中，并加入400克碳酸钾，配制饱和溶液。将陶瓷干燥板放入干燥器内，密封干燥器使其完全密闭。在5°C条件下平衡，以达到接近43%的稳定相对湿度。随后，将装有冻干蛋白质的未加盖小瓶置于干燥器的上层室中，密封干燥器，并在5°C下孵育。

为启动氢氘交换反应以采集样品，需在将小瓶从干燥器中取出后立即盖紧瓶盖，随后通过液氮快速冷冻小瓶以淬灭反应。将小瓶储存在负80摄氏度条件下，直至进行质谱分析。采用高分辨率质谱分析样品，以最大限度减少反向交换。

制冷箱内的液相色谱系统是怎样的？首先安装仪器，将样品环和蛋白质捕获柱连接至控制脱盐和洗脱过程的阀门。接着，通过将低浓度调谐混合物注入质谱仪，并将质荷比范围设定为200至3,200，对系统进行校准。

然后将冷藏系统冷却至约零摄氏度的稳定工作温度。配制含有0.2%甲酸和5%甲醇的水溶液淬灭缓冲液，并将其置于冰上预冷。将样品转移至液氮后，小心取出一个样品瓶，加入两毫升淬灭缓冲液以重新溶解样品。

接下来加载适当的高效液相色谱和质谱方法。为分析此处的样品，在蛋白质捕获柱中用5%乙腈和0.1%甲酸对20皮摩尔的肌红蛋白进行1.7分钟的脱盐处理。然后在3.3分钟的梯度中洗脱蛋白质，乙腈比例逐渐升高至80%，并含0.1%甲酸。

注入样品，并在质荷比200至3,200范围内采集质谱。为确定完整蛋白质的质量作为参考，使用相同方法检测未经修饰的蛋白质样品。通过数据处理软件对原始谱图进行去卷积，获得蛋白质分子量。分析肌红蛋白样品时，设置质量范围为15至18千道尔顿，质量分辨率设为1道尔顿，峰宽阈值设为90%。进行肽段分析时，采用与完整蛋白质相同的方案制备样品。

当样品准备就绪可进行分析时，将固定的肽柱和分析柱连接至阀门，并将蛋白捕获柱更换为肽段捕获柱。校准系统用于肽段分析的方法与完整蛋白质相同，但需将质荷比范围设置为100至1700，随后将制冷系统冷却至约0摄氏度的稳定工作温度。系统校准完成后，设定相应的高效液相色谱（HPLC）和质谱分析方法。

在此，将20皮摩尔的肌红蛋白加入Pepin柱中，使用含0.1%甲酸的水溶液进行消化。设定方法：在肽捕获柱中以含10%乙腈和0.1%甲酸的溶液对肽段进行捕获和脱盐，持续1.7分钟；随后在4分钟内采用梯度洗脱，乙腈浓度逐步升至60%，同时保持0.1%甲酸浓度不变，以洗脱肽段。接下来，进样并采集质荷比范围为100至1700的质谱数据。利用串联质谱分析未标记的肽段样品，以鉴定其肽片段。

然后将实验测定的片段与软件生成的预测质量进行比对。接下来，将质量截断值设为10 ppm，以排除匹配肽段中误差较大的质量值。记录肽段序列的电荷态及其保留时间。

使用收集的肽段数据，通过数据分析软件计算每个胃蛋白酶片段所结合的氘原子平均数量。首先，按照文本方案中的指示，将含有辅料和亮氨酸的蛋白质进行冻干。样品制备完成后，打开装有365纳米紫外灯的紫外交联仪，并让紫外灯预热五分钟。

待光源预热完成后，关闭灯源，将装有配方的未加盖小瓶放入交联仪腔室内。用紫外光照射样品40分钟，并设置不含光敏亮氨酸的样品作为对照。照射结束后盖上瓶盖，将小瓶于-20摄氏度保存，直至进行质谱分析。通过加入质谱级蒸馏水制备待分析样品，使最终蛋白质浓度达到2微摩尔。

接下来，使用与完整氘代蛋白质相同的质谱方法分析样品，但不要使用带制冷功能的液相系统。对未标记的蛋白质样品进行质谱数据采集，以确定蛋白质的天然分子量。

对肽段水平分析的数据进行处理，方法与 DERATED 样品相同。首先，对完整蛋白质进行固态光解标记，并于负20摄氏度保存。接着，用100毫摩尔每升的碳酸氢铵缓冲液重悬样品，使最终蛋白质浓度为10微摩尔每升。

将样品与胰蛋白酶按蛋白质与胰蛋白酶10:1的摩尔比混合，并在60摄氏度下孵育16小时。在此期间，将样品环、肽捕获柱和分析柱连接至高效液相色谱系统阀门。蛋白质消化完成后，加入含0.1%甲酸的水溶液终止反应，使最终蛋白质浓度达到2微摩尔。

接下来，使用高效液相色谱（HPLC）和质谱方法对系统进行编程。在此步骤中，将20皮摩尔经消化的肌红蛋白注入肽捕获柱，用含5%乙腈和0.1%甲酸的溶液进行1.5分钟的进样和脱盐，随后在22分钟内将乙腈浓度梯度升至55%以洗脱肽段，并在质荷比100至1700范围内采集质谱数据。使用在线工具计算肽段的理论质荷比。

将光反应性亮氨酸加合物与先前从完整蛋白质分析中获得的光反应性亮氨酸数量进行比对。应包含至少四个未完全切割的肽段。在 Excel 中创建肽段光反应性亮氨酸加合物的质谱峰列表。

接下来，通过设定一个截断点来匹配理论质量列表与实验观测到的质量，以识别误差较小的质量峰。在氢氘交换过程中，蛋白质的去折叠使其氢原子更易被氘原子取代，而保持结构完整的蛋白质则不易发生氘交换。当对含有塔罗糖和含有山梨醇的肌红蛋白制剂进行固态氢氘交换质谱分析时，含有山梨醇的制剂显示出高出46%的氘摄取量，表明在冻融过程中，山梨醇制剂中肌红蛋白的结构扰动更为显著。

光敏亮氨酸可与可接触的氨基酸侧链发生交联。对含山梨醇和TLOs的肌红蛋白制剂进行固态光解质谱分析，结果显示TLOs制剂中的光敏亮氨酸结合量高于对照制剂，表明在TLOs制剂中氨基酸侧链仍保持可接触性。

氢氘交换和裂解标记均利用市售试剂和常见的质谱仪器，用于表征任意处方中固态蛋白质的结构。从样品制备到完成数据分析的总耗时少于两周。观看本视频后，您应能充分理解如何获取蛋白质结构的高分辨率信息，以及这些信息在设计稳定的冻干蛋白制剂中的重要性。