从细胞亚群特异性RNA提取使用激光捕获显微切割加上快速的免疫标记

该程序的总体目标是演示如何对通过激光捕获显微解剖或 LCM 分离的小鼠脑细胞群进行快速免疫标记，同时保持样品的 RNA 完整性。这是通过首先快速冷冻解剖的脑组织来实现的。然后将大脑切成薄片，放在无 RNA 的玻璃显微镜载玻片上，并用快速免疫染色处理。

最后，使用 LCM 分离感兴趣的细胞群。最终，快速染色后进行激光捕获显微切割，可以鉴定实验细胞样品中目标基因表达的变化。与荧光激活细胞分选等现有方法相比，该技术的主要优点是，使用我们的技术，可以保持空间分辨率，允许从周围组织中解出特定的 ES 细胞。

通常，刚接触这种史密斯细胞的人会转圈，因为该程序包括几个关键步骤，需要快速工作以保持样品中 RNA 的完整性。为了准备用于切片的样品，在处死后两分钟内，在冰冷的 L 15 培养基中解剖出生后第一天小鼠的大脑。接下来，将大脑以适当的方向放入包埋模具中以进行切片，并用冷冻组织、包埋培养基填充模具。

然后立即将样品冷冻在液氮中，并在速冻后 30 秒内将其储存在零下 80 摄氏度。现在，用表面 RNA 去污处理膜包被的载玻片，以去除任何痕量的 RNA。用 DEPC 水冲洗它们，并在载玻片干燥后让它们风干。

将低温恒温器室温度设置为零下 20 摄氏度，然后将冷冻样品转移到低温恒温器中。对于每个样品，将冷冻块安装在样品夹上，以 10 微米的厚度切片样品，将切片收集到膜涂层载玻片上。让切片干燥至少 10 分钟后，使用疏水屏障笔包围组织。

大约 10 秒后，将玻片置于新鲜制备的冷固定液中，在零下 20 摄氏度下放置不超过 5 分钟。现在将玻片转移到用表面 RNA 去污溶液预处理的干净托盘中。首先，摇晃载玻片一次以去除任何多余的固定剂，然后用 6 到 8 次快速浸泡洗涤它们 在 D-E-P-C-P-B-S 中轻弹载玻片。

要去除过量的 D-E-P-C-P-B-S，向每个切片中加入 200 μL 一抗溶液。在室温下 10 分钟后，在 D-E-P-C-P-B-S 中快速浸泡 3 次洗涤玻片，然后轻弹一次以去除多余的洗涤液。然后在室温下将样品放入 200 μL 二抗溶液中孵育 6 分钟。

如前所述，在 D-E-P-C-P-B-S 中洗涤载玻片，并在再次快速 D-E-P-C-P-B-S 洗涤混合物 196 微升新鲜制备的 DAB 与 4 微升 RNA 抑制剂混合后，将它们在新鲜制备的 BC 溶液中孵育 4 分钟。在将溶液添加到该部分之前，让 DAB 显影 1 到 2 分钟，然后进行 A-D-E-P-C-P-B-S 洗涤。然后在无水乙醇中孵育几秒钟，使切片脱水，并将载玻片弹干以继续进行 LCM。

接下来，将 RNA 提取试剂盒中的 50 微升裂解缓冲液放入收集管盖中。然后将一张载玻片放在显微镜下，样品面朝向盖子。为样品选择最佳放大倍率并调整焦距以查看感兴趣的细胞。

然后定义切割区域并开始使用激光切割。在收集管中收集解剖材料，在 42 摄氏度下将收集的细胞封盖 30 分钟。在此期间，用 250 μL 调节缓冲液对 RNA 提取试剂盒中的 RNA 纯化柱进行预处理。

然后将 50 μL 乙醇加载到柱上的裂解细胞中，并在 16， 000 Gs 和室温下离心柱 2 分钟，然后用洗涤缓冲液冲洗两次。最后，用最小推荐体积的 11 μL 无 RNA 水洗脱 RNA，留出 2 μL，以测试 RNA 的质量。这种快速免疫标记程序允许观察目标细胞，同时保持实验 RNA 的完整性。

根据实验，正如刚才所展示的，LCM 可用于分离单个细胞或更大的感兴趣区域。降解的 RNA 对下游分析的质量有相当大的影响。因此，每个样品都在基于微流体 X 的平台生物分析仪上进一步处理，以便定量和验证分离的 RNA 的完整性，如刚才所示。

例如，这里的典型生物分析仪结果既有降解的，也有好的。显示了 RNA 样品。事实上，数字凝胶和电泳图证明了在每种溶液中使用 rase 抑制剂以保护 RNA 的重要性 在此程序之后，可以进一步处理高质量的 RNA 用于下游应用，包括 RNA 测序微阵列或 Q-R-D-P-C-R，例如，在这些图表中，显微解剖样品中 TH 和 A A DC 基因表达的平均富集度被确定为相对于中脑切片的 170 倍以上。

在尝试此程序时，重要的是要记住非常快速地工作并使用不含 RNA 的材料。观看此视频后，您应该对如何从任何组织中分离特定细胞群有很好的了解。