Name: 使用小鸡GFP 神经管移植和碳水化合物染料 DiI 注射，在鸡胚胎内对神经囊细胞和血管进行双重标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习使用GFP神经管移植和DiI注射双重标记技术，在鸡胚胎中同时可视化神经嵴细胞与血管系统。该方法为研究肠神经系统发育提供了强大的成像工具。

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转基因绿色荧光蛋白（GFP）鸡受精卵由英国爱丁堡大学罗斯林研究所（The Roslin Institute）及爱丁堡大学的海伦·桑格教授提供。罗斯林转基因鸡设施由惠康基金会（Wellcome Trust）以及生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）资助。本工作部分由英国伦敦大奥蒙德街医院儿童慈善机构资助，NT亦获得其支持。&#160;作者感谢伦敦大学学院儿童健康研究所（UCL Institute of Child Health）的Ben Jevans在胚胎移植准备过程中提供的帮助。

1. 神经管消融用微型手术刀的制备
<ol>
	<li>使用市售的钢制缝纫针制作微型手术刀。
	<ol>
		<li>首先使用安装在电动台式磨光机上的砂轮，将针的两侧压平。</li>
		<li>接着使用粗粒度阿肯色石，以受控的环形运动，在针的两侧交替进行刀刃塑形。</li>
		<li>继续在超细粒度阿肯色石上进行相同的磨削操作，以形成具有清晰切割刃的超精细微型手术刀（图1A, B）。 
		注意：可替代微型手术刀的工具有电解 sharpened 针、市售钨针或拉制玻璃针。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将野生型和GFP卵孵育至所需阶段
<ol>
	<li>将受精的鸡卵和转基因GFP鸡卵在孵化前置于14 - 15 °C的冷却孵化箱中保存，此温度下胚胎发育将停止。卵可保存数天，最长不超过一周。</li>
	<li>为启动发育，将野生型和GFP鸡卵水平放置于托盘中，并在37.5 ºC、湿度为58 - 60%的加湿孵化箱中同时孵化，以确保胚胎发育阶段一致，便于进行迷走神经管移植。</li>
	<li>为获得处于10 - 12体节发育阶段的胚胎以进行迷走神经管移植，需将鸡卵孵化1.5天（33 - 38小时），并依据Hamburger和Hamilton的胚胎发育分期表21确定胚胎阶段。</li>
</ol>
3. 准备受精卵用于开窗和移植
<ol>
	<li>将一枚卵逐次转移至定制的卵固定装置中进行开窗操作。用直头剪刀反复轻敲卵的尖端顶部表面，在卵壳上打一个小孔。</li>
	<li>使用18½ G的皮下注射针头和5 ml注射器，从卵中移除2–3 ml的蛋白液。去除蛋白可使卵黄在卵内下移，便于后续开窗操作，同时避免对胚胎造成损伤。
	<ol>
		<li>弃去取出的蛋白液。用精细剪刀裁剪一小条透明胶带，封住小孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用弯头剪刀，在卵壳顶部表面再轻敲出另一个小孔。将剪刀尖端插入孔中，保持剪刀与实验台平行，以环形方式剪切，形成一个直径约2 cm的卵壳窗口。
	<ol>
		<li>保持剪刀位置固定，旋转卵体。弃去切下的卵壳圆片。在E1.5时期，胚胎可识别为卵黄表面一个颜色较深的黄色圆盘状结构。</li>
		<li>用镊子清除落入卵内的任何卵壳碎片。弃去未受精的卵（表现为浅黄色卵黄表面有一个小白点）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 准备受体胚胎以接受移植组织
<ol>
	<li>将体视显微镜调节至与眼睛齐平的高度，并优化蛇形灯源的方向，以充分照亮胚胎，同时避免产生反光。</li>
	<li>观察胚胎 适当的，使用口吸管和拉制的玻璃微量移液管，在较深的黄色圆盘中心下方注入少量印度墨水图1C，Oii).
	<ol>
		<li>用 PBS 配制青霉素/链霉素溶液，终浓度为 100 μg/ml，与墨水按 1:1 比例混合。将微移液管插入胚盘边缘外的卵黄膜，然后小心调整其尖端角度，使其正对胚胎下方。</li>
		<li>通过吹口管将墨水注入胚胎下方。若不允许口吸移液，请改用1 ml注射器。注意避免在胚胎下方引入气泡，以免造成污染，然后小心移除玻璃微量移液管。此步骤十分关键，操作不精准可能导致胚胎死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据哈amburger和Hamilton分期法对胚胎进行分期21 并在实验记录本中记录该阶段。</li>
	<li>使用安装在持针器上的定制微型手术刀（或细钨针），在即将进行显微手术的区域附近，于卵黄膜上制造一个极小的切口。
	<ol>
		<li>用玻璃微量移液管和口吸管，小心地在膜撕裂处滴加 2 - 3 滴 PBS，以在胚胎与膜之间创造间隙。在膜上切开一个更大的窗口，暴露即将进行显微手术的整个区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用显微手术刀切除目标神经管区域，首先在神经管背侧进行头端和尾端的横向切口（视频中对应体节1至7水平）。
	<ol>
		<li>在神经管与体节之间进行双侧切割，将神经管与周围组织分离，注意不要损伤体节。</li>
		<li>非常轻柔地将神经管从其下方完整的脊索上分离。注意，成功的神经管切除应使周围所有组织保持完整无损（图2).</li>
		<li>用玻璃微量移液管将已切除的神经管吸出，然后弃去。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验记录本中记录神经管消融的程度。受体胚胎现已准备好接受供体神经管。</li>
</ol>
5. 准备受体移植物组织
<ol>
	<li>在荧光体视显微镜下使用FITC滤光片观察，选择一个具有窗口且发育阶段匹配的GFP胚胎。GFP荧光可清晰显示体节，便于胚胎分期。</li>
	<li>确定阶段匹配的胚胎后，使用Pascheff-Wolff弹簧剪刀（图1C, l）在胚胎周围呈矩形做4处切口，随后用胚胎勺轻轻取出胚胎。</li>
	<li>将胚胎置于底部铺有Sylgard聚合物的方形培养皿中。使用Dumont #5镊子轻轻晃动胚胎以去除附着的卵黄。去除卵黄膜后，用不锈钢显微钉针将胚胎固定在聚合物基底上（图1C）。</li>
	<li>使用弹簧剪刀在神经管及其周围体节区域做4处切口，切口呈矩形，位置与宿主胚胎中已切除的区域相对应。</li>
	<li>使用塑料转移移液器，将供体GFP胚胎的神经管和体节组织转移至含有含青霉素/链霉素的PBS中添加0.2%胰蛋白酶的培养皿中。</li>
	<li>室温下孵育10分钟，进行酶消化以促进组织分离。酶处理后，使用安装在手柄上的不锈钢显微钉针手动将神经管与所有邻近组织分离。</li>
	<li>使用玻璃微量移液器将分离的神经管转移至另一盛有DMEM + 10%血清（例如，山羊血清、马血清或胎牛血清）并置于冰上的培养皿中，以洗去多余的胰蛋白酶并终止酶消化反应。5分钟后，分离的神经管即可用于正位移植至鸡胚宿主体内（图2和S1）。</li>
</ol>
6. 移植组织
<ol>
	<li>使用玻璃微量移液管，将解剖好的神经管从表面皿小心转移至宿主胚胎中。将神经管置于正确的头尾方向，并用显微手术刀轻轻将其推至鸡宿主已切除区域的邻近位置。保留一小段外胚层附着于神经管背侧，或在背侧表面切一小切口，以标识神经管的方向。
	<ol>
		<li>如有必要，使用显微手术刀将外植组织修剪至与切除区域完全相同的大小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻柔地将神经管引导至去除此组织后的区域，并使其背侧朝向正确。使用连接于口吸管的玻璃微量移液管，吸除移植物周围的 PBS 和/或液体。这有助于供体与宿主组织黏附，并促进移植物的稳定植入。</li>
	<li>用宽 24 mm 的透明胶带完全封闭窗口，以防止脱水和污染。</li>
	<li>通过在蛋壳上用铅笔标记的方式对嵌合胚胎进行标记，并在实验记录本中记录其编号。将鸡蛋放回培养箱中继续发育。</li>
</ol>
7. 将DiI注入宿主胚胎的血管
<ol>
	<li>在预定的实验时间点（此处为3至10天后），从培养箱中取出嵌合胚胎，使用直头剪刀移除透明胶带，以暴露蛋内的胚胎。</li>
	<li>如有必要，可用剪刀扩大蛋壳上的窗口。注意避免损伤附着在蛋壳上的尿囊绒毛膜，否则会导致出血，影响血管标记效果。</li>
	<li>在卵黄囊上选择一条易于接近的静脉，确保血流方向朝向胚胎。选择一条卵黄静脉的分支点（图3B、C）。 
	注意：在胚胎发育第6.5至7.5天（E6.5–E7.5），可能需要用镊子轻轻拨开尿囊绒毛膜以暴露卵黄静脉。而在E8.5之后，由于尿囊绒毛膜已完全覆盖胚胎，只能选择其上的静脉进行注射。</li>
	<li>使用两把Dumont #5镊子朝相反方向撕开选定注射位点上方的卵黄膜。</li>
	<li>用Dumont #5镊子折断一根拉制的玻璃针，并在装入CellTracker CM-DiI前将其尖端直径调整至与目标静脉大致相当。将DiI储存液配制成40 µg/µl的DMSO溶液，于-20 °C保存。工作液用0.3 M蔗糖/PBS配制，浓度为4 µg/µl。
	<ol>
		<li>用口吸管将5–10 µl的DiI工作液吸入玻璃针中。较晚期的胚胎可能需要25 µl或更多。自E8.5起，胚胎的静脉更大且肌层更发达，注射前可能需要用Dumont #5镊子固定静脉位置，再用装载DiI的玻璃针刺入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>迅速将玻璃针插入静脉，通过口吸管稳定吹入，使DiI缓慢进入血流，避免形成血栓。也可使用压力注射仪进行DiI递送。</li>
</ol>
8. 收集胚胎用于切片或整体染色观察
<ol>
	<li>为了尽可能保留胚胎内的DiI，注射后立即用带孔的勺子将胚胎舀出，并用直剪刀剪断血管和结缔组织，使胚胎与卵黄分离。</li>
	<li>去除任何松散的膜组织，并解剖出目标器官（即，本教程中的肺和消化道），注意避免挤压组织，以防DiI扩散。立即将组织浸入4% PFA中，在室温下固定1 - 2小时。</li>
	<li>用 PBS 冲洗组织 5 分钟，然后在含有 5 μg/ml DAPI 的 PBS 中冲洗 15 分钟。将样品置于桥式载玻片上进行整体封片观察，或进行包埋以用于冷冻切片。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述的种内神经管移植方法结合血管标记技术，充分利用了禽类胚胎在卵内易于操作的优势（相较于其他脊椎动物胚胎），以研究自主神经系统（ENS）与血管系统某一组成部分的共同发育过程。
用于标记NCC衍生物，鸡GFP- 本文所述的鸡种内移植方法相较于40多年前建立的经典鹌鹑-鸡嵌合体方法具有多项优势1-3首先，在FITC光源下，GFP荧光非常明亮，以至于在活体嵌合胚胎中GFP+细胞清晰可辨。这使得能够检测移植是否成功。 在卵内而鹌鹑-鸡嵌合体移植则需要在确定移植是否成功之前，先将胚胎处死，进行处理，并使用QCPN进行免疫染色2其次，转基因鸡中GFP的表达GFP 位于细胞质中，因此不仅能标记细胞胞体，还能显示移植细胞的突起结构22。这使得复杂的神经元网络可以在高分辨率下被观察到（需要注意的是，当样本使用抗GFP抗体进行免疫染色时，细小的投射结构可获得最佳可视化效果）。由于QCPN标记仅限于鹌鹑细胞的细胞核，因此在鹌鹑-鸡嵌合体中无法揭示此类神经网络。第三，种内移植消除了嵌合胚胎中不同细胞间可能存在的物种差异。由于鹌鹑胚胎的孵化周期比鸡短（19天） 与 有研究表明，鹌鹑细胞的增殖速率高于鸡细胞，这可能影响嵌合组织的发育（21天）23有趣的是，研究还表明，在植物中，种间嫁接可导致寄主DNA甲基化模式发生广泛改变 24第四，鸡胚GFP 促进回植实验，以研究神经嵴细胞命运和细胞分化承诺等课题25第五，转基因鸡GFP 也可用于许多其他技术，包括对GFP+细胞亚群进行FACS分选、含GFP+细胞的器官进行器官型培养，以及对GFP+移植组织进行遗传操作 通过 表达质粒的电穿孔26，以及其他成像技术，如光学投影断层扫描27.
可通过显微外科手术替换较短长度的神经管来改良神经管移植方法。使用较短的神经管片段进行移植，可潜在降低对胚胎的损伤，提高胚胎存活率。然而，移植较少神经管的缺点是宿主体内GFP+神经嵴细胞（NCC）的数量会减少。研究者可尝试在移植神经管的量与胚胎最佳存活率之间，以及宿主肠道内足够产生有意义结果的GFP+ NCC数量之间，寻求一个平衡点。
在血管染色方面，DiI 的优势在于其荧光信号非常明亮且稳定。此外，DiI 能在固定过程中发生扩散，从而确保最细微的开放毛细血管也能被有效染色。由于它是一种活体染料，胚胎在注射后仍可存活，并继续发育，其血管系统保持染色状态（在我们的实验中可维持长达24小时，尽管随着时间推移染色会逐渐呈现点状分布，见图3E）。因此，鸡胚GFP 移植结合 DiI 血管染色的方法适用于活体成像。尽管具有上述诸多优点，仍需注意的是，血管注射仅能标记已开放的管腔血管，因而无法识别未开放的毛细血管、内皮顶端细胞或孤立的内皮细胞。然而，禽类转基因技术的进一步发展可能为克服此类问题提供新途径，例如利用 Tg(tie1:H2B-eYFP) 转基因鹌鹑胚胎研究血管形态发生过程的实验28。该技术的另一局限性在于，对 E7.5 及更晚期胚胎进行有效血管标记时，需要注入较大量的染料，可能导致实验成本升高。不过，该技术的一种改进方案是使用荧光笔墨水进行低成本的血管标记14，尽管我们在实验中尚未尝试此方法。
操作过程中的关键步骤包括通过在胚盘下方注射墨水来观察胚胎。如果在此阶段墨水填充的针头刺破了覆盖卵黄的膜，则胚胎的存活率将受到严重影响。此外，在准备供体神经管时，需注意组织在胰蛋白酶中不宜放置过长时间（建议约10分钟）。&#160;（以最大时间为准）。长时间暴露于胰蛋白酶会损伤组织，导致神经管难以操作，且不易整合到宿主体内。&#160;在对嵌合胚胎进行显微注射之前，必须先在野生型胚胎上熟练掌握DiI注射技术，因为每个胚胎通常仅有一次注射机会。DiI注射体积和针头直径是影响每个胚胎注射效果的关键参数，应在与实验组发育阶段相匹配的野生型对照胚胎上进行优化和评估。 &#160;
综上所述，我们采用的神经管移植与DiI血管标记相结合的方法可用于研究器官发生过程中神经嵴细胞（NCC）与血管网络之间的相互关系。鉴于目前对于器官发育过程中建立正确靶向神经支配和血管化的机制仍知之甚少，该方法在此领域具有广阔的应用前景，有望推动未来的相关研究发现。

鸡胚是脊椎动物发育生物学中一种极为重要的模式生物，其重要性至少部分源于其在蛋内（in ovo）的发育方式，使得研究人员能够进行在子宫内（in utero）发育的脊椎动物中难以实现的实验操作。这种可及性和易于操作的特性，使鸡胚在发育生物学领域的许多里程碑式发现中发挥了关键作用。其中最强大的技术之一是利用鹌鹑-鸡嵌合胚胎来研究细胞命运，该方法由Nicole Le Douarin教授在20世纪70年代首创1-3。特别是，鹌鹑-鸡嵌合体在遗传标记并追踪早期发育过程中高度迁移的神经嵴细胞（NCC）群体方面尤为有用。神经嵴细胞是一类具有多能性的迁移细胞群体，起源于神经管边缘的背侧外胚层，可分化为脊椎动物胚胎中多种类型的细胞，包括颅面结构（软骨、骨骼、肌肉）、感觉和自主神经系统中的神经元和胶质细胞、黑素细胞，以及内分泌系统中的一类亚群细胞2,4,5。影响神经嵴细胞命运的最重要因素之一是其在神经管前后轴上的初始位置。例如，形成肠神经系统（ENS）神经元和胶质细胞的肠源性神经嵴细胞来源于两个明确的亚群：第一个位于迷走神经区（后脑尾部），第二个位于神经管的骶部区域6-13。通过种间或种内移植相应神经管区域，已成为永久标记这些细胞的首选技术，从而能够从其在神经管边缘起源时开始追踪，直至其最终定植于消化道内的位置6,7,10。
与其他动物模型相比，在鸡胚中更容易进行的另一种胚胎操作是对血管系统的活体标记。事实上，随着鸡胚的发育，其下方存在一个位于卵黄表面的胚外血管网络，负责从卵黄输送氧气和营养物质。这一位于卵黄表面、易于接近的血管网络，可在器官发生期间作为标记胚胎发育中血管系统的通道12,14-17。通过向血管内注射多种染料（例如脂溶性染料DiI），可以清晰地描绘或染色新生血管网络中的所有管腔血管。
由于发育中的器官需要同时连接神经系统（以实现感觉和运动控制）以及血管系统（以实现气体交换、液体和营养供应），这两个网络在发育过程中相互伴随，并在分支结构上表现出显著的相似性18-20。本文报道了一种胚胎操作方法，可实现器官发生过程中神经嵴细胞（NCC）来源的肠神经系统（ENS）与血管系统同时发育的研究。该方法通过移植包含神经嵴的神经管特定节段，结合血管内DiI注射，从而构建鸡嵌合体。相较于传统的鹌鹑-鸡嵌合体方法，本方法采用转基因GFP鸡胚胎进行种内移植，不仅增强了细胞及其突起的成像能力，而且消除了与物种差异相关的潜在偏差。

<table><tbody><tr><td>受精的鸡卵</td><td>Henry Stewart 和 Co，英国林肯郡卢顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>受精的GFP鸡胚蛋</td><td>爱丁堡大学罗斯林研究所转基因鸡设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋孵育器（Profi-H Hatcher）</td><td>Lyon Technologies, CA, 美国</td><td>910-033</td><td></td></tr><tr><td>14C 培养箱</td><td>精密冷却培养箱，Leec Ltd.，诺丁汉，英国</td><td>模型 LT2</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>LEICA</td><td>Model MZ 12.5</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>LEICA</td><td>DC500</td><td></td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>LEICA</td><td>IM50</td><td></td></tr><tr><td>鹅颈式卤素冷光源</td><td>Advanced Imaging Concepts, Inc</td><td>KL 1500 LCD&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>181&amp;frasl;2 G皮下注射针头&amp;nbsp;</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>HSWNH181</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>P3292</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>Z248010</td><td></td></tr><tr><td>口管</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Pasteur 吸管，无塞，长 5 3/4 英寸</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>S6018</td><td></td></tr><tr><td>移液管，聚乙烯</td><td>SIGMA - ALDRICH</td><td>Z350796&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管，薄壁，无纤维</td><td>哈佛仪器</td><td>PY8 30-0035</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪 - ToughCut</td><td>精细科学工具</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>弯曲虹膜剪 - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-09</td><td></td></tr><tr><td>持针器（镀镍针持）&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>帕施-沃尔夫弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11251-30&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>微型固定针&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont AA 镊子，Inox 环氧涂层&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11210-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>带孔勺子</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>钨针（直径0.125 mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td></td></tr><tr><td>透明胶带（透明，24 mm 宽）</td><td>任何供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Penicillin, Streptomycin）溶液</td><td>VWR 国际公司</td><td>101447-068&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td>S09 512 516</td><td></td></tr><tr><td>Pelikan 黑色墨水</td><td>Pelikan</td><td>211-169</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI&amp;nbsp;</td><td>分子探针</td><td>C-7001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>分子探针</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>玻璃针拉制仪设置参数&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪型号 P-86</td><td></td></tr><tr><td>加热 950；拉力 150；速度 100；时间 200；压力 500</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用鸡胚gfp神经管移植与碳菁染料dii注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双重标记

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

所有正在发育的器官都需要与神经系统（用于感觉和运动控制）以及血管系统（用于气体交换、液体和营养供应）相连。因此，神经系统和血管系统在发育过程中相互伴随，并在分支结构上表现出显著的相似性。本文报道了一种胚胎操作方法，可实现神经嵴来源的神经组织（此处为肠神经系统）与血管系统的同步发育研究。该方法通过移植神经管及其相关神经嵴的特定节段，并在同一胚胎中结合血管内DiI注射，从而构建鸡嵌合体。via该方法使用转基因chickGFP胚胎进行种内移植，使移植技术比自20世纪70年代以来广泛应用的经典鹌鹑-鸡种间移植方案更为强大。chickGFP-鸡种内移植便于在完整组织中对移植细胞及其投射进行成像，并消除了与物种差异相关的细胞发育潜在偏差。该方法充分利用了禽类胚胎相较于其他脊椎动物胚胎更易操作的优势，用于研究肠神经系统与血管系统的协同发育。

图1展示了进行神经管显微外科分离与移植所需的典型仪器。图2展示了移植操作步骤。移植后，需对胚胎进行筛选以评估移植是否成功。该过程通常在显微手术后的次日早晨，通过体视荧光显微镜观察胚胎中是否存在移植物来源的（GFP+）神经嵴细胞（NCC）。若移植成功，则可在神经管周围以及向食管方向延伸的早期迁移路径中观察到GFP+ NCC。若操作未成功，则在神经管外无法观察到GFP+ NCC，或即使存在于宿主胚胎中，其数量也较少。此类未成功的胚胎将被弃用。通常情况下，每天可完成5至8例神经管移植，其中约80%获得成功。神经管移植失败的原因包括：显微手术过程中因组织损伤导致胚胎死亡，或神经管未能成功整合至宿主胚胎。后者可能由神经管在宿主体内位置不当，或因解剖技术不佳、过度暴露于解离酶导致神经管质量不佳所致。初始筛选步骤以及后续类似的GFP+细胞检测具有重要意义，可避免对肠道内无GFP标记NCC的胚胎进行不必要的实验，从而节省时间和资源。
图3展示了对血管进行DiI注射的操作流程。DiI注射技术的成功/效率取决于以下三点：首先，将注射针剪裁至适合目标静脉的最佳直径；其次，将针头插入静脉时动作需精准（避免刺穿静脉对侧管壁）；第三，在注射过程中以恒定速率吹气，防止针头堵塞。若上述任一参数操作不当，胚胎将发生出血，需等待数小时恢复后方可进行第二次尝试，因为出血会导致无法立即重新注射。应立即在体视荧光显微镜下观察并挑选注射成功的胚胎，并迅速进行后续解剖。在成功的胚胎中，DiI标记的血管遍布整个胚胎（图3C,D），包括毛细血管床（图3D）。
在收获胚胎并检查组织切片或全组织胃肠道后，典型结果可显示原始肠神经系统（ENS）中存在GFP+神经嵴细胞（NCC），以及DiI标记的肠道血管网络的精细结构（图4）。可利用共聚焦显微镜观察全组织样本，通过图像堆栈生成三维（3D）重建图像，展示GFP+ ENS细胞的细小突起与DiI染色的血管系统之间的空间关系（图4 A-C；G-I；视频1和2）。
<img alt="显微外科与解剖工具概览，包括针头修磨及精密设备。" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 推荐的显微外科器械。 (A) 由缝纫针制成的显微手术刀。(B) 用于修磨显微手术刀的精细阿肯色石。(C) a) 直剪刀，b) 弯剪刀，c) 带有18½ G皮下注射针头的5 ml注射器，d) 塑料移液管，e) 自制卵子固定器，f) 黑色墨水，g) 方形表面皿，h) 带黑色硅胶基底的方形表面皿，i) 安装在针柄上的显微手术刀，j) 显微固定针（minutien pins），k) 安装在针柄上的显微固定针或钨针（minutien or tungsten needle），l) Pascheff-Wolff弹簧剪刀，m) Dumont #5镊子，n) 带孔勺，oi) 短型火焰拉制转移针，oii) 长型火焰拉制染色针，p) 吸嘴管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经管移植过程示意图；显示GFP神经管切除及酶消化过程。" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 种内神经管移植。 鸡胚/GFP神经管图像经Delalande et al.12修改。血管化对于肠神经嵴细胞定植肠道并非必需。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎显微注射示意图及操作步骤；血管成像；显微镜检查；发育研究。" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 静脉内DiI注射。（A）推荐使用的器械：a) 位于Parafilm上的CellTracker CM-DiI液滴，b) 拉制的玻璃注射针，c) 口吸管。（B）向E4期嵌合鸡胚进行静脉内DiI注射的示意图。（C）在卵内进行DiI静脉注射，显示含有DiI的精细玻璃针插入静脉（箭头所示）。（D）DiI注射后（红色）的E4期嵌合胚胎，可见表达GFP的神经管（箭头所示）。（E）注射后24小时活胚胎中被DiI标记的精细血管网络。Br：脑；H：心脏；LB：肢芽；A：尿囊。图（C）和（D）已根据Delalande 等12 修改。血管化对于肠神经嵴细胞定植肠道并非必需。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎胃和盲肠成像，肠神经嵴细胞与血管系统，共聚焦显微镜，E5.5发育阶段。" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：E5.5鸡胚胃部与盲肠的代表性结果。（A-C）胃部区域共聚焦图像堆栈的三维（3D）重建，显示（D）绿色荧光蛋白阳性（GFP+）肠神经嵴细胞（ENCC），（E）DiI标记的血管系统，以及（F）两者网络的合并图像。D-F 胃部水平的组织学切片，显示（G）GFP+肠神经嵴细胞（ENCC），（H）DiI标记的血管系统，以及（I）两者网络的合并图像。细胞核用DAPI染色（青色）。（G-I）盲肠区域共聚焦图像堆栈的三维（3D）重建，显示（A）绿色显示的GFP+肠神经嵴细胞（ENCC）迁移前沿，（B）红色显示的DiI标记的血管系统，以及（C）两者网络的合并图像。图像（A-F）经修改自Delalande et al.12 血管化对肠神经嵴细胞定植肠道并非必需。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脊椎动物胚胎中神经管形成与分节的荧光显微镜示意图。" src="/files/ftp_upload/52514/52514figS1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 S1"> 图 S1. 通过酶消化和显微解剖从周围组织中分离供体 GFP+ 神经管。(A) 从供体胚胎中解剖出的 GFP+ 神经管及相邻体节。(B) 使用不锈钢显微针经胰蛋白酶消化和显微解剖后分离得到的神经管。So：体节；NT：神经管；Nc：脊索。
<img alt="组织结构的共聚焦显微镜图像，显示胃部E5.5（HH27-28）时期血管系统与ENCC中绿色和红色荧光标记的细胞网络。" src="/files/ftp_upload/52514/52514video1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="video 1"> 视频1. 图4C图像的三维360°旋转展示，显示E5.5（HH27-28）时期胃部的血管系统和ENCC。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video1.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>
<img alt="共聚焦显微镜图像、神经网络可视化、绿色和红色荧光、细胞结构。" src="/files/ftp_upload/52514/52514video2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="视频 2"> 视频 2. 图4I中图像的三维360°旋转，显示E5.5（HH27-28）时期盲肠区域的血管系统及肠神经嵴细胞迁移前沿。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video2.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>

本文报道了一种利用鸡胚GFP 神经管同种移植结合血管内DiI注射，对神经嵴细胞和血管进行双标记的方法。该实验技术可使我们同时可视化并研究器官发生过程中由神经嵴细胞（肠）神经系统和血管系统的发育。

利用鸡胚GFP神经管移植与碳菁染料DiI注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双重标记

所有正在发育的器官都需要与神经系统（以实现感觉和运动控制）以及血管系统（用于气体交换、……）相连。

本实验的总体目标是在胚胎发育过程中，对神经嵴来源的神经组织及其相关血管系统进行共染色与可视化观察。该目标通过以下步骤实现：首先从野生型宿主胚胎中取出神经管，再从与之发育阶段匹配的转基因 GFP 鸡胚胎中切除相应位置的神经管区域，经酶消化处理后，将其移植至野生型宿主中。这将形成一个嵌合胚胎。第二步是将荧光染料注入嵌合胚胎的血液循环系统，以观察正在发育的血管系统。接着，收集胚胎并解剖出感兴趣的组织。最后，使用共聚焦显微镜对样本进行成像，以同时观察GFP标记的肠神经系统和DAI标记的血管网络。与现有方法（如经典的鹌鹑-鸡嵌合体移植技术）相比，该技术的主要优势在于GFP标记的鸡组织荧光信号非常明亮，且GFP在细胞质中表达，能够清晰显示神经网络中细胞的突起结构。此外，GFP与DAI标记方法均适用于活体成像。首先准备操作区域以及实验所需的所有工具和试剂，第一步是在蛋壳上开一个窗口，以便接触胚胎。移除两到三毫升蛋清后，应可通过窗口观察到胚胎。随后注射碳素墨水，以帮助观察胚胎。为此，将微量移液器插入爆破区域外围的卵黄膜下方，小心地将移液器尖端倾斜至胚胎正下方。到位后，通过吹气管吹气，将墨汁注入胚胎下方。注意避免引入气泡，以免造成污染。小心移除玻璃微量移液管。接着，使用安装在持针器上的自制显微手术刀，在即将进行显微手术区域附近的 IGN 膜上制造一个极小的撕裂口。为切除目标神经管区域，使用显微手术刀从体节一或二开始，横穿整个神经管至体节六或七处进行切开。接着，在神经管与体节之间沿两侧进行切割，以将神经管与其周围组织分离。注意不要损伤体节。准备就绪后，非常轻柔地将神经管从其下方的脊索分离，脊索应保持完整。成功的神经管切除应使所有周围组织完全保持完好。移除并弃去已切除的神经管。宿主胚胎现已准备就绪，可接受供体神经管。在鉴定出处于匹配发育阶段的GFP胚胎后，使用弹簧剪刀在蛋膜上做四个切口，围绕胚胎形成一个矩形，然后使用5号 Dumont 镊子轻轻将其拾起。将胚胎放入一个带有琼脂聚合物基底的方形容器中。轻轻摇动胚胎，以去除附着的卵黄。移除 VII 层膜，并使用不锈钢细针将胚胎固定在聚合物基底上。接着，在神经管及其周围体节的区域，围绕该区域已从宿主胚胎中移除的部分，做四个切口，形成矩形切口。使用塑料移液管将神经管及体节组织转移至含有 2% 胰蛋白酶的 PBS 的培养皿中，进行酶消化。室温孵育10分钟后，使用安装在手柄上的不锈钢细针手动将神经管从所有邻近组织中分离出来。分离后，将获得的神经管转移至另一置于冰上的表面皿中，以冲洗过量的胰蛋白酶并终止酶消化反应。5分钟后，分离的神经管即可用于移植。将分离的神经管从培养皿小心转移至鸡胚宿主的适当位置。准备开始移植操作时，将解剖好的神经管从表玻璃皿转移至宿主胚胎。将神经管置于正确的方向，并轻轻将其推入切除区域，使其相邻贴合。如有必要，可使用显微手术刀将外植体修剪至与切除区域完全相同的大小。放置到正确位置后，去除 PBS 及其他液体，以促进供体与受体组织的黏附并完成移植。可通过荧光显微镜观察，评估 GFP 阳性神经管在野生型鸡宿主中的成功整合情况。用24毫米宽的透明胶带将整个窗口密封，以防止脱水和污染。标记嵌合胚胎，并将鸡蛋放回培养箱中继续发育。在预定的实验时间点，从培养箱中取出鸡蛋，撕去透明胶带以暴露胚胎。胚胎可见后，找到卵黄上一条易于接近的血管，确保血流方向朝向胚胎。选择一条IGN静脉上的一个分支部位作为注射位点。使用镊子向相反方向撕开，移除选定注射点上方的玻璃膜。接着，调节拉制的玻璃针针尖直径，使其与静脉的尺寸相匹配。用五到十微升的Dai溶液润湿针头。迅速将针头插入血管，通过嘴管稳定吹气，使Dai溶液缓慢进入血流，避免形成凝块。可通过荧光显微镜短暂观察胚胎来评估Dai注射是否成功，注射后应立即明显可见胚胎情况。为了尽可能保留二碘（dii），将胚胎舀至带孔的勺子上，并切断血管和结缔组织，使胚胎脱离卵黄。去除任何松散的膜结构，并解剖出目标器官。务必小心操作，避免挤压组织，以免导致干眼症的扩散。立即将组织在4%多聚甲醛中室温固定1至2小时，随后按照全组织染色或冷冻切片的标准操作流程进行。胃部区域共聚焦图像序列的三维重建显示了GFP阳性的肠神经嵴细胞、DII染色的血管系统以及两者的叠加图像。胃部区域的代表性组织学切片也显示了GFP阳性的肠神经嵴细胞、DII染色的血管系统及两者的叠加图像。三维重建可用于生成具有360度旋转效果的动画。盲肠区域的三维重建显示了绿色的GFP阳性肠神经嵴前端和红色染料标记的血管系统。该图展示了两个网络的叠加图像。共聚焦图像序列被用于生成肠神经嵴细胞迁移前沿及其相关血管系统的动态影像。该技术通过实现对神经嵴细胞和血管的强荧光标记，使我们能够研究器官在发育过程中神经支配与血管化背后的机制。在进行该操作时，需特别注意其在显微镜下需要极为精准的手眼协调能力。总体而言，神经管移植和染料注射均需要大量练习才能成功。

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