Name: 对比成像的小鼠胚胎使用高频超声 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 了解向活体小鼠胚胎注射靶向微泡的方法，用于高频超声对比增强成像。该技术可测量血管灌注参数并评估微泡在胚胎血管中的靶向结合，助力发育生物学与神经科学研究。

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本工作由加拿大国家癌症研究所的特里·福克斯项目资助。

注意：本研究中进行的实验操作已获得加拿大安大略省多伦多市松树园研究所动物护理委员会的批准。必须始终遵守动物人道处理的操作规范。假设操作人员已接受过超声成像系统基本操作的培训。本方案由两人协作操作效果最佳。
1. 动物模型
<ol>
	<li>与 CD-1 雄性与雌性小鼠交配 Mus musculus 以获取用于灌注研究的野生型胚胎。</li>
	<li>对于分子成像研究，采用源自129/Ola品系的胚胎干细胞，通过同源重组方法生成Eng+/-小鼠，具体步骤参见Bourdeau的描述。 等14.
	<ol>
		<li>回交 B6- Eng+/- 小鼠，由Michelle Letarte博士惠赠，回交至CD-1遗传背景。使用 Eng+/- CD-1 回交&#160;胚胎，以及它们的 Eng+/+ 同窝对照。交配小鼠以获得不同发育阶段的胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验准备
<ol>
	<li>启动小鼠交配，并每天检查阴栓。胚胎发育第0.5天定义为观察到阴道栓当天的中午。</li>
	<li>通过向500 ml高糖（4,500 mg/L）杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 ml胎牛血清、5 ml 1 M HEPES和5 ml青霉素-链霉素溶液（10,000单位青霉素，10,000 µg链霉素）来配制胚胎培养液。用铝箔包裹瓶体，并在4 °C冷藏保存。</li>
	<li>将透明超声耦合剂在50 ml锥形管中以140 × g离心20分钟。用30 ml注射器吸取凝胶。另准备若干（已标记）的30 ml注射器，装入磷酸盐缓冲液（PBS），并放置备用。通常一窝胚胎需要2–3支超声耦合剂注射器和4支PBS注射器。</li>
	<li>拉制约30根玻璃针，并轻轻固定在100 × 20 mm细胞培养皿中的塑料条上，以确保操作过程中针头彼此分离且稳固。使用玻璃微电极拉制仪时，对带内丝的1 × 90 mm玻璃毛细管采用以下参数：加热器77，副磁铁55，主磁铁70。</li>
	<li>准备十到十二个解剖培养板（确保每只胚胎都有独立的培养皿），使用固化剂与基质按1:8体积比混合。将40 ml基质倒入50 ml锥形管中，加入5–6 ml固化剂，用木棒搅拌。
	<ol>
		<li>倒入60 × 15 mm培养皿中，每皿填充约一半体积。静置过夜使其固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将雌性鲁尔接头连接至长度为400 mm的聚氯乙烯（PVC）管（内径：0.79 mm）。该管道必须能轻松地从注射泵连接至超声成像平台。</li>
</ol>
3. 实验设置
<ol>
	<li>在手术显微镜下放置配备3D电机和21 MHz线性阵列换能器的成像平台。
	<ol>
		<li>将平台调整至导轨安装在左侧，载物台位于显微镜正下方的位置。</li>
		<li>将3D电机连接至平台伸展臂的球形关节。将传感器夹具的快速释放杆向前插入电机上的快速释放安装座，并将传感器头部置于夹具中，扣紧锁扣。</li>
		<li>将传感器连接器固定在推车前面板的活动端口上。打开设备电源。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动21 MHz超声换能器，分子成像研究选择“心脏”模式，灌注研究选择“普通”模式。将所有时间增益补偿滑块调至正中间位置。在“对比模式”下设置以下参数：频率：18 MHz，发射功率：4%（0.39 MPa），对比增益：30 dB，焦点：6 &amp;#38; 10 毫米，对比度模式：非线性，脉冲时间：0.1 秒时为 100%，声束宽度：宽</li>
	<li>将40 ml胚胎培养基分别加入四个50 ml锥形管中，每管40 ml。置于冰上。</li>
	<li>在2 L烧杯中加入1 L水，并置于加热板上加热。保持水温为45 °C。将一支超声耦合剂和磷酸盐缓冲液（PBS）加入烧杯中进行预热。始终使用温度计监测水温，以维持该温度。</li>
	<li>留出10至12个1 ml注射器和10至12根21 G针头，用于微泡注射。</li>
</ol>
4. 手术步骤
注意：当外科医生开始手术操作时，应由助手准备气泡（第5步）。本方案改编自 Whiteley et al.15
<ol>
	<li>从怀孕雌性小鼠处通过颈椎脱位法处死后收集 E16.5 或 E17.5 胚胎。 
	注意：麻醉对胚胎的影响尚未得到深入研究16其他方法（包括断头法）可作为妊娠小鼠安乐死的适当选择。
	<ol>
		<li>切开腹部以暴露子宫 &amp;#38; 胚胎。在子宫角尖端处切断（切断卵巢和子宫血管），并在阴道和膀胱处切断，小心且迅速地取出子宫。</li>
		<li>使用裂解镊子将子宫迅速转移至含有40 ml冰冻胚胎培养基的离心管中，注意避免损伤胚胎。丢弃小鼠尸体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转移到显微镜及载物台。将子宫放入一个100 × 20 mm的细胞培养皿中。将子宫转移至另一个装有50 ml新鲜胚胎培养液的新培养皿中。</li>
	<li>使用已灭菌（70%乙醇喷雾）的精细镊子，从一端开始轻轻撕开并剥离子宫的外层膜结构。暴露胎盘蜕膜、壁层卵黄囊和Reichert膜，将其与下方的脏层卵黄囊分离并移除。</li>
	<li>逐一解剖出胚胎，保持卵黄囊完整，并尽可能轻柔地处理胎盘17注意避免卵黄囊破裂，因为胚胎会立即弹出。
	<ol>
		<li>使用带孔的勺子将胚胎转移至另一盛有新鲜胚胎培养液且置于冰上的培养皿中。保持胚胎处于低温状态，直至使用。每隔1-1.5小时更换一次胚胎培养皿中的培养液。在此条件下，胚胎在解剖后最长可存活4小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 微泡制备
注意：使用靶向和非靶向微泡进行超声分子成像。单次实验可能需要多达3种不同的微泡试剂瓶：i）抗体靶向微泡，ii）同型对照抗体靶向微泡，iii）非靶向微泡。对比剂以冻干粉形式提供，使用前需用生理盐水重悬。每瓶非靶向微泡含有约 2 × 109 个微泡，靶向预混型试剂瓶含有约 8.8 × 108 个微泡。微泡在重悬后可稳定保存长达3小时。
<ol>
	<li>靶向微泡冻干管的重悬 
	注意：靶向微泡制备示例包括：靶向内皮糖蛋白的微泡（MBE，含生物素化的大鼠抗小鼠内皮糖蛋白抗体 MJ 7/18；由本单位杂交瘤设施制备）；靶向血管内皮生长因子受体 2 的微泡（MBV，含生物素化抗小鼠 CD309 抗体）；大鼠同型 IgG2 对照抗体靶向的微泡（MBC，含生物素化的大鼠同型 IgG2 对照抗体，用于靶向小鼠 IgG2a）。
	<ol>
		<li>将抗体溶液（20 µg）用生理盐水稀释至 1 ml（终体积）。置于冰上保存。</li>
		<li>用 1 ml 生理盐水填充注射器，排除所有气泡。安装 21 G 针头，缓慢将溶液注入微泡冻干管中。</li>
		<li>缓慢回抽活塞，抽出 1 ml 空气，然后拔出针头。轻轻振荡混匀。冰上静置 5 分钟。 
		注意：超声微泡在高压环境下可能被破坏。</li>
		<li>静置时间结束后，用新注射器吸取抗体稀释液，并加入相应的微泡管中。轻轻振荡混匀。让混合液（现为 2 ml）静置 10 分钟。保持在冰上。假设表面偶联完全，微泡表面结合配体的平均数量约为18 7,600 个配体/µm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非靶向微泡冻干管的重悬
	<ol>
		<li>用 1 ml 生理盐水填充注射器，排除所有气泡。安装 21 G 针头，缓慢将溶液注入微泡冻干管中。</li>
		<li>缓慢回抽活塞，抽出 1 ml 空气，然后拔出针头。轻轻振荡混匀。静置 5 分钟。再按上述方法加入额外 1 ml 生理盐水。轻轻振荡混匀后，冰上静置 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>库尔特计数
	<ol>
		<li>轻轻振荡所需微泡管，使用 21 G 针头将约 50 µl 溶液吸入 1 ml 注射器中。将微泡注入一个空的 2 ml 微离心管中。</li>
		<li>用移液器吸取 10 µl 微泡原液，加入 10 ml 稀释液中。</li>
		<li>轻柔混匀后，使用库尔特计数仪（见材料列表）测定微泡群体的浓度和粒径分布。使用 30 µm 孔径检测器，对每管样品至少进行三次 50 µl 的测量计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射用微泡的制备 
	注意：当开始“向胚胎注射微泡”（步骤 6）时，由助手执行此步骤。每个胚胎仅注射一次，助手应随机选择每次注射所用的微泡类型，确保所有类型的微泡在整个实验过程中均匀分布且顺序随机。确保外科操作者对所注射微泡的类型保持盲态。
	<ol>
		<li>根据步骤 5.3.3 测得的原液浓度，计算为获得终浓度 1 × 108 MB/ml、终体积 400 µl 所需的微泡原液体积。将相应体积的生理盐水分装至一个空的微离心管中。</li>
		<li>轻轻振荡选定的微泡管，使用 21 G 针头将过量体积（比上述计算值多约 50 µl）的溶液吸入 1 ml 注射器中。将微泡注入一个空的微离心管中。</li>
		<li>用移液器吸取所需体积的微泡原液，加入已分装的生理盐水中。用移液器尖端轻轻搅拌混匀。</li>
		<li>使用 21 G 针头将稀释后的微泡溶液吸入一支洁净注射器中。取下针头，排除注射器内所有气泡，连接鲁尔接头和导管。缓慢推动液体至导管末端，确保不产生气泡。</li>
		<li>将注射器装入输液泵，设定流速为 20 µl/min，总注射体积为 20 µl。在导管末端连接一根拉制的玻璃针头。将泵移至靠近注射平台的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 向胚胎注射微泡
<ol>
	<li>从冷藏的培养皿中随机选取一个胚胎，并用带孔的勺子将其取出。置于体视显微镜下超声平台上的解剖皿中，用精细镊子去除卵黄囊和羊膜，从血管分布较少的一侧（即反着床侧）进行剪切或撕开。最简便的操作方式是在靠近头部区域的邻近部位刺入。
	<ol>
		<li>剪切范围以足以将胚胎取出为宜，但不要过度。使用少量橡皮泥固定解剖皿，防止移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻柔地将囊膜从胚胎周围分离。将胚胎侧置，使胎盘和脐带血管位于前方。根据需要，使用昆虫针将卵黄囊（建议使用4根针）及胎盘边缘固定于皿底，注意避开主要血管。</li>
	<li>用预热至45 °C的PBS清洗胚胎，直至胚胎恢复活动。辨认脐静脉及其相关的血管网络。调整解剖皿位置，以便于进行注射操作。 
	注意：胚胎升温后，其体内血液开始流动，可在脐动脉中观察到明显的搏动性血流。血流初始时，静脉呈鲜红色，随后两者的血液颜色迅速趋于一致。在胎盘表面，源自脐静脉的分支通常覆盖在脐动脉分支之上。</li>
	<li>胚胎复苏后，用预热的超声耦合剂覆盖胚胎（避免覆盖胎盘），并使用精细镊子小心清除胚胎周围的气泡。向解剖皿中补充预热的PBS。 
	注意：注意观察PBS和耦合剂注射器中的液体余量，必要时将备用注射器放入加热烧杯中预热。</li>
	<li>将玻璃针固定在解剖皿边缘的一团较大橡皮泥上，并将针尖插入PBS中。选择胎盘盘状结构绒毛膜表面距离主干分支尽可能远的静脉，用剪刀将针尖修剪至合适长度。若将针尖剪成轻微斜面，则更便于注射。使用弹簧剪刀的边缘去除玻璃针尖的毛刺。</li>
	<li>使用注射泵以20 µl/min的速度缓慢将微泡溶液注入玻璃针中，直至针尖内的空气完全排出，且可见微泡在PBS中自由流动。停止泵注，并将注射体积重置为20 µl。注射过程中严禁空气进入胚胎的血管系统。</li>
	<li>将玻璃针尖轻柔插入胎盘中的某一支静脉，并确保其固定不动。移开体视显微镜镜筒，将超声探头置于胚胎上方，开始成像。</li>
</ol>
7. 超声分子成像
注意：使用先前设定的对比度非线性成像条件，调整换能器位置，使胚胎均匀地位于6 mm和10 mm焦点之间。定位完成后，开始团注微泡。注射完成后，启动计时器。
<ol>
	<li>灌注成像
	<ol>
		<li>通过按下“study management”按钮，并在研究浏览器顶部点击“Prefs”选项卡，确保已选择非线性对比模式的最大帧数。在“Preferences”窗口中勾选相应的选项。</li>
		<li>通过启动非线性成像来调整成像参数。按下控制面板上的“contrast mode”按钮。将“gain”旋钮调节至30 dB以优化二维增益，使用“power”旋钮将功率降低至4%，使用“frequency”旋钮将频率降至1 Hz，并使用轨迹球或鼠标将波束宽度（左下角）设置为宽模式。 
		注意：所有控制均位于超声系统控制面板上。</li>
		<li>以1 Hz的帧率记录20分钟的动态影像循环，以完整捕获微泡团注的流入和消散过程。按下扫描/冻结按钮以开始数据采集。</li>
		<li>当完整图像序列采集完成后，按下控制面板上的“cine store”按钮，将图像序列保存至系统缓冲区。系统将自动生成一个带有时间戳的非线性对比模型数据动态影像循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>靶向微泡成像
	<ol>
		<li>在“Prefs”中，将爆破时间设置为0.1秒。使用上述（7.1.2节）所述的控制装置设置适当的成像参数。</li>
		<li>按下控制面板上的“contrast mode”按钮，启动非线性对比成像。确保胚胎正确位于换能器下方，并且在非线性对比成像模式下可观察到微泡造影剂在胚胎内的流动情况。</li>
		<li>为评估胚胎分子成像研究期间靶向微泡的结合情况，在注射完成后让微泡不受干扰地循环3分40秒。此时间段用于保留循环中的微泡。在此期间按下“scan/freeze”以暂停成像。</li>
		<li>在3分40秒时，恢复成像以确认胚胎仍可见、被PBS充分覆盖，且微泡继续循环。按下“scan/freeze”以重新开始成像。</li>
		<li>在注射后3分50秒开始采集破坏/再填充序列，以29 Hz记录一段“破坏前”的声学响应序列。按下“scan/freeze”以启动数据采集。在注射后4分钟18,19，启动持续0.1秒的高频声学爆破。按下“burst”按钮以执行爆破。</li>
		<li>继续记录序列剩余部分的帧图像（直至缓冲区满），然后按下“cine store”保存动态影像循环。</li>
		<li>额外采集一段循环微泡的动态影像循环。该后续的“破坏后”成像序列被认为仅包含已重新填充至声束区域的循环微泡信号。按下“scan/freeze”以开始成像，并按下“cine store”以采集图像。</li>
		<li>在完成每个胚胎的成像后，对动态影像循环进行标注。按下“study management”，使用轨迹球和“select”按钮高亮选中文件，按下“image label”并进行适当命名。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 显微注射后胚胎的处理
<ol>
	<li>成像后，移动换能器，解除胚胎固定，并根据需要实施安乐死（通过断头、颈椎脱位、二氧化碳窒息，或麻醉后快速冷冻或固定）。</li>
	<li>每进行一次后续胚胎注射时，必须使用新的解剖皿、注射针、注射器和管路段；在解剖和复苏操作期间，应同时准备下一批微泡注射溶液。</li>
	<li>保存组织样本（例如，尾部、脑组织），用于进一步分析（例如，通过PCR分析提取的尾部DNA进行基因分型、lacZ染色，或利用Western blot对生物标志物表达水平进行半定量检测21）。</li>
</ol>

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</ol>

F.S. Foster 承认其担任 VisualSonics Inc. 顾问的角色。

将超声造影剂注入晚期妊娠的小鼠胚胎，并获取非线性对比图像，以测量灌注参数及靶向微泡的结合情况。成功成像胚胎血管系统内的微泡依赖于多个因素，首要因素是胚胎的存活能力。所有设备和器械均需提前准备，以最大限度缩短从子宫中取出胚胎到开始注射之间的时间。由于目前尚未详细研究单次或重复麻醉暴露对胚胎小鼠的影响，因此在母体牺牲前避免使用麻醉剂16。在胚胎分离过程中，应防止卵黄囊受损，并确保胚胎始终保存在频繁更换的新鲜胚胎培养基中并保持低温。在注射前暴露胚胎及固定过程中，应避开主要的卵黄静脉血管，以减少出血风险，因为出血可能致命。我们发现，在复苏胚胎时，最好先用磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖胎盘，再覆盖胚胎，然后前后移动涂抹超声耦合剂，并用镊子清除任何较大的气泡。随后，将平皿其余部分充满PBS。使用耦合剂和PBS可最大限度减少胚胎与探头之间形成气袋的可能性，从而影响图像质量。随着胚胎复苏，血液开始流动，脐动脉可见明显的搏动，而脐静脉则呈现鲜红色23。作为参考，脐静脉在胎盘表面发出的分支通常位于脐动脉分支的上方。尽管可将微泡注射至胎盘迷路区的小动脉，但顺血流方向注射可减少胎盘出血；此外，静脉注射还允许微泡先直接通过...

超声造影成像利用微泡造影剂来可视化并表征血管微环境。这些造影剂可实现对微循环、血管分布及心血管功能的无创性评估。此外，通过对微泡表面进行修饰，可使其靶向结合血管内皮生物标志物，这已在血管生成、动脉粥样硬化和炎症等临床前应用中得到验证1,2，从而实现对血管事件的分子超声成像。因此，超声造影可用于识别影响正常与病变血管状态的复杂且多样的微环境3-5。
近年来，人们对微泡成像在多功能小鼠胚胎模型中应用价值的兴趣日益增加。作为哺乳动物发育的模型，将微泡引入胚胎血管系统可增强对发育中循环系统的生理学研究例如、血流、心输出量）以及心脏疾病转基因和靶向突变小鼠模型的情况 6,7，可能为基因因素如何改变心血管功能提供见解。事实上，对胚胎脑血管系统的定性和定量二维分析已经实现8此外，小鼠胚胎是研究靶向微泡与血管标志物结合的理想模型 体内. Bartelle 等9例如，已将链霉亲和素微泡注入胚胎心室，以评估Biotag-BirA转基因胚胎中靶向结合情况并观察血管解剖结构。杂合子和纯合子小鼠模型的构建也可作为肿瘤模型研究的替代手段，用于界定分子超声成像的定量特性——这是将该技术转化为临床应用的重要基准。
微泡通常通过剖腹手术暴露单个胚胎后，进行心内注射引入胚胎循环系统8-10。In utero（子宫内）注射却面临诸多挑战，包括注射过程中的引导困难、需要克服母体和外露胚胎的运动、维持母体及外露胚胎的血流动力学稳定性、麻醉的长期影响以及出血引起的并发症11。因此，本研究的目标是建立一种将微泡注射到离体存活的晚期胚胎中的技术12。该方法在注射控制与定位方面具有更高的灵活性，可重复获得无遮挡的成像平面，并简化图像分析与定量过程。
在本研究中，我们介绍了一种将微泡注入活体小鼠胚胎的新方法，旨在研究微泡的动力学行为以及靶向微泡与内源性内皮表面标志物的结合特性。采用非线性对比特异性超声成像技术，测量了E17.5期分离胚胎中包括峰值增强（PE）、灌注速率和达峰时间（TTP）在内的多种基本灌注参数。我们还验证了该胚胎模型在评估分子超声定量特性的有效性，使用的是胚胎期endoglin功能缺失的转基因小鼠模型，其中endoglin是一个具有临床相关性的靶点，因其在活跃血管生成部位的血管内皮细胞中高表达13。我们评估了靶向endoglin的微泡（MBE）、大鼠同型IgG2对照微泡（MBC）以及非靶向微泡（MBU）在endoglin杂合子（Eng+/-）和纯合子（Eng+/+）表达胚胎中的黏附情况。对靶向结合的分析表明，分子超声能够区分不同endoglin基因型，并将受体密度与可量化的分子超声信号水平相关联。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt; （生物素标记，eBioscience） &amp;#8212; 抗体的选择取决于实验</td></tr><tr><td>&lt;ul style=&quot;无内容可翻译。&quot;&gt;&lt;李&gt;大鼠同型IgG&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 对照&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>eBioscience</td><td>13-4321-85</td><td>该抗体/微泡组合常被用作实验对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;ul style=&quot;无内容可翻译。&quot;&gt;&lt;李&gt;生物素标记的抗小鼠CD309&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>eBioscience</td><td>13-5821-85</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的大鼠 MJ 7/18 抗小鼠内皮糖蛋白抗体</td><td>自研杂交瘤</td><td></td><td>外部抗体也可能适用：我们&amp;nbsp; 曾使用过 eBioscience（13-1051-85）</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;胚胎培养基&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;ul style=&quot;无内容可翻译。&quot;&gt;&lt;李&gt;500 ml Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;高糖培养基&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul style=&quot;无内容可翻译。&quot;&gt;&lt;li&gt;50 ml 胎牛血清&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>批号 # 7592456</td></tr><tr><td>&lt;ul style=&quot;无内容可翻译。&quot;&gt;&lt;李&gt;Hepes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td>5 ml，1 M</td></tr><tr><td>&lt;ul style=&quot;padding:0px; margin:0px&quot;&gt;&lt;李&gt;青霉素-链霉素&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml，10,000 单位青霉素，10,000 &amp;#956;g Strep</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td>4%</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 [1x]&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>1倍浓度，不含氯化钙 &amp;和氯化镁</td></tr><tr><td>中国台湾，CD-1 孕鼠</td><td>查尔斯河实验室公司&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠（生理盐水）</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-11</td><td></td></tr><tr><td>超声造影剂，靶向与非靶向</td><td>MicroMarker；VisualSonics 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂（Aquasonic 100，无色）</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>细胞培养板（4）：&amp;nbsp; 100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;20&amp;nbsp;毫米</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板（12）：60&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;毫米</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Sorvall Legend RT 离心机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD Falcon 锥形管</td><td>VWR</td><td>21008-938</td><td></td></tr><tr><td>稀释液</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Isoton II 稀释液，8448011</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪（Wagner）</td><td>精细科学工具</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>镊子（2 把），Dumont SS（0.10 × 0.06 mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>镊子，碎屑</td><td>VWR</td><td>25601-134</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯，2 L（Griffin 型烧杯）</td><td>VWR</td><td>89000-216</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管，1 x 90&amp;nbsp;mm GD-1 带灯丝</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃针拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>安塞尔</td><td>4002</td><td></td></tr><tr><td>大体解剖探针</td><td>Fine Science Tools</td><td>10088-15</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>VWR</td><td>89090-994</td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Cole Parmer</td><td>RK 06274-01</td><td></td></tr><tr><td>成像平台</td><td>VisualSonics 公司</td><td>集成轨道系统</td><td></td></tr><tr><td>光源，光纤</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td>理想情况下应具有可调节的臂部</td></tr><tr><td>Luers (12)，聚丙烯倒钩雌接头 &amp;frac14;-28 UNF 螺纹</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>微型超声系统，高频</td><td>VisualSonics 公司</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>21号针头&amp;nbsp; (1&amp;rdquo;)</td><td>VWR</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>粒径分析仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Multisizer 3 库尔特计数器</td><td></td></tr><tr><td>穿孔勺（Moria）</td><td>Fine Science Tools</td><td>MC 17 10373-17</td><td></td></tr><tr><td>大头针（6个），黑色阳极氧化微型针，直径0.15 mm</td><td>精细科学工具</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>移液器 [2-20 &amp;#956;l，20-200 &amp;#956;100-1,000 l &amp;#956;l]</td><td>Eppendorf</td><td>研究增强&amp;nbsp; 可调 3120000038&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 3120000054;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 3120000062</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 [2-200&amp;nbsp;&amp;#956;l，50-1,000&amp;nbsp;&amp;#956;l]</td><td>Eppendorf</td><td>epT.I.P.S.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 22491334;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 022491351</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管，Tygon 实验室 1/32&amp;rdquo; x 3/32&amp;rdquo;</td><td>VWR</td><td>63010-007</td><td></td></tr><tr><td>木制涂抹棒（棉签，棉头）</td><td>VWR</td><td>CA89031-270</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜 5-8倍放大</td><td>Fisher Scientific</td><td>Steromaster</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Normject 注射器</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10个），30 ml</td><td>VWR</td><td>CA64000-041</td><td></td></tr><tr><td>注射泵&amp;nbsp;</td><td>Bio-lynx&amp;nbsp;</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>温度计，-20 至 110&amp;nbsp;&amp;#176;C</td><td>VWR</td><td>89095-598</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>离心管，Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>试管架（3）</td><td>VWR</td><td>82024-462</td><td></td></tr><tr><td>超声换能器，20 MHz</td><td>VisualSonics 公司</td><td>MS250</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯-蒂宾根，向上倾斜</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr></tbody></table>

利用高频超声对小鼠胚胎进行对比成像

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

超声造影增强成像能够提供有关组织血管生成和灌注的重要定量信息，在靶向应用中还可促进在分子水平上检测和测量血管生物标志物。在小鼠胚胎中，这种无创技术可用于揭示早期小鼠循环系统中血管发育的基本机制，以及心血管疾病遗传模型中的相关机制。小鼠胚胎也是研究微泡与血管新生靶点（包括血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）或αvβ3）黏附特性以及评估分子超声定量特征的理想模型。因此，我们建立了一种将超声造影剂引入活体离体胚胎血管系统的方法。该方法在注射控制和位置选择方面具有灵活性，可重复获取无遮挡、无运动干扰的成像平面，并简化图像分析与定量过程。晚期妊娠阶段（胚胎日（E）16.6和E17.5）的小鼠胚胎从子宫中分离后，轻柔地从卵黄囊中取出，并将微泡造影剂注射至胎盘盘绒毛膜表面可及的静脉中。随后采用非线性对比超声成像技术，获取一系列基本灌注参数（峰值增强、流入速率和达峰时间），并在内皮糖蛋白小鼠模型中定量分析靶向微泡的结合情况。我们展示了微泡在活体胚胎中的成功循环，以及该方法在表征胚胎血管系统和微泡行为方面的实用性。

超声造影剂的注射进入 子宫外 小鼠胚胎的存活依赖于从子宫中成功分离出活的晚期妊娠阶段胚胎，并在注射及相关超声成像过程中维持其活力。一旦胚胎被移出并定位，如图所示 图1，可实现向胚胎血管系统精确注射造影剂。图中显示的是 E17.5 小鼠胚胎的典型 B 型超声图像 图2A通过使用非线性对比成像方法，可捕捉到微泡在下腔静脉、心脏、脑部以及整个动物体内的灌注过程及相应的增强效应，从而验证该技术的可行性。各个时间点的情况如图所示。 图 2B 并显示随时间变化的对比度变化。
通过记录微泡团注全过程的流入和清除阶段，可以测量多种灌注参数。在离线分析中，使用对比区域轨迹工具在胚胎左、右脑半球分别创建1.5 mm2的兴趣区（ROI）。然后将这些兴趣区内的平均信号强度随时间变化绘制成曲线，并采用七点中值滤波器进行平滑处理。根据所得的对比强度曲线（见图2C），确定脑部峰值增强程度。流入速率定义为峰值增强（PE）10%至50%之间的...

本文介绍了一种将超声微泡造影剂注射到活体离体晚期妊娠阶段小鼠胚胎中的实验方案。该方法可利用增强型高频超声成像技术，研究胚胎内的灌注参数及血管分子标志物。

超声造影增强成像可提供有关组织血管化和灌注的重要定量信息，并在靶向...

本实验的总体目标是将微泡注入分离的活体小鼠胚胎中，用于增强超声成像。该过程首先从怀孕小鼠体内获取活体 E 16.5 或 E 17.5 胚胎。制备好靶向微泡后，通过胎盘血管网络将微泡注入活体胚胎。最后一步是使用超声成像对微泡进行成像。最终，增强对比超声成像可用于测量胚胎中的血管灌注参数，并评估靶向微泡的结合情况。通常，初次接触该方法的研究人员在操作胚胎处理和注射步骤时会遇到困难，需要经过充分练习才能掌握实验所需的显微注射针和镊子施加的适当压力。本实验操作演示将由本实验室的实习生 Brian Nixon 完成。为重悬靶向即用型试剂瓶，首先将 20 微克抗体溶液稀释至一毫升生理盐水的终体积。将试剂瓶置于冰上保存。接下来，用一毫升生理盐水填充注射器。去除所有气泡。安装一个21号针头，将溶液缓慢注入微泡瓶中。缓慢回抽活塞，抽出一毫升空气，然后拔出针头。轻轻振荡小瓶，并将其置于冰上静置五分钟。五分钟后，用新的注射器吸取抗体稀释液，加入相应的样品管中。振荡后，轻柔地使混合液体积达到两毫升。置于冰上静置10分钟。为重悬未标记的小瓶，用注射器吸取1毫升生理盐水。去除所有气泡。安装一个21号针头，将溶液缓慢注入一个新的微泡瓶中。缓慢回抽活塞，抽出1毫升空气，然后拔出针头。轻轻振荡，并静置5分钟。加入额外的一毫升生理盐水使总体积达到两毫升后，轻轻振荡并置于冰上静置10分钟。轻轻振荡所需微泡小瓶后，使用带21号针头的一毫升注射器抽取约50微升溶液。然后将微泡注入一个空的两毫升微量离心管中。接下来，用移液器将10微升微泡原液样品加入10毫升稀释液中。轻轻混匀后，采用库尔特计数法评估微泡群体的浓度和粒径分布。每瓶样品至少进行三次50微升的测量计数。使用30微米孔径。此步骤与向胚胎注射微泡同时进行。当手术者正在注射胚胎时，助手准备下一次注射，以确保手术者对所注射微泡的类型保持盲态。确定所需储存气泡溶液的体积，以在 400 微升的总体积中产生每毫升 1 亿个微泡的终浓度。将相应体积的生理盐水分装至一个空的微量离心管中。轻轻振荡所选的微泡小瓶后，使用带 21 号针头的 1 毫升注射器抽取略多于所需体积的溶液。然后将微泡注入一个空的微量离心管中。接着，用移液器吸取所需体积的微泡储备液，加入到四联瓶的生理盐水中。用移液器尖端轻轻搅拌混合。然后使用21号针头将稀释后的微泡溶液吸入一支洁净的注射器中。取下针头后，排出注射器中的任何气泡，并连接诱捕装置和管路。缓慢推动溶液至管路末端，注意避免产生气泡。最后，将注射器插入注射泵，设置流速为每分钟20 µL，以输送微泡。对于总体积为20 µL的情况，将拉制的玻璃针连接到管路末端。将泵移至靠近注射平台的位置。使用带孔的勺子从冷藏的培养基培养皿中随机选取并取出一个胚胎。将该胚胎置于体视显微镜下超声波台上的解剖培养皿中。接着，找到胚胎上血管化程度最低的一侧。此处为血管化程度较低的区域，通常位于头部附近。然后使用精细镊子仅剪开或撕开少量卵黄囊和羊膜，以便能够取出胚胎，但不要过度撕扯。接下来，轻柔地将囊膜从胚胎周围分离。然后将胚胎侧放，使胎盘和脐血管位于前方。使用四个昆虫针将卵黄囊和胎盘边缘固定在解剖皿中，并用少量塑料泥固定解剖皿，注意避开主要血管，使用含有预热液体的注射器，温度为45摄氏度。用 PBS 清洗胚胎，直至可见血液流入胚胎。脐动脉可通过搏动性的鲜红色血液辨认。脐静脉及其相关的血管网络血液颜色较暗，且在胎盘侧通常位于脐动脉血管的上方。此时，调整培养皿的位置以便于舒适地进行注射。胚胎复苏后，仅覆盖胚胎，不要覆盖胎盘。使用预热的超声耦合剂，并用精细镊子小心去除胚胎周围的所有气泡，在整个操作过程中用预热的PBS补充培养皿中的液体。注意观察 PBS 和凝胶注射器中的溶液液面，必要时向加热烧杯中补充备用注射器。接着，将玻璃针固定在解剖皿边缘的一块较大塑料黏土球上，并将针尖插入 PBS 中。在胎盘盘膜的绒毛膜表面选择一条静脉，位置应尽可能远离主分支。然后使用剪刀修剪针头尖端，使其与血管大小相匹配。将尖端剪成轻微斜角。使用弹簧剪刀的边缘去除玻璃的任何毛刺边缘。现在，使用注射泵以每分钟 20 微升的速度将微泡溶液缓慢注入玻璃针头，直至针尖处的所有空气被完全排出，且可见微泡自由流入 PBS 溶液中。停止泵注并将其重置为 20 微升的注射体积。注意避免空气进入注射针头，以防将空气注入胚胎的血管系统。将玻璃针头轻轻插入胎盘中选定的静脉，并确保其固定不动。移开体视显微镜镜筒，调整超声探头位置，使胚胎位于6毫米和10毫米焦点之间且居中。随后开始成像，在一分钟后启动微泡的团注注射；注射完成后，立即启动计时器，进入数据采集阶段。此B模式超声图像显示了在注射靶向微泡前立即暴露的E17.5胚胎。该非线性对比增强超声图像显示了注射微泡前的胚胎，此时仅有骨骼等强反射界面可见，而软组织信号极弱。注射微泡后，整个动物体内的对比度得到增强，包括下腔静脉、心脏和大脑。通过在胚胎脑部单个感兴趣区域内绘制微泡强度随时间变化的曲线图，可识别出多种灌注参数，包括峰值增强程度或由斜率反映的微泡灌注速率（pe wash-in rate），以及达峰时间（TTP）。内皮糖蛋白（endoglin）靶向微泡所获得的平均对比中值功率比显著高于对照组非靶向微泡的结果。此外，在 ogly plus plus 胚胎中，内皮糖蛋白靶向微泡的结合率显著高于 ogly plus minus 胚胎。一旦掌握，只要操作得当，每个胚胎的注射和成像可在15分钟内完成。

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