用于ICPMS样品引入的微流控芯片

本实验的总体目标是通过电感耦合等离子体质谱法（I-C-P-M-S）生成并定量分析含有单个细胞或水溶液的单分散微滴的元素组成。首先，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模塑技术制备微流控芯片；第二步，将注射泵连接至微流控芯片。

泵将提供水相样品以及高度挥发性且可接受的或有机载流相PFH。当启动注射泵时，微流控芯片通过PFH的流动聚焦作用，生成水相样品溶液或细胞悬浮液的单分散液滴，并利用额外的PFH将这些液滴以液流形式从芯片中喷出。最后一步是将芯片插入一个传输组件中，该组件包含一个蒸发液滴的筒式加热器和一个在离子化及通过ICP-MS检测液滴内容物之前去除溶剂的膜脱溶剂装置。

最终，通过记录的信号以及标准溶液的校准测量，可确定悬浮液样品或细胞的元素组成。与现有方法相比，我们这种微流控技术的主要优势在于液滴尺寸可调、样品消耗量低，以及在处理细胞悬浮液或高浓度盐溶液时不易发生堵塞。此外，低成本的一次性微流控芯片避免了清洗时间，消除了交叉污染的风险。

示范该操作的将是来自 GTA 教授实验室的博士研究生 all vin sc 和来自我实验室的博士研究生 Pascal Fabrica。开始微加工过程时，先在较大的塑料皿中称取 40 克 PDMS 和 4 克 PDMS 固化剂。用刮刀将两组分充分混合均匀，然后将容器放入真空干燥器中抽真空 20 至 30 分钟，以去除混合物中的所有气泡。

脱气过程中，将一个浇铸模具置于微结构硅片上方，并利用设计周围的导向结构将其卡在平整的硅片上固定到位。再将另一个浇铸模具自由地放置在上方。

将约三到四克的脱气PDMS混合物倒入两个铸造模具中。将两片硅片转移至加热板上，在150摄氏度下固化PDMS六分钟，然后冷却。

在室温下，使用金属刮刀将固化后的PDMS结构从台面上取下。小心地将固化的PDMS块从模具中分离。保护两个PDMS块的键合表面，避免颗粒和指纹污染。

通过贴上一层透明胶带，现在可以用剪刀对PDMS部件进行操作并修剪至所需尺寸。修剪后，从微结构PDMS块上去除胶带，并使用活检打孔器制作微流控进样口。至此，该装置的微结构半部分制备完成，现已可与其平整的对应部分进行键合和组装。

为进行PDMS与PDMS的键合，首先将PDMS固化剂以6,000 RPM的转速旋涂于一片空白硅片上，持续30秒；在固化剂仍处于湿润状态时，立即将微结构化PDMS块的键合面与硅片接触，并在PDMS上方轻轻施加压力，以形成无气泡的无缝密封。另一步骤中，从平整的对应部分上移除保护胶带。然后缓慢地将微结构化PDMS从硅片上剥离下来。

仔细对齐两块PDMS，并使两个键合界面接触。轻轻挤压两块PDMS以去除界面间的气泡，并将组装好的PDMS芯片在室温下固化24小时。使用 utility knife 和对准装置，沿指示线垂直于出口喷嘴方向进行切割。在显微镜下检查芯片，观察暴露的出口喷嘴附近是否存在修整缺陷和颗粒污染。

在评估完制备质量后，即可对PDMS微通道的内表面进行硅烷化处理。在化学通风橱中，将沃尔夫瓶的一端连接至干燥氮气源，另一端连接至PDMS芯片的进样口。通过连接至中央歧管的多根管路，将50微升硅烷试剂用移液器加入沃尔夫瓶中，然后密封瓶盖。

打开氮气载气流，以每秒约一毫升的流速，用含盐水蒸气吹洗微通道20分钟。最后，将入口管路从wolf瓶上断开。涂覆后的PDMS芯片可用于单细胞质谱分析的质谱实验。

首先，用适当的缓冲液稀释输入样品，使有效细胞浓度低于每毫升1000万个细胞。为质谱分析做准备时，先将管路连接至样品注射器。用两个5毫升注射器分别装入PFH，并将输入样品装入另一个1毫升注射器中。去除注射器和管路中所有 trapped 气泡，并将这两个注射器装载到注射泵上。

确保运输管正确对齐，并连接所有气体管路。接下来，将注射器管路连接到PDMS芯片的入口端口，并启动注射器泵，运行三至五分钟。在此流动稳定过程中，用纸巾清除出口端口处的多余液体。

如果流出的液体在芯片出口处未形成直线射流，五分钟后，尝试用干净的纸巾擦拭芯片出口处可能存在的堵塞物。若仍不成功，则丢弃现有芯片，并更换新的芯片重新连接。

从旋风式喷雾器适配器上取下堵头，小心地将流动稳定的PDMS芯片插入适配器中。根据推荐设置调节流速，并使流动重新稳定两到五分钟。同时，调节所有气体的流速，直至目标分析物的信号强度达到最大。

此外，在信号优化过程中，调节等离子体功率和质谱仪的聚焦透镜电压，以进一步增强信号强度。将质谱仪的驻留时间设置为10毫秒，并开始数据采集。测量完成后，将原始数据传输至数据分析软件。

在典型的数据分析流程中，所有测量值首先被划分为若干数据区间，每个区间代表在 10 毫秒停留时间内记录的计数数量，随后为所有区间生成直方图，并用高斯分布函数进行拟合。单个拟合结果的均值和分布范围分别代表特定质荷比下的信号强度均值和标准偏差。开始校准过程时，首先以与样品相同的流速测量标准溶液。

使用PDMS芯片进行液滴生成，为PFH准备两个5 mL注射器，为标准溶液准备一个1 mL注射器。然后将培养皿用作显微镜样品 holder，将PDMS芯片置于培养皿中，并参照先前的实验步骤，在低倍镜下将芯片调至清晰对焦。使用高速相机在PDMS微通道中稳定液滴生成3至5分钟。

在次级交汇处开始记录芯片上水相液滴的图像，以从记录结果中获得液滴的平均直径。使用配备专用液滴形态、验光和速度对称分析套件的图像分析软件。假设每个液滴可被建模为球形物体，则可通过软件获得的平均液滴直径估算平均液滴体积。

接下来，将样品中已知的分析物浓度除以平均液滴体积，得到单个液滴中所含分析物的质量。然后将所得质量转换为原子数目。最后，通过将每个液滴测得的离子数除以上一步所得的原子数，计算出总体检测效率。

现在可将该检测效率用作校准参数，以确定未知样品中的原子数量。利用微流控液滴发生器，可将单个细胞包裹在平均直径小于50微米的单分散水相液滴中，并通过电感耦合等离子体质谱法（I-C-P-M-S）进行分析。在样品到达电感耦合等离子体质谱检测器之前，包裹水相液滴的有机相全氟己烷（PFH）鞘层可被轻松去除。

在测量溶液时，高单分散性液滴可表现为在给定驻留时间内，来自单个双液滴或三液滴计数的信号组之间具有较低的变异度。经过适当校准后，可确定悬浮于单个液滴中的单个牛红细胞群体中的铁含量。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和使用这些微流控芯片，以对极小体积样品或单个颗粒、单个细胞进行定量元素分析。

若操作得当，每枚芯片的制备所需实际操作时间少于15分钟。此外，这些易于修改的芯片可集成更多微流控模块，用于高级样品预处理，并实现样品与标准品的同步引入，从而提高检测效率和样品通量。