Name: 修改后的孔板 - 测量行为，认知和社会互动小鼠和大鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习使用改良孔板实验方法评估小鼠和大鼠的非条件性行为与认知能力。该技术结合开放场与传统孔板特征，可在单一范式中全面分析动物行为表现与认知灵活性。

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作者谨此感谢 Annemarie Baars 和 José Lozeman-van ‘t Klooster 在使用 mHB 装置进行实验、协助实验及教学过程中所做出的贡献。

注意：本实验已获得荷兰乌得勒支大学医学中心和乌得勒支大学动物实验委员会的批准。此外，动物实验遵循实验室动物护理原则，并参照《神经科学与行为研究中哺乳动物护理与使用的指南》25。
1. 实验设置
注意：标准的 mHB 装置由一个灰色 PVC 实验箱（100 × 50 × 50 cm）组成，通过一块透明带孔隔板与另一个附加隔室（50 × 50 × 50 cm）分隔开，实验动物的同笼伙伴可在测试期间被放置于该附加隔室中1。如果不需要同笼伙伴的存在，或在对单笼饲养动物进行测试时，应将透明隔板替换为灰色 PVC 制成的隔板（图1；另见 Ohl et al. (2001)1）。用于认知测试的 mHB（尺寸不同）在本方案第5节中进行了描述。
<ol>
	<li>将板子（60 × 20 × 0.5 cm，由灰色PVC制成）放置在箱子中央。 
	注意：该板子可容纳20个圆柱体（ᴓ 1.5 cm）14，呈两列交错排列，或23个圆柱体（ᴓ 3 cm）8，呈三列交错排列。</li>
	<li>用黑线将板子周围的区域划分为10个矩形（20 × 15 cm）和2个正方形（20 × 20 cm）。</li>
	<li>在板子上方设置舞台灯，以增强板子（代表无保护区域，类似于开阔场中心或明暗转换实验中的明室）与箱子（保护区域）之间的光照强度对比，从而增强板子的厌恶特性4,8。</li>
	<li>将动物饲养在12小时反转的昼夜循环条件下（例如，上午7:00关灯，晚上7:00开灯）。 
	注意：然而，mHB也可在常规光照周期下使用（参见关于潜在局限性的讨论）1,6。</li>
	<li>在动物最活跃的阶段进行行为测试（例如，上午10:00至下午2:00之间）4,15。</li>
	<li>动物到达实验设施后，维持2周的适应期。在此期间，由同一名实验人员每周四次对动物进行操作，并包含实际测试中将执行的所有操作步骤。仅在动物后续接受测试的时间段内对其进行操作。</li>
	<li>将实验过程录像以保存数据；为优化结果并减少观察者间的差异，使用以往实验的录像视频练习行为评分2。确保标准化观察者执行的所有操作和流程。</li>
</ol>
2. 行为学测试——无同伴存在条件下
<ol>
	<li>在动物常规饲养的房间内进行行为学测试（以避免运输至测试地点可能带来的影响），并在动物到达实验场所前安装好所有测试设备（使动物能够适应设备的存在）。</li>
	<li>用一只手抓住动物尾巴根部，从其饲养笼中取出，直接放入mHB中。</li>
	<li>将每只动物放置于装置的同一角落，使其朝向墙壁（如图中所示）。 图1).</li>
	<li>让动物在mHB中自由探索一段时间（通常为5 min）1,6,16-18).</li>
	<li>由经验丰富的观察者使用行为评分软件实时记录行为参数。采用以下所列参数： 表1. 
	注意：某些行为参数（例如， 运动和探索行为）可能被自动评分 例如， 由 Henry 讨论 等 (2010)19 在对 mHB 进行必要调整后。</li>
	<li>每次试验后，用自来水和纸巾清洁仪器，以避免因嗅觉线索造成的偏差。 
	注意：测试群养动物时，应考虑可能存在的测试顺序效应17,20.</li>
</ol>
3. 行为学测试——在群体同伴存在下的测试
<ol>
	<li>在群养条件下，测量实验动物在测试期间与其笼内同伴的互动情况。
	<ol>
		<li>在测试实验动物前，将群养同伴放入群养区，使其适应环境（通常为10–30分钟1,12）。 
		注意：通过在测试社会性受挫个体时，将具有支配地位的笼内同伴置于群养区，可实现社会应激条件下的测试13。</li>
		<li>将实验动物放入测试区，使其自由探索mHB，操作方法如第2节所述。 
		注意：测试群养动物时，应考虑可能存在的测试顺序效应17,20。</li>
		<li>由经验丰富的观察者使用行为评分软件实时记录行为参数。所用参数见表1。</li>
		<li>每次试验结束后，用自来水和纸巾清洁装置，以避免因嗅觉线索导致的偏差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 新物体识别与摄食抑制
<ol>
	<li>在实验前2天，让动物在它们的饲养笼内熟悉一个物体（例如一个骰子或食物颗粒）。</li>
	<li>将已熟悉的物体与一个新物体（例如一个螺栓或不熟悉的食饵）分别放置在装置内，两者相距2 cm，并置于起始点对角的角落。</li>
	<li>记录动物接近新物体和熟悉物体/食物所需的时间。使用表1中的参数。</li>
	<li>每次试验后，用自来水和纸巾清洁装置，以避免因嗅觉线索造成的偏差。</li>
</ol>
5. 认知测试
<ol>
	<li>放置一块较小的板子（35 x 22&#160;x 1 厘米）的盒子中央放置 10 个圆柱体（图1用于大鼠测试3,22将箱子缩小至 50 x 50 cm 以用于小鼠测试21 由&#160;插入由灰色PVC制成的隔板。</li>
	<li>用动物喜好的气味对所有圆筒进行气味处理（例如， 香草）并用奖励诱使所有目标（例如， 一块杏仁（对小鼠和大鼠而言具有高度适口性的奖励物），置于网格下方，使动物无法将其取出。</li>
	<li>带有彩色环（与灰色PVC形成对比）的提示圆柱体（通常为三个），并用可移除的奖励物进行诱饵处理例如， 0.05 g 杏仁样品</li>
	<li>在实验前2天，每天在动物的饲养笼内用镊子给予奖励物，让动物熟悉并确保其食用。</li>
	<li>由经验丰富的观察者使用行为评分软件实时记录行为参数。测量以下所列参数： 表2 除了第2节中提到的行为参数外表1）但与物体识别或食物摄入抑制相关的参数除外。</li>
	<li>第1阶段：对每只动物每天进行四次试验，每次试验之间保持恒定的间隔时间（例如， 30-60 分钟），直至达到完成一次试验所需的恒定时间即， 当收集完所有三块杏仁后）。</li>
	<li>第二阶段：对三个不同的圆筒进行提示和诱饵处理，将动物放入装置中进行四次试验，以测试其逆转学习能力。</li>
	<li>每次试验后用自来水和纸巾清洁装置，以避免因嗅觉线索而产生偏差。</li>
</ol>

<ol><li>Ohl, F., Holsboer, F., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+hole+board+as+a+differential+screen+for+behavior+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Res.+Methods+Instrum.+Comput%22%5BJournal%5D)">The modified hole board as a differential screen for behavior in rodents.</a> Behav. Res. Methods Instrum. Comput. 33 (3), 392-397 (2001).</li>
<li>Ohl, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhl%2C+F+%22Anxiety+and+Anxiolytic+Drugs%22">Anxiety and Anxiolytic Drugs</a>. Holsboer, F., Ströhle, A. 169, Springer. 35-69 (2005).</li>
<li>Staay, F. J., Gieling, E. T., Pinzon, N. E., Nordquist, R. E., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+appetitively+motivated+%27cognitive%27+holeboard%3A+A+family+of+complex+spatial+discrimination+tasks+for+assessing+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">The appetitively motivated 'cognitive' holeboard: A family of complex spatial discrimination tasks for assessing learning and memory.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36 (1), 379-403 (2012).</li>
<li>Salomons, A. R., van Luijk, J. A., Reinders, N. R., Kirchhoff, S., Arndt, S. S., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+emotional+adaptation%3A+Behavioural+habituation+to+novelty+and+immediate+early+gene+expression+in+two+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Identifying emotional adaptation: Behavioural habituation to novelty and immediate early gene expression in two inbred mouse strains.</a> Genes Brain Behav. 9 (1), 1-10 (2010).</li>
<li>McIlwain, K. L., Merriweather, M. Y., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+behavioral+test+batteries%3A+Effects+of+training+history%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The use of behavioral test batteries: Effects of training history.</a> Physiol. Behav. 73 (5), 705-717 (2001).</li>
<li>Ohl, F., Sillaber, I., Binder, E., Keck, M. E., Holsboer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+analysis+of+behavior+and+diazepam-induced+alterations+in+C57BL%2F6N+and+BALB%2Fc+mice+using+the+modified+hole+board+test%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Psychiatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential analysis of behavior and diazepam-induced alterations in C57BL/6N and BALB/c mice using the modified hole board test.</a> J. Psychiatr. Res. 35 (3), 147-154 (2001).</li>
<li>Hanell, A., Marklund, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+evaluation+of+rodent+behavioral+tests+used+in+drug+discovery+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structured evaluation of rodent behavioral tests used in drug discovery research.</a> Front Behav Neurosci. 8 (252), (2014).</li>
<li>Laarakker, M. C., van Lith, H. A., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+characterization+of+A%2FJ+and+C57BL%2F6J+mice+using+a+multidimensional+test%3A+Association+between+blood+plasma+and+brain+magnesium-ion+concentration+with+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavioral characterization of A/J and C57BL/6J mice using a multidimensional test: Association between blood plasma and brain magnesium-ion concentration with anxiety.</a> Physiol. Behav. 102 (2), 205-219 (2011).</li>
<li>Kooij, M. A., Ohl, F., Arndt, S. S., Kavelaars, A., van Bel, F., Heijnen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+neonatal+hypoxia-ischemia+induces+long-term+motor-+and+cognitive+impairments+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mild neonatal hypoxia-ischemia induces long-term motor- and cognitive impairments in mice.</a> Brain. Behav. Immun. 24 (5), 850-856 (2010).</li>
<li>Boleij, H., Salomons, A. R., van Sprundel, M., Arndt, S. S., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+all+mice+are+equal%3A+Welfare+implications+of+behavioural+habituation+profiles+in+four+129+mouse+substrains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Not all mice are equal: Welfare implications of behavioural habituation profiles in four 129 mouse substrains.</a> PLoS One. 7 (8), e42544(2012).</li>
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<li>Erhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+chronic+social+stress+on+behaviour+and+vasopressin+gene+expression+in+the+PVN+of+DBA%2F2OlaHsd+mice-influence+of+treatment+with+the+CRHR1-antagonist+R121919%2FNBI+30775%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Psychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Consequences of chronic social stress on behaviour and vasopressin gene expression in the PVN of DBA/2OlaHsd mice-influence of treatment with the CRHR1-antagonist R121919/NBI 30775.</a> J. Psychopharmacol. 23 (1), 31-39 (2009).</li>
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<li>Roedel, A., Storch, C., Holsboer, F., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+or+dark+phase+testing+on+behavioural+and+cognitive+performance+in+DBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Effects of light or dark phase testing on behavioural and cognitive performance in DBA mice.</a> Lab. Anim. 40 (4), 371-381 (2006).</li>
<li>Arndt, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+housing+of+mice--impact+on+behaviour+and+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Individual housing of mice--impact on behaviour and stress responses.</a> Physiol. Behav. 97 (3-4), 385-393 (2009).</li>
<li>Salomons, A. R., Arndt, S. S., Lavrijsen, M., Kirchhoff, S., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CRFR1+and+Glu5R+mRNA+in+different+brain+areas+following+repeated+testing+in+mice+that+differ+in+habituation+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of CRFR1 and Glu5R mRNA in different brain areas following repeated testing in mice that differ in habituation behaviour.</a> Behav. Brain Res. 246, 1-9 (2013).</li>
<li>Henry, B. L., Minassian, A., Young, J. W., Paulus, M. P., Geyer, M. A., Perry, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+assessments+of+motor+and+exploratory+behavior+related+to+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cross-species assessments of motor and exploratory behavior related to bipolar disorder.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 34 (8), 1296-1306 (2010).</li>
<li>Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+ranking+of+genetic+and+laboratory+environment+factors+influencing+a+behavioral+trait%2C+thermal+nociception%2C+via+computational+analysis+of+a+large+data+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Identification and ranking of genetic and laboratory environment factors influencing a behavioral trait, thermal nociception, via computational analysis of a large data archive.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 26 (8), 907-923 (2002).</li>
<li>Ohl, F., Roedel, A., Binder, E., Holsboer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high+and+low+anxiety+on+cognitive+performance+in+a+modified+hole+board+test+in+C57BL%2F6+and+DBA%2F2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impact of high and low anxiety on cognitive performance in a modified hole board test in C57BL/6 and DBA/2 mice.</a> Eur. J. Neurosci. 17 (1), 128-136 (2003).</li>
<li>Gordan, M. L., Jungwirth, B., Ohl, F., Kellermann, K., Kochs, E. F., Blobner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+neurobehavioral+deficits+following+different+severities+of+cerebral+ischemia+in+rats%3A+A+comparison+between+the+modified+hole+board+test+and+the+morris+water+maze+test%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of neurobehavioral deficits following different severities of cerebral ischemia in rats: A comparison between the modified hole board test and the morris water maze test.</a> Behav. Brain Res. 235 (1), 7-20 (2012).</li>
<li>Salomons, A. R., Arndt, S. S., Ohl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anxiety+profiles+on+cognitive+performance+in+BALB%2Fc+and+129P2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cogn.+Affect.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impact of anxiety profiles on cognitive performance in BALB/c and 129P2 mice.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 12 (4), 794-803 (2012).</li>
<li>Guilloux, J., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+behavioral+z-scoring+increases+the+sensitivity+and+reliability+of+behavioral+phenotyping+in+mice%3A+Relevance+to+emotionality+and+sex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: Relevance to emotionality and sex.</a> J. Neurosci. Methods. 197 (1), 21-31 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , Eighth edition, National Research Council. Washington, D.C.. (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

mHB 范式可用于测量非条件行为的多个维度。根据实验目的的不同，该方案可稍作调整。在本方案中，我们讨论了本实验室通常使用的设备设置、时间和测量参数。然而，过去也曾使用过对设备尺寸的轻微调整，板上圆柱体的数量也可能有所不同3。许多研究采用每次试验5分钟的测试时间，但其他测试时长也可能适用，例如&#160;在动物成功完成一次认知试验后立即结束测试，或在动物表现出极度焦虑或存在身体功能障碍时延长测试时间。选择在红光条件下进行测试，是因为啮齿类动物为夜行性，在黑暗期初期最为活跃。Roedel et al.（2006）展示了在 mHB 任务中，光照或黑暗期测试对 DBA 小鼠行为和认知表现的影响16。也有其他研究在白光条件下进行 mHB 实验1,6，但应注意，白光条件下的测试可能引起行为抑制和认知干扰（已在 DBA 小鼠中证实）16。
表1 和 2 包含大量可测量的行为参数。在数据分析过程中，可能会出现某些参数显示例如“首次进入平台的潜伏期”显著增加，而同一动机系统中的其他参数（在本例中为“回避”）则未显示显著变化的情况。在某些情况下，这可能导致结果不明确。Guilloux 等 (2011) 年将整合行为 z 分数引入小鼠行为表型分析24通过使用整合的行为z分数，可将多个参数合并为一个描述特定动机系统的单一z分数。随后，这些z分数将更便于在不同行为测试和实验之间进行比较。
除了该范式所描述的特征外，Salomons 的研究中还显现出更深层次的应用 等 (2012). 比较了两种小鼠品系（BALB/cJ 和 129P3/J）在 mHB 中对新奇环境的习惯化表现，结果显示其行为灵活性存在差异，提示 129P3/J 小鼠具有非适应性行为特征4，反映了适应能力受损，可能甚至伴随病理性焦虑。
总之，微型霍尔博德装置（mHB）能够在单次实验中测量多种行为学维度。通过整合传统霍尔博德实验和开放旷场实验的特征，可同时评估非条件性行为、社会互动、认知功能及适应能力。 即， 可通过该测试评估药理学和/或遗传学操作、选择性育种及适应能力所引起的行为变化，从而研究动物福利。与经典测试组合相比，该方法所需实验动物数量明显减少，且动物在测试过程中所经历的应激程度极低。

改良型孔板（mHB）用于评估多种非条件性行为维度，主要应用于小鼠和大鼠1。目前许多广泛应用的行为学检测方法仅能测量单一行为参数，无法全面覆盖某一行为维度的完整表型。mHB基于以下理念开发：只有在丰富化的测试环境中，啮齿类动物才能充分展现其复杂多样的行为谱2，因此该方法支持进行复杂的动物行为学观察。
该装置结合了传统孔板实验和敞箱实验的特点，形成了一种单一的复合范式，克服了测试组合的缺点即， 在减少实验动物使用数量方面1,3,4，避免测试顺序可能带来的影响5，缩短耗时，降低成本6).&#160; 与大多数行为学实验不同（例如， Hånell &amp;#38; Marklund, 2014)7mHB 的一个优势在于，无需通过食物剥夺来提高动物完成任务的动机。此外，测试过程中可通过将实验动物的同笼伙伴安置于相邻的（群体）隔间内，以透明的带孔隔板将群体隔间与测试隔间分隔开，从而避免社会孤立，使动物之间保持视觉、听觉和嗅觉接触。8,9.
mHB 已在药理学上对小鼠和大鼠进行了验证1,6。可测量多种行为，包括回避行为、风险评估、觉醒状态、探索行为、运动活动、习惯化、社会亲和力以及认知功能2,8-10。此外，mHB 还可与摄食抑制实验以及新物体识别实验相结合使用10,11。最后，通过将具有支配地位的个体放置于群体隔室中，对经历社会挫败的动物进行测试，mHB 还可用于开展社会应激实验12,13。本针对小鼠和大鼠的实验方案将概述 mHB 的多种应用。

<table><tbody><tr><td>认知mHB装置</td><td></td><td></td><td>通过在标准mHB中插入灰色PVC隔板，构成一个50 cm × 50 cm的认知测试箱。在箱体中央放置一块较小的板（35 cm × 22 cm × 1 cm），板上设有10个圆柱体。所有圆柱体均用动物喜好的气味（如香草味）进行气味处理，并在网格下方放置奖励物（如一片杏仁），使动物无法取出。其中若干个圆柱体（通常为三个）配有彩色环（颜色与灰色PVC形成对比），并在网格下放置可取出的奖励物（如0.05 g杏仁片）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>香草味溶液</td><td></td><td></td><td>将香草味溶解于水中（0.02%）</td></tr><tr><td>摄像机</td><td></td><td></td><td>能够生成足够高质量视频输出的摄像机，以便从录像中重新评分动物行为。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>舞台灯</td><td></td><td></td><td>一种剧场用灯，可调节光照强度以及被照亮区域的范围。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>行为评分软件</td><td></td><td></td><td>用于行为评分的软件。</td></tr></tbody></table>

改良型孔板实验——测量小鼠和大鼠的行为、认知与社会互动

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

本方案描述了改良型孔板（mHB），该方法结合了传统孔板和开放旷场的特点，旨在测量小型实验哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、树鼩和小型灵长类动物）的多种非条件性行为维度。该范式是行为测试组合的一种有效替代方案，因为仅通过一次测试即可全面考察动物行为谱的多个方面。
该装置由一个代表“受保护区域”的箱子和一个隔离的群体隔间组成。箱子中央放置一块木板，木板上以三行交错排列着若干小圆柱体，代表实验设置中的“非受保护区域”。通过在木板上的部分圆柱体中放置诱饵，可测量动物的工作记忆和参考记忆，从而评估其认知能力。此外，利用该范式还可观察其他非条件行为，如与活动相关的行为、与焦虑相关的行为以及社交行为。通过让动物在多轮试验中接受改良型霍恩斯黑箱（mHB）测试，还可观察其行为灵活性以及对新环境的适应能力，从而深入了解动物的适应潜能。
由于行为测试组合中存在测试顺序效应，每个独立实验应使用未经训练的动物。通过在单一范式中测试多种行为维度，从而避免了这一问题，减少了实验动物的使用数量。此外，由于在测试过程中避免了社会隔离，且无需对动物进行食物剥夺，mHB 代表了一种行为测试系统，即使有，也仅引起极低程度的应激反应。

在mHB中可测量的参数数量众多，这使得该装置特别适合用于测量多种行为维度。其中一个例子是通过重复进行测试来识别动物对新环境的行为适应。Salomons 等（2010）研究了两种近交系小鼠（BALB/cJ和129P3/J）在两种不同光照条件下对mHB的适应情况（红光：箱体与踏板之间的对比度：45 lux；白光：箱体与踏板之间的对比度：115 lux（参见实验方案第1.3节））4。在红光条件下，BALB/cJ小鼠首次进入踏板的潜伏期逐渐缩短（呈现适应趋势）（见表1），如图2A所示。相比之下，129P3/J小鼠在多次试验中未表现出任何适应迹象。图2B展示了在白光条件下的实验结果。BALB/cJ小鼠在多次试验中再次表现出首次进入踏板潜伏期的下降趋势，尽管其适应模式相较于红光条件下更为缓慢。129P3/J小鼠不仅再次表现出适应能力受损，还在白光条件下呈现出敏感化的趋势。类似地，在Salomons（2012）的一项研究中，129P2/OlaHsd小鼠相较于BALB/cOlaHsd小鼠在应对新奇刺激时表现出行为灵活性受损23。因此，当在mHB中进行测试时，两种近交系小鼠在适应能力上的差异变得明显4。
例如，mHB 的认知版本可用于测量小鼠的认知功能障碍。Van der Kooij 等. (2010) 采用该装置评估了经历轻度脑缺氧缺血（45 分钟缺氧；HI-45）、重度缺氧缺血（75 分钟缺氧；HI-75）的 C57BL/6J 小鼠以及假手术对照组小鼠的认知功能9。完成试验的能力（即，在 5 分钟内找到有食物的孔）如图 3A所示。短期记忆错误次数（重复访问已有食物的孔）、长期记忆错误次数（访问无食物的孔）以及遗漏错误次数（未访问有食物的孔）分别如图 3B-D所示。
为了确认HI-45组未出现认知功能障碍，对该组动物与假手术对照组进行了反转任务测试。将三个有食物的孔分配至三个不同的圆柱体中，动物共进行4次试验。通过比较第一阶段最后一次试验与反转阶段第一次试验的结果，可观察到反转效应。完成四次反转试验所需的时间可反映整体表现。图4展示了两组完成每次试验的潜伏期，显示出明显的整体处理效应。这表明在反转任务中，HI-45组确实存在认知灵活性（重新学习）的损伤，而该损伤可通过mHB9检测出来。
<img alt="物体识别实验装置示意图；标注测试区域的隔间。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 改良型孔板的示意图。（A） 实验装置包括一个测试隔间（箱体），中央为用锯齿线表示的（无保护）板，以及群体隔间。<img alt="色谱图；流程、分离原理、化学分析、实验技术。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> = 新物体，<img alt="静力平衡，ΣFx=0，ΣFy=0，带力矢量的示意图，展示结构上的力平衡。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> = 熟悉物体，<img alt="带有“开始”符号的静力平衡流程图。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> = 起始点。（B） 小鼠改良型孔板认知版本的示意图。（C） 改良型孔板认知版本中所用圆柱体的侧视图。所有圆柱体网格下方均放置一块杏仁。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52529/52529fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为反应图，比较 BALB/cJ 和 129P3/J 小鼠在 20 次试验中的潜伏期与试验次数。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 红光或白光条件。(A) BALB/cJ 和 129P3/J 小鼠在红光条件下（箱体 0–5 lux，踏板 45 lux）首次登上踏板的潜伏期（均值 + 标准误）。采用 Huynh-Feldt 校正的重复测量方差分析显示，品系（P = 0.025）、试验次数（P &lt;0.001）以及试验次数 × 品系交互作用（P &lt;0.001）均具有显著效应。事后分析：品系间比较：* = P &lt;0.0026；连续两次试验间比较：$ = P &lt;0.0026（BALB/cJ）。(B) 在白光条件下（箱体 0–5 lux，踏板 120 lux）首次登上踏板的潜伏期（均值 + 标准误）。采用 Huynh-Feldt 校正的重复测量方差分析显示，品系（P = 0.031）、试验次数（P &lt;0.001）以及试验次数 × 品系交互作用（P &lt;0.001）均具有显著效应。事后分析：品系间比较：* = P &lt;0.0026；连续两次试验间比较：$ = P &lt;0.0026（BALB/cJ），T = P &lt;0.0026（129P3/J）。本图经 Salomons et al. 20104 修改而来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52529/52529fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="显示多天内潜伏期、重访次数、非诱饵孔访问次数和遗漏错误的行为学研究图。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. mHB中的认知测试（第1阶段）。 所有图表均显示均值 + SEM。（A） 假手术对照组、HI-45和HI-75小鼠完成试验的潜伏时间（秒）。（B） 遗漏错误次数，（C） 对非诱饵孔的访问次数，以及（D） 对已放置诱饵孔的重访次数。* = P &lt;0.05，** = P &lt;0.01，*** = P &lt;0.001，假手术组 vs. HI-75；# = P &lt;0.05，## = P &lt;0.01，### = P &lt;0.001，HI-45 vs. HI-75。该图改编自Van der Kooij et al. 20109。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52529/52529fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="显示在假手术和HI-45条件下各次试验中完成任务潜伏期的柱状图。" src="/files/ftp_upload/52529/52529fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 反转学习任务（第二阶段）。反转学习任务中完成一次试验的潜伏期（秒）（均值 + 标准误）。试验效应：# = P &lt;0.05，## = P &lt;0.01（反转学习任务第一次试验 vs. 前一次试验）。处理效应：* = P &lt;0.05，** = P &lt;0.01（HI-45组 vs. 假手术组）。该图改编自Van der Kooij et al. 20109。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>系统</td>
			<td>行为活动</td>
			<td>测量参数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>回避</td>
			<td>进入平台</td>
			<td>进入平台的频率、潜伏期（s）、停留时间占比（%）及平均持续时间（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>风险评估</td>
			<td>伸展探查</td>
			<td>伸展身体姿势（包括后肢）的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>觉醒</td>
			<td>理毛</td>
			<td>自我理毛的频率、潜伏期（s）、持续时间占比（%）及平均持续时间（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>排便</td>
			<td>排便颗粒数的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>排尿</td>
			<td>排尿次数的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>定向探索</td>
			<td>探孔访问</td>
			<td>进入圆筒孔洞的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>新物体探索</td>
			<td>探索新物体的频率、潜伏期（s）、持续时间占比（%）及平均持续时间（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非定向探索</td>
			<td>直立箱内行为</td>
			<td>在箱内直立（前爪不接触箱壁）的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>直立平台行为</td>
			<td>在平台上直立的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>孔洞探索</td>
			<td>探索圆筒孔洞的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>记忆</td>
			<td>熟悉物体探索</td>
			<td>探索熟悉物体的频率、潜伏期（s）、持续时间占比（%）及平均持续时间（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>社交倾向</td>
			<td>群体互动</td>
			<td>与群体隔间互动的频率、潜伏期（s）、持续时间占比（%）及平均持续时间（s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>运动活动</td>
			<td>穿越线条</td>
			<td>穿越线条的频率和潜伏期（s）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：行为参数列表
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>记忆系统</td>
			<td>参数</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>长期记忆</td>
			<td>错误选择</td>
			<td>进入未放置诱饵的圆筒；鼻部低于边缘</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>遗漏错误</td>
			<td>遗漏放置诱饵的圆筒</td>
			<td>未进入放置诱饵的圆筒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>短期记忆</td>
			<td>重复选择</td>
			<td>重复进入已放置诱饵的圆筒；鼻部低于边缘</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体表现</td>
			<td>总试验时间</td>
			<td>直至所有放置诱饵的圆筒均被访问所用的时间</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：认知参数列表

本方案描述了改良型孔板装置，这是一种行为测试装置，结合了开放场和传统孔板的特点。该装置能够对小型实验哺乳动物的非条件性行为进行差异分析，同时也能用于分析其认知能力。

本方案描述了一种改良型孔板（mHB），该装置结合了传统孔板与开放场箱的特点，旨在测量……

以下实验的总体目标是测量小型实验哺乳动物的非条件性行为，并分析其认知能力。通过将动物置于改良的孔板装置中，观察并评分其在有或无同笼伙伴存在情况下的非条件性行为来实现该目标。此外，可在测试前将新异或熟悉的物体或食物颗粒放置于装置内，用于测量物体识别能力或食物摄入抑制能力。该方法的第三个应用是将动物放入改良型整板的认知版本中，其中奖励物与一个颜色对比鲜明的标识物一同放置，以评估受试动物的认知能力。结果显示了非条件性行为的谱系。由于该方法在一个实验范式中整合了多种行为学维度，兼具传统孔板实验和开放旷场实验的特点，其主要优势在于克服了测试组合的缺点，减少了实验动物的使用数量，避免了可能的测试顺序效应，并降低了时间消耗和成本。测试应在动物饲养室内进行，通常在黑暗阶段（即动物最活跃的时段）开展；但本视频中的测试是在明亮光照条件下进行的。应在已适应环境并习惯实验人员操作的动物上进行行为学测试。将装有圆柱体的板放置在实验箱的中央。然后在板的上方放置一盏舞台灯，以在板与实验箱之间形成光照强度的对比，增强板的厌恶特性。首先，将熟悉物体放置在装置中，使其与位于起始点对角角落的新物体相距两厘米。然后，将待测动物从其饲养笼中取出，并将其面朝墙壁放置在装置的特定角落。让该动物自由探索约五分钟。由经验丰富的观察者使用行为评分软件对行为参数进行评分。使用本表中列出的参数，并测量动物接近新物体和熟悉物体或新食物和熟悉食物所需的时间。每次试验后用自来水和纸巾清洁装置。为避免基于嗅觉线索的偏差，在测试实验动物前，先将同伴动物放入群体隔间中适应10至30分钟。随后将实验动物放入测试隔间，使其自由探索改良后的整个装置五分钟，或根据您自身的实验方案所需时长进行。同样，应由经验丰富的观察者使用行为评分软件，依据表一中所列参数，对行为学指标进行实时评分。在开始本实验之前，需让动物熟悉一种适口性极佳的奖励物。此处使用一块杏仁作为奖励。在实验前连续两天，每天一次在动物的饲养笼内用镊子提供该奖励物，并插入隔板将箱体空间缩小至50厘米×50厘米。测试时，将一块较小的板子放置在盒子中央。此示意图显示了改良版孔板的设置。接下来，用动物喜好的气味（如香草味）对全部10个圆筒进行气味处理，并在每个圆筒下方的网格下放置奖励物，以确保奖励物无法被动物取出。使用带有与PVC形成对比的彩色环的Q3圆柱体，并在这些圆柱体内放置可移除的奖励物作为诱饵。再次将动物置于装置的同一角落，并由一名有经验的观察者进行实时评分。使用行为评分软件记录行为参数。除与物体识别或摄食抑制相关的参数外，测量表二中列出的参数以及之前表一中已显示的参数。每天进行四次训练试验，每次试验之间保持恒定的间隔时间，直到建立稳定收集全部三块杏仁的时间为止。每次试验后用自来水和纸巾清洁实验装置，以避免因嗅觉线索导致对反转学习测试产生偏差。当动物完全训练完成后，根据您自身实验方案的要求，对三个或更多不同的圆筒进行提示和放置诱饵，并让动物完成相应次数的试验。前四幅图像显示了认知测试范式的结果，该范式用于评估患有轻度脑缺氧缺血（标记为 HI 45）、重度缺氧缺血（标记为 HI 75）以及假手术对照组的 C57BL/6J 小鼠的认知功能。该图表显示了动物在测试当天完成四次试验的平均潜伏期。该图表显示了每次测试日对已放置诱饵的孔的重访次数，用于衡量短期记忆错误。此处展示的是对未放置诱饵孔的访问情况。这是对长期记忆错误的衡量指标。此处显示的是遗漏错误次数的数据。遗漏错误定义为未被访问的已放置诱饵的圆筒数量。为了确认 I 45 组没有认知功能障碍，将该组与假手术对照组进行了比较。在反转任务中，三个有食物的孔被分配到三个不同的圆筒中，动物共进行四次试验。通过比较第一阶段最后一次试验与反转阶段第一次试验的结果，可以明显看出反转效应。该图像显示了两组完成试验的潜伏期，明显的整体治疗效应显而易见。这表明，通过使用改良整体板结合逆转任务，可以检测到HI 45组存在认知灵活性受损。观看本视频后，您应能够充分理解如何在常规版本和认知版本中使用改良整体板。

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