Name: 染色质监管机构和各国的全基因组快照爪通过胚胎的ChIP-SEQ (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 了解ChIP-Seq方法用于研究非洲爪蟾胚胎中的染色质调控因子和染色质状态。该技术通过免疫沉淀和高通量测序实现全基因组定位，为发育生物学研究提供高分辨率的染色质景观分析。

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我们感谢 Chris Benner 将 X. tropicalis 基因组（xenTro2, xenTro2r）整合至 HOMER 工具中，感谢 Gilchrist 实验室在测序后分析方面的讨论。I.P. 协助完成了 GO 术语分析。G.E.G 和 J.C.S. 曾获得惠康信托基金（Wellcome Trust）的支持，目前由英国医学研究理事会（项目编号 U117597140）资助。

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<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
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<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
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<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
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<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
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<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们的方案概述了如何制备和分析全基因组染色质谱图 非洲爪蟾 胚胎。涵盖了从蛋白质交联到内源性基因座的每一步骤 体内 处理数百万条代表富集基因组位点的测序读长 计算机模拟由于可获取的基因组草图数量不断增加，本方案应适用于其他模式及非模式生物。其中最重要的实验部分，使本方案区别于以往的研究8,31,33,34，是用于提取交联细胞核的后固定步骤。该步骤有助于染色质的有效溶解和剪切，并易于放大实验规模。结合改进的文库构建效率，本方案可利用表达目标染色质相关表位的五十万至两百万细胞构建高复杂度的ChIP-Seq文库。对于ChIP-qPCR实验，通常仅需数万细胞即可检测约六个不同基因组位点的DNA富集情况。上述细胞数量为保守估计值，实际可能因蛋白表达水平、抗体质量、交联效率及表位可及性等因素而有所差异。作为参考，单个 非洲爪蟾 在囊胚中期（Nieuwkoop 和 Faber 分期 8.5 期），胚胎约含有 4,000 个细胞29），原肠胚晚期的40,000个细胞（12）以及早期尾芽期的100,000个细胞（20）。
高效免疫沉淀所需的精确交联时间需通过染色质免疫沉淀定量 PCR（第 10 节）进行经验性确定。通常情况下，若实验涉及X. laevis胚胎、早期发育阶段或弱（或间接）DNA 结合特性，则需要更长的交联时间。然而，不建议对Xenopus胚胎交联超过 40 分钟，或处理超过规定数量的胚胎（第 3 节），因为这会导致染色质剪切效率降低。交联后切勿使用任何甘氨酸，因为这种常用于淬灭甲醛的步骤会使富含卵黄的胚胎核提取变得极为困难。目前尚不清楚其具体原因。可以推测，甲醛-甘氨酸加合物可能进一步与N端氨基或精氨酸残基发生反应35。
抗体是任何ChIP实验的关键，必须进行充分的对照实验以证明其对目标表位的特异性（参见Landt等人et al.36的指南）。如果无法获得适用于ChIP的抗体，引入相应的表位标签融合蛋白可能是一种合理的替代方案，因为这些蛋白能够占据内源性结合位点37。在这种情况下，最好使用未注射的胚胎作为阴性对照，而不是使用非特异性血清进行ChIP。当目标蛋白表达水平较低，导致富集DNA回收率较差时，也可采用此策略。
至于构建ChIP-Seq文库，由于所用DNA量较少，建议选择能够减少纯化步骤数量的实验流程，并合并反应步骤，以最大限度地减少DNA损失。接头和引物必须与多重测序及高通量测序平台兼容（参见特定材料/设备表）。若使用Y型接头（含有较长单链臂），在对DNA插入片段进行片段大小选择之前，必须先进行3至5轮PCR预扩增，这一点至关重要。例如，100 至 300 bp）通过凝胶电泳分离。单链末端会导致 DNA 片段迁移不均一。使用不同量的输入 DNA 进行预实验例如建议使用不同起始量的 DNA（0.1、0.5、1、2、5、10 和 20 ng）来确定生成 100 至 200 ng 片段筛选文库所需的总 PCR 循环数（小于或等于 18 个循环）。减少 PCR 循环次数可降低产生冗余测序读段的可能性。固相可逆固定化磁珠是优良的纯化试剂，可高效回收目标 DNA，并可靠去除连接反应和 PCR 反应中的游离接头及二聚体。
就读段的数量、类型和长度而言，对于大多数ChIP-Seq实验，获得约2000万至3000万个36 bp的单端读段已足以对整个Xenopus基因组实现充分的覆盖深度。目前主流的高通量测序（NGS）仪器通常能够满足这些要求。然而，如果预期读段分布较宽（如组蛋白修饰所表现出的情况），而非出现尖锐的峰，则增加读段数量可能是有益的。对于许多ChIP-Seq实验，可将4至5个不同索引的文库混合，并在一台高性能NGS仪器的一个流动池通道中进行测序。在分析重复基因组区域内的染色质时，有时也建议延长读段长度并对DNA模板的两端进行测序（双端测序），以提高比对率。
该方案已成功应用于多种染色质特征的研究，包括转录因子、信号转导中介分子以及组蛋白的翻译后修饰。然而，随着胚胎发育，其细胞异质性逐渐增加，导致染色质图谱的解读变得更加困难。在拟南芥（Arabidopsis）和果蝇（Drosophila）中，已有研究通过分离特定细胞类型的细胞核来实现组织特异性的染色质图谱分析38,39。本方案包含细胞核提取步骤，有望为其他胚胎中开展组织特异性的ChIP-Seq研究奠定基础。

约30年前，为了理解细菌和果蝇中由RNA聚合酶介导的基因转录过程，首次尝试在活体（in vivo）条件下表征蛋白质-DNA相互作用1,2。自此以后，染色质免疫沉淀技术（ChIP）被广泛采用，以高效富集特定的染色质特征，从而捕获蛋白质结合事件和染色质状态3。随后，随着高通量微阵列技术的出现，该方法推动了全基因组染色质景观的系统性表征4。近年来，由于现在可对数百万条共免疫沉淀的DNA模板进行并行测序并比对至基因组（即ChIP-Seq），染色质分析变得更加全面且具有更高分辨率5。随着越来越多的基因组组装序列可被获取，ChIP-Seq已成为研究生物过程背后基因组调控机制的一种极具吸引力的方法。
本文提供了一种针对富含卵黄的胚胎（如青蛙胚胎）进行ChIP-Seq的实验方案 非洲爪蟾. 两种广泛使用的基因组草图 非洲爪蟾 物种—X. tropicalis 和 X. laevis—现已由国际 非洲爪蟾 基因组联盟6胚胎的 非洲爪蟾 物种具有许多有利于开展和解读全基因组染色质研究的优良特性，包括能够产生大量高质量的胚胎、胚胎本身体积较大，以及体外发育等特征。此外，这些胚胎适用于多种经典和新型操作技术，如细胞谱系示踪和整体装片 原位 杂交、RNA过表达以及TALEN/CRISPR介导的基因敲除技术。
本方案基于 Lee et al.、Blythe et al. 和 Gentsch et al.7-9 的研究工作。简言之，在目标发育阶段，使用甲醛固定 Xenopus 胚胎，以共价结合（交联）蛋白质与其关联的基因组 DNA。核提取后，将交联的染色质片段化，以便后续测序聚焦于特定的基因组结合位点或修饰位点，并最大限度减少侧翼 DNA 序列的干扰。随后，使用适用于染色质免疫沉淀（ChIP）的抗体对染色质片段进行免疫沉淀，以富集含有目标蛋白的片段。将共免疫沉淀的 DNA 从蛋白质上解离并纯化，随后构建带有索引的（双端）文库用于高通量测序（NGS）。最后，提供了一些简单的命令行，用于 ChIP-Seq 数据的测序后分析。

<table><tbody><tr><td>1/16英寸锥形微头</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>该微尖与Misonix的Sonicator 3000以及Qsonica的Q500/700兼容。</td></tr><tr><td>8 ml 玻璃样品瓶（带瓶盖）</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>用于水相样品的8 ml透明玻璃样品瓶，配有15-425规格含酚醛橡胶衬垫的螺旋盖。</td></tr><tr><td>接头</td><td>例如，IDT 或 Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq 通用接头， 
AATGATACGGCGACCACCGAG&lt;br /&gt;
ATCTACACTCTTTCCCTACAC&lt;br /&gt;
GACGCTCTTCCGATC*T。TruSeq 索引接头， 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC&lt;br /&gt;
TGAACTCCAGTCAC &amp;#8208;NNNNNN&amp;#8208;&lt;br /&gt;
ATCTCGTATGCCGTCT&lt;br /&gt;TCTGCTT*G. *，5'端硫代磷酸键磷酸基团&amp;#39; 末端。NNNNNN，index（参见TruSeq ChIP样本制备指南中的DNA序列）。订购经HPLC纯化的接头。可通过等摩尔量混合（每种）接头制备 100 &amp;#181;M通用接头和索引接头的退火，并将其从高温缓慢降温 95 &amp;#176;C 室温。每纳克输入DNA使用1.5 pmol。储存于-20 &amp;#176;C.</td></tr><tr><td>b2g4pipe（软件）</td><td>Blast2GO</td><td>非商业用途</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+（软件）</td><td>Camacho 等人</td><td>非商业用途</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp;amp; &lt;br /&gt;DOC_TYPE=下载</td></tr><tr><td>Bowtie（软件）</td><td>Langmead 等</td><td>非商业用途</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder（软件）</td><td>Sharov 等人</td><td>非商业用途</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr><tr><td>毛细管电泳用芯片</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-1504</td><td>将此芯片上样 1 &amp;micro;l 用于文库质量控制的 DNA。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>基于芯片的毛细管电泳系统</td><td>安捷伦科技</td><td>G2940CA</td><td>Agilent 2100 BioAnalyzer 用于检测 ChIP-Seq 文库的质量。试剂应保存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq文库制备试剂盒（KAPA Hyper Prep Kit）</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8504</td><td>试剂盒包含KAPA末端修复和A尾酶混合物、末端修复和A尾缓冲液、DNA连接酶、连接缓冲液、KAPA HiFi HotStart ReadyMix（2X）以及KAPA文库扩增引物混合物（10X）（另见PCR引物）。接头不包含在内。储存于-20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq文库制备试剂盒（替代产品，ThruPLEX-FD Prep Kit）</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>试剂盒采用其自带的茎环接头和引物。该试剂盒省去了中间纯化步骤，灵敏度与KAPA Hyper Prep Kit相当。储存于-20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Cluster3（软件）</td><td>de Hoon 等人</td><td>非商业性</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC（软件）</td><td>Simon Andrews</td><td>非商业用途</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td></tr><tr><td>荧光计</td><td>生命技术公司</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 荧光仪</td></tr><tr><td>荧光计试剂</td><td>生命技术公司</td><td>Q32851</td><td>该试剂盒提供浓缩的检测试剂、稀释缓冲液以及预稀释的DNA标准品，用于Qubit荧光计。将DNA标准品储存在 4 &amp;deg;C，缓冲液和染料置于室温。</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>甲醛溶液，分子生物学用，H2O中含量36.5-38%，含10-15%甲醇作为稳定剂。室温保存。注意：甲醛具有腐蚀性且高度有毒。</td></tr><tr><td>凝胶（E-Gel EX 琼脂糖，2%）</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>预制胶，11孔，可开口格式。在分子量标记与文库之间留出一孔，以避免交叉污染。将凝胶于室温保存。</td></tr><tr><td>凝胶电泳系统</td><td>life technologies</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase 和 E-Gel Safe Imager 组合试剂盒用于 ChIP-Seq 文库的片段大小筛选。</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>所有试剂均在室温下保存。使用 500 &amp;micro;l 每100 mg 2% 琼脂糖凝胶切片加入QG缓冲液以提取DNA。使用MinElute柱（来自MinElute PCR纯化试剂盒）对DNA进行两次洗脱。</td></tr><tr><td>HOMER（软件）</td><td>Chris Benner</td><td>非商业用途</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>技术</td><td>FHB1D</td><td>Hybridizer HB-1D</td></tr><tr><td>IGV（软件）</td><td>Robinson 等</td><td>非商业用途</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Illumina CASAVA-1.8 质量过滤（软件）</td><td>Assaf Gordon</td><td>非商业用途</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView（软件）</td><td>Alok Saldanha</td><td>非商业性</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>实验室升降台</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>该支架用于在声波破碎时抬高声学封闭罩内的样品。</td></tr><tr><td>100 bp DNA标记</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>将1x溶液保存于室温。储备液储存于-20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>将1x溶液保存于室温。将原液储存于-20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>低吸附 1.5 ml 微量离心管</td><td>生命技术公司</td><td>AM12450</td><td>无粘性、无RNase的微量离心管，1.5 ml</td></tr><tr><td>MACS2（软件）</td><td>Tao Liu</td><td>非商业用途</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>磁珠</td><td>生命技术公司</td><td>11201D</td><td>这些Dynabeads是超顺磁性微珠，其表面共价结合了亲和纯化的多克隆绵羊抗小鼠IgG。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>磁珠</td><td>生命技术</td><td>11203D</td><td>这些Dynabeads是超顺磁性微珠，其表面共价结合了亲和纯化的多克隆绵羊抗兔IgG。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>磁珠</td><td>生命技术</td><td>10001D</td><td>这些Dynabeads是超顺磁性微珠，其表面共价结合了重组蛋白A。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>磁珠</td><td>life technologies</td><td>10003D</td><td>这些Dynabeads是超顺磁性微珠，其表面共价结合了重组蛋白G。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>生命技术</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2 磁力架</td></tr><tr><td>MEME</td><td>Bailey 等人</td><td>非商业用途</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>原钒酸钠（100 mM）是一种常用的蛋白酪氨酸磷酸酶广谱抑制剂。储存于 -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>氟化钠（500 mM）常用于广谱抑制磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸磷酸酶。储存于 -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NGS 仪器</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Genome Analyzer IIx</td></tr><tr><td>NGS 仪器（高性能）</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>正常血清（抗体对照）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>在 ChIP-qPCR 实验中用作山羊多克隆 IgG 抗体的对照。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>正常血清（抗体对照）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>在 ChIP-qPCR 实验中用作鼠多克隆 IgG 抗体的对照。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>正常血清（抗体对照）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>在 ChIP-qPCR 实验中用作兔多克隆 IgG 抗体的对照。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>核酸染色液</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>使用 RedSafe 核酸染色液，稀释比例为 1:50,000。室温保存。</td></tr><tr><td>橙G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>1-苯基偶氮-2-萘酚-6,8-二磺酸二钠盐。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>例如，IDT 或 Sigma</td><td></td><td>通过PCR富集接头连接的DNA片段的引物：AATGATACGGCGACCACCGA*G 和 CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G，含磷硫键。引物由Ethan Ford设计。将引物等量混合 5 &amp;micro;M 每个。使用 5 &amp;micro;l 在 50 &amp;micro;l PCR 反应。储存于 -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>用于 ChIP-qPCR 和剪切检测样本的纯化。将 MinElute 离心柱保存于 4 &amp;deg;C，所有其他缓冲液和收集管置于室温。</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH 7.9）</td><td>Life Technologies</td><td>AM9730</td><td>酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）为预混液，提供时pH为6.6。使用提供的Tris碱性缓冲液将pH调至7.9。储存于 4 &amp;deg;C. 警告：苯酚:氯仿:异戊醇具有腐蚀性、剧毒且易燃。</td></tr><tr><td>Primer3（软件）</td><td>Steve Rozen &amp;amp; Helen Skaletsky</td><td>非商业性</td><td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td>cOmplete，Mini，无EDTA。每10 ml使用1片。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td>cOmplete，无EDTA。每50 ml使用1片。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>生命技术公司</td><td>AM2548</td><td>蛋白酶K溶液（20 &amp;micro;g/&amp;micro;l). 储存于 -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>生命技术</td><td>12091-039</td><td>RNase A（20 &amp;micro;g/&amp;micro;l。室温保存。</td></tr><tr><td>旋转器</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Rotator SB3</td></tr><tr><td>SAMtools（软件）</td><td>Li 等</td><td>非商业用途</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>固相可逆固定化珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP 磁珠用于最大限度减少 ChIP-Seq 文库中的接头二聚体污染。储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>现在有更新的型号可供选择。Q125、Q500 或 Q700 均适用于剪切交联的染色质。</td></tr><tr><td>隔音罩</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>可选：按照制造商的建议获取合适的隔音罩。</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>适用于 24 x 1.5 mL 离心管的温控混匀仪。精确的温度控制范围从 4 &amp;deg;C 高于室温至 99 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

通过chip-seq获得的xenopus胚胎中染色质调控因子和状态的全基因组快照

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

染色质调控因子的招募以及特定基因组位点染色质状态的建立，对于发育过程中细胞命运的决定以及组织和器官的形成至关重要。确定这些染色质特征的位置和水平 体内 将为基因组元件的时空调控提供宝贵信息，并有助于实现模拟胚胎组织发育的目标 体外最常用的全基因组高分辨率分析方法是染色质免疫沉淀结合下一代测序技术（ChIP-Seq）。本实验方案概述了如何对富含卵黄的胚胎（例如青蛙的胚胎）进行操作 非洲爪蟾 可用于ChIP-Seq实验，并为测序后的数据分析提供简单的命令行操作。由于该方案能高效地从甲醛固定的组织中提取细胞核，因此可轻松扩大样本量，以获得足够的ChIP材料用于全基因组范围的分析。我们已成功利用该方案在胚胎发育的多个阶段，对多种DNA结合蛋白（如转录因子、信号转导中介分子、转录机器组分、染色质修饰因子以及组蛋白的翻译后修饰）进行定位。最后，随着越来越多的基因组组装序列陆续发布，该方案应可广泛适用于其他模式及非模式生物。

如果实验方案操作得当，且所用抗体为经染色质免疫沉淀验证的优质抗体（参见讨论部分），则预期可获得与本文所示相当的结果。本方案可用于从甲醛固定的Xenopus胚胎中提取细胞核，并通过超声处理高效剪切染色质（图1A-C）。剪切后的染色质DNA片段呈不对称分布，主要范围在100至1,000 bp之间，峰值位于300至500 bp之间（图1C）。为成功构建插入片段大小相近的带索引的成对末端ChIP-Seq文库，至少需要50 pg的免疫沉淀DNA（图2A）。文库中应基本不含接头二聚体，后者在电泳图谱上约120 bp处可见。
通过合成测序后，预处理的读段被比对到基因组上（图2B，C）。在对X. tropicalis胚胎进行的成功实验中，通常有50%至70%的40 bp单端读段可被唯一比对到v7.1版本的基因组组装序列上，允许最多两个错配。虽然输入的读段在基因组上的比对分布较为均匀，但ChIP读段的比对则会在目标染色质特征两侧产生链特异性的富集信号。这是因为所有片段均从5’端进行测序（图2C）25。将比对结果沿读取方向延伸至平均片段长度，可获得单个染色质特征（如转录因子结合事件）的精确信号谱图。这些DNA占据区域在IGV或其他兼容的基因组浏览器中可视化时表现为峰状信号。可使用MACS等峰识别软件来确定这些峰的位置（图3A）。通过该方法，已在X. tropicalis基因组中鉴定出T-box转录因子（如VegT）的数万个结合位点26。ChIP-qPCR实验应验证ChIP-Seq所发现的局部富集结果（图3B）。
ChIP-Seq 实验可用于探索染色质特征的全基因组特性。例如，计算在转录起始位点和终止位点等基因组元件上的测序读段分布，可以揭示在基因周围是否存在空间结合偏好性（图 3C）。类似地，通过在峰位点处的读段分布绘制热图，可用于在全基因组范围内比较不同的染色质特征（图 3D）。某些转录因子以序列特异性方式结合 DNA。从头（de novo）基序分析可从峰区域下方的基因组 DNA 中识别出此类信息，包括潜在共调节因子的共富集基序（图 3E）。大多数靶基因表现出较低而非较高的 DNA 占有水平（图 3F）。这种无标度特征在转录因子中似乎相当普遍，表明仅有少数靶基因被直接调控并具有生物学意义27,28。对富集的 GO 条目或靶基因差异表达等其他属性的分析，可进一步揭示该染色质特征在中国南方爪蟾（Xenopus）胚胎中的生物学功能（图 3G）。
<img alt="胚胎固定、染色质提取、剪切、免疫沉淀、DNA纯化示意图。" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图1"> 
图1. Xenopus胚胎的染色质免疫沉淀流程。(A) 在目标发育阶段使用甲醛固定胚胎，使与基因组DNA结合的蛋白质发生共价连接（交联）。核提取后(B)，将交联的染色质进行片段化处理，以减少侧翼DNA序列长度，从而精确定位基因组DNA结合位点或染色质修饰位点(C)。随后，使用适用于染色质免疫沉淀（ChIP）的抗体对染色质片段进行免疫沉淀，富集含有目标表位的片段(D)。共免疫沉淀的DNA从蛋白质上解离并纯化(E)，之后用于构建适用于高通量测序（NGS）的ChIP片段文库（图2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于DNA分析和峰图谱结果的ChIP-Seq文库构建与测序方法示意图。" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图2"> 
图2. ChIP-Seq文库构建、边合成边测序、序列比对与峰识别。（A） 电泳图显示了一个质量良好的ChIP-Seq文库，其DNA模板长度为250至450 bp。这些模板包含目标DNA插入片段，两侧分别连接通用接头（58 bp）和带索引的接头（63 bp）。（B） 数百万个簇在含有四种核苷酸的条件下逐个碱基进行测序，每种核苷酸均带有可逆的、不同的荧光标记，并具有相同的终止特性。荧光图像被实时处理以识别相应的碱基，最终组装成测序读段（reads）。（C） 仅保留唯一比对到Xenopus基因组的读段。由于所有片段均从5’端开始测序，ChIP读段的比对结果在目标染色质特征两侧形成链特异性的峰。因此，峰识别软件可检测来自免疫沉淀的富集信号，并将读段延伸至平均片段长度，从而精确定位染色质特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="zVegT 基因调控；DNA结合位点与基序；柱状图、饼图、基序分析图。" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 3"> 
图 3. 利用合子期 T-box 转录因子 VegT（zVegT）进行测序后分析与数据可视化的示例。 此处显示的所有读数均已标准化为1000万条唯一比对且非冗余的读段。 (A) zVegT 在 X. tropicalis 原肠胚胚胎（Nieuwkoop 和 Faber 分期 11 至 12.5 阶段29）中全基因组结合谱的局部图示。每个峰代表一个结合位点，由延伸读段的堆积形成。这些峰由 MACS2 软件识别，错误发现率（FDR）低于 1%。每个 mesp 基因均显示出非常邻近且位于上游的 zVegT 结合信号，但仅 mespa 和 mespb 在该阶段有表达（RNA-Seq 数据30）。 (B) 通过 ChIP-qPCR 在多个基因座（包括 β-actin 基因上游 0.5 kb 的非结合区域）测定的 zVegT DNA 占有水平，验证了 ChIP-Seq 所发现的特异性富集结果。将 mespa 的结果与 (A) 中红色条形所示的峰进行比较。DNA 占有水平以输入样本的百分比形式表示，分别对应使用 VegT 抗体（兔多克隆 IgG 同种型）和对照抗体（正常兔 IgG）进行的 ChIP 实验。误差线表示两次生物学重复的标准偏差。 (C) 元基因分析显示，zVegT 优先结合启动子区域（标签按 25 bp 分箱），相较于基因体周围及其他基因组区域更为显著。 (D) 热图展示了 zVegT 和 Smad2/Smad3（ChIP-Seq 数据31）在原肠胚阶段所有 zVegT 结合区域附近的 DNA 占有水平（标签按 25 bp 分箱），并采用 k 均值聚类（k=5）。该热图基于 log2 转换，并以每碱基对 5 个标签为中心。 (E) 从头（de novo）基序分析发现，在 zVegT 结合区域中有 38% 含有经典的 T-box 转录因子结合基序，前提是将基序得分标准化为背景序列中 5% 的发现率。密度图显示 T-box 基序在 zVegT 结合位点中心区域富集程度最高，而经典的 Smad2/Smad3 结合基序几乎未见富集。 (F) 直方图显示 zVegT 的 DNA 占有水平，该值由各靶基因转录起始位点上游 5 kb [-] 至下游 1 kb [+] 范围内所有峰（±200 bp）计算得出。 (G) 在 -5 kb 至 +1 kb 区域内具有最高 DNA 占有水平的前 300 个基因，在早期胚胎发育相关的生物学过程方面显著富集。这些 GO 条目与 zVegT 的推测功能一致。FDR 值基于双尾 Fisher 精确检验，并对多重检验进行了校正。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

染色质调控因子和染色质状态如何影响基因组的问题 在体 对于理解发育中胚胎早期细胞命运决定机制至关重要。本文概述了在全基因组水平上研究染色质特征最常用的方法——ChIP-Seq。 非洲爪蟾 胚胎

通过ChIP-Seq获得的Xenopus胚胎中染色质调控因子和状态的全基因组快照

染色质调控因子的招募以及特定基因组位点染色质状态的建立，对细胞命运决定及组织和……

该实验流程通常称为 ChIP-seq（染色质免疫沉淀结合高通量测序），旨在确定 opus 胚胎中染色质调控因子和染色质状态的全基因组定位。首先固定 zap 胚胎，从而将与 DNA 结合的蛋白质共价交联至基因组上；随后提取细胞核，溶解其染色质，并通过超声处理将其片段化。此时，通过免疫沉淀和多次洗涤纯化与DNA结合的目标蛋白。最后一步是从纯化的DNA片段构建带有索引的ChIP-seq文库。最终，这些DNA片段的数百万条5'端序列（即所谓的reads）被并行测序，然后比对到基因组，并延伸至平均片段长度。通过确定所谓的峰（peaks）的局部富集，可识别目标蛋白在基因组上所有特定位点的DNA占据情况，从而拓展对其全基因组特征的研究。因此，该实验方案可为鸸鹋胚胎的全基因组染色质结构提供深入见解，并且还可能适用于其他已完成基因组测序的生物体。从获取胚胎开始。至此的详细步骤已在文本方案中提供。将胚胎转移至一个8毫升的玻璃小瓶中，并用0.01 XMMR清洗。洗涤后，用1%多聚甲醛和0.01 XMMR固定胚胎，在室温下固定时间不少于15分钟，不超过40分钟。通过用冷的0.01 XMMR洗涤胚胎三次来终止固定。避免胚胎接触溶液表面，因为表面张力会导致胚胎破裂。一旦去除固定液，将250个胚胎分装至微量离心管中。然后尽可能多地吸除0.01 XMMR溶液，并继续进行染色质提取以暂停后续步骤。将胚胎加入250 µL冰冷的HEG缓冲液中进行平衡。待胚胎在缓冲液中沉降后，可迅速在液氮中冷冻，并于-80°C保存。首先，在E1缓冲液中匀浆固定后的胚胎。关于放大和缓冲液制备的详细信息见文本方案。接下来进行离心。在4°C下将匀浆中的上清液吸出并弃去，然后将沉淀重悬于E1中。再次将样品置于冰上静置 10 分钟。重复离心操作，然后 Reese 将沉淀重悬于 E2 中。在匀浆物于冰上冷却的同时，等待 10 分钟。然后再次重复离心操作，并将沉淀重悬于 E3 中。这一次，在冰上静置 10 分钟后，悬液应变得相对透明，因为此时离子型去污剂已使大部分残留的卵黄小板溶解。现在，再次重复离心操作。Andre。将沉淀物重悬于1至3毫升的E3中。如有必要，利用最后一次离心步骤将所有沉淀物与目标交联的细胞核分离。该悬液还含有色素颗粒和部分残留的卵黄小板。这些颗粒和卵黄小板将在超声处理后通过离心与染色质分离。现在将样品置于冰上，并继续进行染色质片段化。或者，可迅速冷冻样品以临时保存。首先将 E3 中的样品转移至定制的聚苯乙烯管中。进行超声处理时，使用短温度计夹将试管固定在装有冰水的 800 毫升烧杯中，以确保超声过程中样品保持低温。将烧杯置于升降架上，并调节升降架，使超声探头浸入样品深度约为三分之二处。超声探头不应接触管壁。优化超声条件时，可从制造商推荐的参数开始，使用配备1/16英寸锥形微探头的My Sonic Sonicate 3000，总超声时间为7分钟，每次超声30秒，两次超声之间间隔30秒。让样品静置一分钟。每次超声处理从功率1开始，逐渐增加至2到4之间。如果样品开始起泡，需重新放置试管，并等待泡沫消散后再继续。超声处理后，染色质将被溶解并剪切。将其转移至预冷的1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下以最大速度离心5分钟。收集上清液并转移至预冷的离心管中，弃去沉淀。使用 50 微升上清液（SUP）进行碎片化程度的目视评估，并将剩余部分保存用于免疫沉淀。首先，将 10 至 30 微升剪切后的染色质上清液（SUP）转移至新离心管中，作为输入样本。然后向剩余染色质中加入 ChIP 级抗体，用量约为每百万细胞 1 微克。将染色质-抗体样品在4°C、10 RPM旋转条件下孵育过夜。次日，在4°C下用E3缓冲液洗涤与抗体兼容的磁珠5分钟。按照制造商建议的磁珠浓度，将洗涤后的磁珠加入已预先孵育抗体的染色质中，在4°C旋转孵育4小时。然后使用预冷的裂解缓冲液洗涤磁珠10次。每次洗涤之间，使用磁力架静置20至30秒以分离磁珠。溶液应保持澄清。用预冷的10缓冲液进行一次洗涤，接在裂解缓冲液洗涤之后。然后将少量10缓冲液中的珠子转移至新管。分离珠子并弃去残留缓冲液。为了分离免疫沉淀的染色质，Reese 将珠子加入 50 至 100 微升的 SDS 溶液缓冲液中，并使用恒温混匀仪涡旋振荡试管。然后以最高速度离心 30 秒，收集上清液，其中含有免疫沉淀的染色质洗脱物。重复SDS溶液步骤一次，并合并所有洗脱液。随后按照本文所述实验方案进行DNA提取、ChIP-seq、文库构建及高通量测序。共享染色质的DNA片段呈不对称分布，主要范围在100至1000个碱基对之间，峰值出现在300至500个碱基对之间。为成功构建插入片段大小相似的带索引的成对末端ChIP-seq文库，至少需要50皮克的免疫沉淀DNA。文库应基本不含接头二聚体，后者在电泳图谱上约120个碱基对处可见。对ChIP-seq文库进行测序可获得数百万条短DNA序列，即所谓的reads。这些reads会被比对到基因组上，而输入对照（input）的reads则沿基因组均匀分布。芯片测序结果显示了在目标染色质特征两侧具有链特异性的富集区域。将比对结果沿读取方向延伸至平均片段大小，可减少单个染色质特征（如转录因子结合事件）的精确图谱。这些特征在基因组浏览器中表现为峰状信号，如此处所示在泽诺氏热带胚胎的胃泡阶段中 veg tea 的情况。ChIP-seq 实验能够探索染色质特征的全基因组特性，例如峰区下方富集的DNA序列基序，或基因靶标的基因本体分析。如图所示，为该技术开发后所绘制的 bench TDNA 相互作用图谱。该方法为研究人员探索胚胎染色质景观提供了途径，既可在全基因组范围内进行，又具有极高的分辨率。

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利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

本研究描述了一种生成高分辨率图像的实验方案 原位 紧密分期的原肠胚形成前Hi-C文库 黑腹果蝇...

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

本文介绍了进行 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 的方法，包括用于下一代测序的文库构建，以在胚胎干细胞中生成全基因组表观遗传学和染色质相关 RNA...

CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

该方法旨在追踪细胞系中由PRC2介导的染色质结构域的形成过程，并且可适用于许多其他系统。...

一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。...

利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

本文介绍了一种快速简便的ATAC-seq实验方案，仅需30 µL线虫沉淀，即可应用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

了解ChIP-Seq方法用于研究非洲爪蟾胚胎中的染色质调控因子和染色质状态。该技术通过免疫沉淀和高通量测序实现全基因组定位，为发育生物学研究提供高分辨率的染色质景观分析。

通过ChIP-Seq获得的Xenopus胚胎中染色质调控因子和状态的全基因组快照

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