在大鼠脑组织用荧光活化细胞分选，以检查细胞类型特异性基因表达
May 28th, 2015
该协议的目标是使用荧光激活细胞分选 （FACS） 技术对特定类型的神经细胞进行分类，以便随后分析细胞类型特异性基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。
该程序的总体目标是从脑组织中分离单个神经细胞类型以供后续分析。这是通过首先将神经组织解离成单细胞悬液来实现的。在第二步中，从悬浮液中去除髓鞘，然后对细胞进行细胞类型特异性抗体染色。
在最后一步中，通过流式细胞术对单个细胞群进行分类。最终，这种细胞类型特异性分离方法将允许用户以细胞类型特异性方式检测基因或蛋白质表达或表观遗传修饰的变化。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如哪些细胞类型表达某些受体，哪些细胞类型表达某些蛋白质，哪些细胞表达某些表观遗传修饰，以便我们更好地了解大脑中细胞类型的特异性机制。
通过使用无菌剃须刀片将从成人脑组织收集的每个样品切成 30 至 400 毫克的小块，放在六孔培养板的盖子上开始神经解离。然后将组织浸入 1 毫升不含钙和镁的 HBSS 中，并在收集完所有组织后，使用移液器将样品转移到无菌的 2 毫升离心管中。离心样品并吸出上清液。
加入 1， 900 微升温酶。混合 1 个样品，并将样品孵育 15 分钟。在 37 摄氏度的水浴中，每 5 分钟倒置试管数次，以重悬沉淀的组织块。
孵育结束时，加入 30 μL 新鲜制备的酶。将 2 个样品混合到每个样品中，然后轻轻倒置试管。然后使用标记为 1 的害虫移液器，将每个样品与 30 次上下迭代分离。
注意避免产生气泡。将样品在 37 摄氏度下再孵育 15 分钟，每 5 分钟倒置一次，然后用害虫移液管分离样品。第二点，正如刚才所展示的。
然后切换到 3 号移液器，重复解离并将样品再孵育 10 分钟。在水浴中，每五分钟倒置一次，在孵育结束时，将单细胞悬液通过 80 微米细胞过滤器过滤到 15 毫升 Falcon 管中。用 10 毫升不含钙和镁的 HBSS 清洗每个过滤器，以在过滤最后一个样品后停止酶促反应，然后旋转试管并吸出上清液以耗尽细胞中的髓鞘。
悬浮液将沉淀彻底重悬于 400 μL 髓鞘去除缓冲液中，并向每个试管中加入适量的髓鞘去除珠。上下移液，直到细胞和珠子完全混合。然后将样品在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。
孵育后，在细胞旋转时用 5 mL 髓鞘去除缓冲液洗涤每个样品，将每个样品放置一根色谱柱置于磁选仪的磁场中，并在每根色谱柱顶部放置一个干净的 80 微米过滤器。用 1 毫升髓鞘去除缓冲液冲洗每个过滤器和色谱柱 3 次，将所有流过的液体收集在废液容器中。最后一次冲洗后，将 5 毫升聚苯乙烯圆底管直接放在每根柱子的正下方以收集洗脱液。
然后从样品中吸出 super name，并将沉淀重悬于 500 μL 髓鞘去除缓冲液中。立即将细胞悬液涂在色谱柱上，将细胞收集在下面的试管中。然后用 1 毫升髓鞘去除剂冲洗每个过滤器和色谱柱四次，每次洗涤缓冲液。
最后一次洗涤后，旋转细胞并吸出上清液以对细胞进行染色，以便通过流式细胞术进行分选。将每个样品涡旋约 2 秒以解离沉淀，并将每管中的 1 微升细胞转移到单独的试管中。对于染色对照，立即向每个试管中加入 5 μL FC 块，包括染色对照。
然后再次涡旋样品并在 4 摄氏度下孵育。5 分钟后，加入 100 μL 适当的一抗混合物。盖上试管以保护抗体避光，并在 4 摄氏度下孵育细胞 20 分钟。
孵育结束时，在 2 mL 洗涤缓冲液中洗涤样品，然后吸出上清液并用 100 μL 适当的二抗标记每个样品。盖上试管并将其置于 4 摄氏度下 15 分钟。然后在 2 毫升洗涤缓冲液中洗涤样品，离心样品，然后吸出。
上清液 Resus，将沉淀悬浮在 250 微升无菌 PBS 中，并在此处对细胞进行分类 显示来自单个雄性海马体的代表性流分拣的神经细胞群，根据细胞的前向和侧向散射特性，首先从所有可能的事件中设门。接下来，根据其大小从任何双联细胞或较大的细胞团块中设门，以便准确分选单个细胞类型，然后将单个细胞分选为 CD 11、B 阳性和 CD 11 B 阴性细胞群，并将 CD 11 B 阴性细胞进一步分选为 GT 1 和 TH 1 阳性细胞。然后使用分析程序确定每个群体中的事件总数以及亲本群体的百分比，以确认分选细胞的纯度。
在这个特定示例中，通过实时 PCR 分析替代细胞类型特异性基因的相对基因表达。正如预期的那样，这些数据证实了分选细胞的纯度，并确定了所研究的大脑区域之间的一些有趣的差异。在确认该品种的纯度后，可以测量其他目标基因的表达，以确定它们表达的特定细胞类型，或者它们的表达在以细胞类型特异性方式处理后是否发生改变。
例如，这里研究了奶牛结合的表达，这是一种钙结合蛋白，通常用于识别海马体和小脑中的神经元。观看此视频后，您应该对如何使用适当的细胞表面抗体分离感兴趣的特定神经细胞类型有很好的了解，例如此处显示的神经细胞。
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概述
本协议概述了一种使用荧光激活细胞分选（FACS）从脑组织中分离特定类型神经细胞的方法。该程序使得随后的细胞类型特异性基因表达、表观遗传标记和蛋白表达分析成为可能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 基因表达分析
背景
- 分离神经细胞类型对理解大脑机制至关重要。
- 细胞类型特异性分析可以揭示受体和蛋白表达的差异。
- FACS允许对单个细胞群进行精确分类。
- 该方法可以帮助研究神经细胞中的表观遗传修饰。
研究目的
- 分离单个神经细胞类型以进行详细分析。
- 调查特定细胞群中的基因和蛋白表达。
- 增强对大脑中细胞类型特异性机制的理解。
所用方法
- 将神经组织分离成单细胞悬液。
- 从细胞悬液中去除髓鞘。
- 用特定细胞类型的抗体对细胞进行染色。
- 使用流式细胞术对单个细胞群进行分类。
主要结果
- 成功分离出不同的神经细胞类型。
- 能够检测特定细胞类型的基因表达变化。
- 识别表达特定受体和蛋白的细胞类型。
- 洞察不同神经群体中的表观遗传修饰。
结论
- FACS技术在分离神经细胞类型方面有效。
- 该方法为研究细胞类型特异性机制提供了基础。
- 未来的研究可以利用这种方法探索各种神经科学问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding cell-type-specific mechanisms in the brain is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables precise isolation of neural populations, supporting mechanistic de-risking by linking gene expression changes to specific cell types. This approach enhances predictive confidence in target selection by revealing cell-type-specific expression patterns that may be masked in whole-tissue analyses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining which neural cell types express specific receptors, proteins, or epigenetic markers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of target engagement in defined cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell-type-specific expression patterns that inform target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neural cell populations for downstream screening of compounds affecting gene or protein expression.
- Operational Value: Standardizes input material for assays, improving reproducibility and reducing variability in readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple targets and brain regions through consistent cell isolation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving cell-type-specific epigenetic and expression profiles from discovery through validation.
- Operational Value: Provides quantitative, sortable outputs that align with translational biomarker strategies.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target expression in relevant human-equivalent cell types.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling cell-type-specific readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating cell types to assess target expression and pathway activity.
- Screening: Delivers purified cell populations for assay readiness, ensuring consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative data on gene, protein, and epigenetic expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved cell-type-specific molecular profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of neural cell preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissociation, flow cytometry, and antibody panel design.
- Depends on access to cell sorters, centrifugation equipment, and myelin removal reagents.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and cell surface markers.
- Limited by tissue availability and viability constraints during enzymatic dissociation.
