利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

本实验的总体目标是从脑组织中分离出特定的神经细胞类型，以用于后续分析。该目标通过以下步骤实现：首先将神经组织解离为单细胞悬液；第二步，从悬液中去除髓鞘，然后使用特定细胞类型标记的抗体对细胞进行染色。

在最后一步中，通过流式细胞术对单个细胞群体进行分选。最终，这种细胞类型特异性的分离方法将使研究人员能够以细胞类型特异性的方式检测基因或蛋白质表达水平的变化，或表观遗传修饰的改变。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如哪些细胞类型表达特定的受体、哪些表达特定的蛋白质、哪些存在特定的表观遗传修饰，从而帮助我们更深入地理解大脑中不同细胞类型特异性的分子机制。

使用无菌手术刀片，将从成年脑组织中采集的每个样本置于六孔培养板的盖子上，切成30至400毫克的小块，开始神经组织解离。随后，将组织浸入1毫升无钙、无镁的HBSS溶液中，当所有组织收集完毕后，用移液器将样本转移至无菌的2毫升离心管中。离心样本并吸除上清液。

加入 1,900 微升预热的酶溶液。充分混匀后，将样品在 37 摄氏度水浴中孵育 15 分钟，每 5 分钟颠倒离心管数次，以重新悬浮沉降的组织碎片。

孵育结束后，向每个样品中加入30 µL新配制的酶，混匀。每管样品轻轻颠倒混匀数次。然后使用标记为“1”的研杵移液器，对每个样品进行上下吹打30次以解离组织。

注意避免产生气泡。将样品在37摄氏度下再孵育15分钟，每5分钟颠倒混合一次，随后用移液器吹打使样品解离。编号二，如刚才所示。

然后换用第三支移液管，重复解离操作，并将样品再孵育10分钟。在水浴中每5分钟颠倒混匀一次。孵育结束后，通过80微米细胞滤网将单细胞悬液过滤至15毫升Falcon管中。每份滤网用10毫升无钙无镁的HBSS洗涤，以终止酶反应。当最后一个样品过滤完成后，离心收集细胞，吸除上清液，以去除细胞中的髓鞘成分。

用400微升髓鞘去除缓冲液将沉淀充分重悬，并向每根试管中加入适量的髓鞘去除磁珠。反复吹打溶液，直至细胞与磁珠充分混匀。然后将样品在4摄氏度条件下孵育15分钟。

孵育后，在细胞离心的同时，用5毫升髓鞘去除缓冲液洗涤每个样品，将每个样品的分离柱置于磁力分选仪的磁场中，并在每根柱子上方放置一个洁净的80微米滤网。用1毫升髓鞘去除缓冲液冲洗每根滤网和柱子三次，每次冲洗液均收集至废液容器中。最后一次冲洗后，将5毫升聚苯乙烯圆底试管直接置于每根柱子下方，以收集流出液。

然后吸除样品中的上清液，并将沉淀重悬于500微升髓鞘去除缓冲液中。立即将细胞悬液加入柱子中，用下方的收集管收集细胞。随后每次用1毫升髓鞘去除缓冲液洗涤滤膜和柱子，共洗涤四次。

最后一次洗涤后，离心收集细胞，并吸除上清液，以进行流式细胞术分选染色。将每个样品涡旋约两秒钟以重悬细胞沉淀，然后从每管中转移一微升细胞至各自的独立管中。对于染色对照组，立即向每管（包括染色对照管）加入五微升 FC 封闭液。

然后再次涡旋混匀样品，并在4°C下孵育。5分钟后，加入100 µL相应的初级抗体混合液。盖上管盖以避光保护抗体，并将细胞在4°C下孵育20分钟。

孵育结束后，用2毫升洗涤缓冲液洗涤样品，吸去上清液，然后每份样品加入100微升相应的二抗进行标记。盖好管盖，置于4摄氏度环境中15分钟。随后用2毫升洗涤缓冲液洗涤样品，离心样品，再吸去上清液。

上清液重悬后，将沉淀物悬浮于250微升无菌PBS中，并对细胞进行分选。此处展示了来自单个雄性海马体的代表性流式分选神经细胞群。首先根据前向散射和侧向散射特性，从所有可能的事件中设门筛选出目标细胞。接着，根据细胞大小，从双联体或更大的细胞团块中进一步筛选出单细胞（单体），以便准确分选各类单个细胞类型。随后，将单细胞分选为CD11B阳性与CD11B阴性细胞群，并对CD11B阴性细胞进一步分选为GT1和TH1阳性细胞。然后使用分析程序确定各细胞群中的总事件数以及相对于亲代群的百分比，以验证分选细胞的纯度。

在此特定示例中，通过实时 PCR 分析了不同细胞类型特异性基因的相对表达水平。结果如预期所示，这些数据证实了分选细胞的纯度，同时揭示了所研究的不同脑区之间存在的一些有趣差异。在确认分选纯度后，可进一步检测其他目的基因的表达，以确定其在何种特定细胞类型中表达，或其表达是否以细胞类型特异性的方式在处理后发生改变。

例如，此处研究了钙结合蛋白 cow binding 的表达，该蛋白常用于鉴定海马体和小脑中的神经元。观看本视频后，您应能充分理解如何利用合适的细胞表面抗体分离特定的神经细胞类型，例如此处所示的神经细胞。