Name: 口咽念珠菌病的免疫缺陷小鼠Th17细胞炎症模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解在免疫缺陷小鼠中建立Th17细胞介导的口咽念珠菌病炎症模型的方法。该技术通过注射Th17细胞和白色念珠菌芽生孢子诱导口腔炎症，为研究T细胞免疫病理机制及开发口腔免疫治疗策略提供重要实验平台。

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我们感谢Helene Bernstein博士为我们提供流式细胞仪的使用权限。同时感谢CFAR流式细胞术实验室提供的流式细胞术服务。本项目部分得到了CTSC核心资源使用资金以及STERIS公司/大学医院-传染病科资助项目对PP的资助。

注意：使用小鼠的实验均按照机构动物福利委员会（IACUC）指南进行。
1. 重建 Rag-1-/- 患有 I 的小鼠体外 培养的 Th17 细胞（感染前 3 天）
<ol>
	<li>为建立 Th17 细胞，培养 CD4+&#160;CD44low&#160;CD62Lhigh&#160;CD25-&#160;初始T细胞（3 x 104）接种于U型底96孔板中单独培养，或与3 x 104共同共培养&#160;CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞&#160;在Th17诱导条件下（使用IL-6（25 ng/ml）、TGF-β（2 ng/ml）、α-IFN-γ（2 µg/ml）和α-IL-4（2 µg/ml）进行极化），于可溶性α-CD3（1 µg/ml）、α-CD28（2 µg/ml）抗体及抗原呈递细胞存在的情况下培养三至四天。&#160; 
	注意：初始细胞和T调节性T细胞 采用荧光激活细胞分选（FACS）和磁性细胞分离方法进行分选，并按先前所述方法进行培养19-22.</li>
	<li>第4天，用移液器重悬Th17细胞后，从培养物中收集细胞，并在无菌条件下离心。
	<ol>
		<li>取少量上述细胞用于检测活力和表型分析。将细胞重悬于500 µl RPMI培养基中，加入碘化丙啶（200 ng/ml），立即通过流式细胞术检测细胞活力。通过流式细胞术检测再刺激后IL-17A的产生，以进行表型分析（参见第6.3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在所有步骤中，除非另有说明，均以480 × g在4°C下离心无菌PBS中的细胞沉淀6分钟，并进行洗涤。</li>
	<li>将这些细胞用于过继性转移至6-8周龄CD45.2 Rag1-/-免疫缺陷小鼠。
	<ol>
		<li>将细胞重悬至 1 x 107 细胞/ml 细胞密度，使用冷的无菌 PBS。</li>
		<li>使用1 ml结核菌素注射器和25 G针头，通过腹腔注射方式注入100 μl细胞悬液，每只小鼠注射量为1 × 106 细胞。部分小鼠仅接受PBS或Th17细胞，另一些小鼠则接受与Treg细胞共培养后的Th17细胞。 
		注意：所有步骤均需无菌操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养用于感染的C. albicans（感染前一天）
<ol>
	<li>接种前，将CAF2-1 C. albicans 实验室菌株的五个菌落分散于100 µl无菌PBS悬浮液中，并将该悬浮液加入无菌培养基中。</li>
	<li>将C. albicans的五个菌落接种至50 ml酵母氮源基础（YNB不含氨基酸）/蛋白胨/葡萄糖液体培养基中，在30 °C、130 rpm条件下于摇床培养箱中培养15–18小时。</li>
	<li>观察培养基是否变浑浊，浑浊是真菌生长的指示现象。</li>
</ol>
3. Candida 收集与计数步骤（感染当天）
<ol>
	<li>在15 ml离心管中收集10 ml Candida 培养液。若需处理更大体积，可使用50 ml离心管收集Candida。</li>
	<li>除另有说明外，所有步骤均在室温下以1900 × g离心5分钟，使芽生孢子沉淀，随后弃去上清液。&#160;</li>
	<li>若使用多个离心管，将来自多个管的Candida芽生孢子合并，向沉淀中加入无菌PBS，并重悬于10 ml PBS中用于计数。</li>
	<li>取20 μl芽生孢子悬液加入1.5 ml微量离心管中，加入20 μl 2倍浓度的多聚甲醛，室温孵育15–20分钟。&#160;在显微镜下使用血细胞计数板对固定后的芽生孢子进行计数。 
	注意：多聚甲醛具有致癌性，未稀释溶液仅可在通风橱中开启。</li>
	<li>同时，用PBS对芽生孢子至少洗涤两次，每次均通过离心使芽生孢子沉淀。将沉淀保存在15 ml离心管中，置于ABSL1级生物安全柜内的室温环境中，以备感染使用。</li>
	<li>留取部分无菌PBS置于室温，用于感染前重悬芽生孢子。</li>
	<li>计数后，向芽生孢子沉淀中加入无菌PBS，调节酵母细胞浓度至2 × 108 个细胞/ml。此即用于小鼠感染的芽生孢子悬液。 
	注意：所有操作均需无菌进行。</li>
</ol>
4. 小鼠感染（细胞转移后3-5天）
注意：基本感染步骤按先前所述方法进行19,23-25。
<ol>
	<li>称量三天前接受PBS或细胞的Rag-1-/-小鼠。</li>
	<li>根据小鼠体重计算麻醉剂剂量。使用1 ml结核菌素注射器和25 G针头，通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（16.1 mg/ml 和 1.6 mg/ml）以麻醉小鼠。
	<ol>
		<li>按每10克体重给予50 µl。即， 每10克体重注射0.8毫克氯胺酮和0.08毫克赛拉嗪，或每千克体重注射80毫克氯胺酮和8毫克赛拉嗪。麻醉后每15分钟观察一次脚趾夹捏反应。 
		注意：此剂量可诱导60–90分钟的麻醉，足以完成感染操作。</li>
		<li>在小鼠眼部涂抹眼用润滑软膏，以防止角膜干燥。由于眼用润滑剂可能变干，每45分钟重复涂抹一次眼用润滑剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在麻醉期间，于小鼠前肢背部附近皮下注射1 ml生理盐水（0.9% NaCl），以帮助小鼠补充水分。</li>
	<li>获取一个全新的洁净笼子。每次对一只小鼠进行感染操作，将感染后的小鼠立即放入新笼中。先进行PBS/假感染操作，然后继续进行后续步骤 假丝酵母 感染组</li>
	<li>拿起麻醉好的小鼠，张大其口腔以暴露舌根部。
	<ol>
		<li>将直径为3 mm、浸有50 µl PBS或分生孢子悬液的棉球置于小鼠口腔舌下，保留90分钟。每15分钟将小鼠前后翻转一次，以防止肺部充血，并确保棉球位置固定不动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每只小鼠设置计时器，以确保假手术组或 假丝酵母 口腔接种。</li>
	<li>将小鼠置于热灯（距离4英尺）下的笼子中，并在每只小鼠下方放置加热凝胶垫。</li>
	<li>确保舌头回缩至牙齿内侧并远离牙齿，以避免牙齿割伤舌头。</li>
	<li>90 分钟结束时，移除小鼠口腔处的棉球。观察是否有小鼠在 75 分钟前恢复麻醉状态；若出现此情况，仅使用氯胺酮（40 mg/kg）再次麻醉。</li>
</ol>
5. 术后监测（麻醉期间的90分钟）
<ol>
	<li>在90分钟麻醉期间使用加热凝胶垫。
	<ol>
		<li>为维持体温并防止窒息，不允许小鼠在常规的玉米芯小鼠垫料上恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉恢复后，在背部两个位置皮下注射额外的1 ml无菌0.9% NaCl溶液。</li>
	<li>每笼饲养最多五只PBS（假处理）接种小鼠。每笼仅饲养1-2只感染小鼠。</li>
	<li>每天操作后在操作卡上签名，记录体重、理毛习惯及整体健康状况的变化。</li>
</ol>
6. 评估炎症反应
6.1）体重减轻
<ol>
	<li>从感染前一天开始，在感染期间每天称量小鼠体重。 
	注意：通常情况下，注射了Th17细胞但无Tregs的免疫缺陷小鼠会因真菌负荷增加19和炎症加重而出现20-30%的体重下降并最终死亡。</li>
</ol>
6.2）舌组织学评分
<ol>
	<li>采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>打开小鼠下颌，使用剪刀和镊子解剖取出舌组织。用钝头镊夹住舌头，用剪刀伸入口腔后部，切断舌根部位。</li>
	<li>如需对舌组织进行免疫细胞化学苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色，先用预冷的 PBS 冲洗舌组织。在 15 ml 离心管中加入 5 ml 10% 福尔马林固定液，固定 2–3 个舌组织，4°C 过夜固定。
	<ol>
		<li>次日，移除福尔马林固定液，将组织浸入 5 ml 70% 乙醇中，以防止过度固定。随后送至商业服务机构，进行石蜡包埋、切片及石蜡切片染色。 
		注意：上述步骤由商业组织学服务机构完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待载玻片从商业组织学服务机构返回后，在光学显微镜下观察组织切片，对炎症程度进行分级。
	<ol>
		<li>评分标准为 0 至 5 分，0 分表示无炎症，5 分表示炎症最严重。参照表 1 对炎症程度进行评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6.3）Th17 细胞的细胞因子产生
注意：TNF-α 的过度产生是免疫病理过度反应的指标之一。当仅将 Th17 细胞过继转移至小鼠体内时，会导致免疫病理反应，该反应与 Th17 细胞中 TNF-α 的过度产生相关。
<ol>
	<li>使用先前所述方法19,26，从脾脏、颈部淋巴结、腋下淋巴结和舌组织中获取单细胞悬液。</li>
	<li>用佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）（50 ng/ml）和离子霉素（Ionomycin）（500 ng/ml）重新刺激细胞4小时，并在最后2小时加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A）（10 µg/ml）。用PBS洗涤细胞，并根据制造商说明书使用商用固定/透膜试剂盒对细胞进行固定。</li>
	<li>按照先前描述的方法19，使用荧光染料标记的抗-TNF-α、抗-IL-17A和ROR-γt抗体进行细胞内细胞因子染色。</li>
	<li>简言之，将细胞重悬于1×透化缓冲液中，加入抗-TNF-α、抗-IL-17A和ROR-γt抗体混合物，每种抗体终浓度为2–3 µg/ml。</li>
	<li>在室温下孵育细胞1小时。</li>
	<li>孵育后，用1×透化缓冲液洗涤细胞。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于含0.5%牛血清白蛋白的500 µl PBS中，用于流式细胞术分析。</li>
</ol>

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<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

该模型基于诱导口腔C. albicans感染依赖的Th17型炎症反应。由于缺乏Tregs，Th17细胞介导的炎症反应不受控制，导致免疫病理损伤难以消退。体外诱导分化的初始CD4细胞定向分化为Th17细胞后用于过继性转移。培养约第3天时，40–50%的CD4+细胞可检测到IL-17A的表达（即Th17细胞），因此被用于小鼠注射。该模型的主要优势在于Th17细胞可引发感染特异性的免疫病理损伤，而通过注射Treg细胞可有效缓解该病理过程。因此，该模型可用于评估免疫调节策略，并以Treg细胞注射作为阳性对照。炎症程度可通过小鼠体重下降、组织病理学评分以及感染小鼠Th17细胞产生促炎细胞因子的情况进行简便评估。
在过继性移植 Th17 细胞后，这些细胞迁移至次级淋巴器官及包括舌部（感染的主要部位）在内的多种组织。感染发生后，其他炎性细胞也被募集至舌部以清除感染。然而，在缺乏 Treg 介导的免疫调节情况下，Th17 细胞本身并不能清除感染，反而导致免疫病理反应加剧。共移...

口腔感染和炎症与癌症及心血管疾病相关，对人类整体健康具有显著影响2,3。由C. albicans引起的条件性感染和炎症与原发性免疫缺陷病（PID）4,5、牙周炎等炎症性疾病6,7、干燥综合征以及唾液腺疾病8,9，以及口腔鳞状细胞癌10-12有关。C. albicans是一种双相性共生真菌，可无症状定植于60%健康人群的口腔中，但当宿主防御功能减弱时，它是最常见的致病性真菌13-15。在艾滋病和原发性免疫缺陷病患者以及其他免疫功能低下个体中，该真菌可引起反复性和慢性感染与炎症。作为共生菌，其定植负荷与整体口腔微生物组多样性的变化相关16。作为病原体，它可导致多种类型的口咽念珠菌病，包括急性假膜型、急性萎缩型、慢性萎缩型、慢性肥厚型/增生型以及口角炎。
对 C. albicans 的防护不仅取决于宿主的免疫抵抗力，还取决于适当控制 Candida 诱导的免疫病理损伤的能力。尽管像 C. albicans 这样的共生菌可参与调节并加重其他口腔炎症性疾病，但在机会性感染期间菌群失调的发生机制仍不明确。除了已知的适应性 Th17 细胞在针对 C. albicans17 的记忆免疫应答中的作用外，其在慢性感染过程中炎症病理的启动和持续中的作用仍不清楚。此外，诸如干燥综合征和牙周炎等口腔炎症性疾病均与 Th17 介导的病理过程相关。有趣的是，这些疾病也与频繁发生的口腔假丝酵母菌病（OPC）密切相关。然而，Th17 细胞、OPC 的口腔免疫病理以及其他口腔炎症性疾病之间的相互作用尚未被研究。 
尽管已有可用于研究口腔念珠菌病原发性和继发性感染的小鼠模型，但目前尚无用于研究与念珠菌感染相关的 Th17 炎症（尤其是在免疫缺陷背景下）的小鼠模型。本研究提出了一种在小鼠中建立与口腔 Candida 感染相关的口腔 Th17 炎症的方法。Candida 感染的小鼠表现为真菌病灶、舌部炎症、摄食减少、体重下降，并最终进入濒死状态。其口腔病理表现类似于慢性念珠菌感染病灶，以及小鼠口腔癌模型中的上皮异型增生12,18。

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>匹兹堡大学 (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>白色念珠菌培养</td></tr><tr><td>U型底96孔板&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>a-CD3&amp;nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>将细胞极化为Th17条件</td></tr><tr><td>a-CD28&amp;nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>将细胞极化为Th17条件</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>将细胞极化为Th17条件</td></tr><tr><td>h-TGF-b&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D</td><td>240-B</td><td>将细胞极化为Th17条件</td></tr><tr><td>a-IFN-g&amp;nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>将细胞极化为Th17条件</td></tr><tr><td>a-IL-4&amp;nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>将细胞极化为Th17条件</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>用于细胞培养 - 1:50</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>用于细胞培养 - 1:100</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-RORgt PE&amp;nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>用于细胞培养 - 1:50</td></tr><tr><td>YNB无氨基酸/蛋白胨/葡萄糖培养基&amp;nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>S507.SIZE</td><td>白色念珠菌生长培养基</td></tr><tr><td>摇床培养箱&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>白色念珠菌培养孵育</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>用于细胞培养和白色念珠菌生长</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>用于细胞培养和白色念珠菌生长</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>用于沉淀白色念珠菌 - 900 g</td></tr><tr><td>Allegra 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>392302</td><td>细胞培养 - 480 g</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>制备白色念珠菌终浓度</td></tr><tr><td>2x 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>固定白色念珠菌用于计数</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲液</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>缓冲液制备</td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪&amp;nbsp;</td><td>凯斯西储大学 - 动物资源中心</td><td>-</td><td>从动物资源中心批准的麻醉方案中获取</td></tr><tr><td>眼用润滑软膏&amp;nbsp;</td><td>Allergan</td><td>-</td><td>动物眼部软膏，防止干燥</td></tr><tr><td>生理盐水 (0.9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>给予动物以防止脱水</td></tr><tr><td>直径3 mm的棉球&amp;nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>用于白色念珠菌感染的3 mm棉球</td></tr><tr><td>加热凝胶垫</td><td>凯斯西储大学 - 动物资源中心</td><td>-</td><td>用于维持体温并促进快速恢复</td></tr><tr><td>苏木精和伊红染色</td><td>Histoserv - MD</td><td>-</td><td>组织病理学</td></tr><tr><td>10% 甲醛&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>JC1111/MC</td><td>组织病理学</td></tr><tr><td>70% 乙醇&amp;nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>用于消毒</td></tr><tr><td>PMA - 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>细胞再刺激</td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>细胞再刺激</td></tr><tr><td>固定与破膜试剂盒</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>用于流式细胞术的细胞固定</td></tr><tr><td>结核菌素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>小鼠注射</td></tr><tr><td>25 G × 3/8 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>小鼠注射</td></tr><tr><td>Rag1 -/- 小鼠</td><td>Jackson 实验室</td><td>货号：002216</td><td>受体小鼠</td></tr><tr><td>CD45.1 同源小鼠</td><td>Jackson 实验室</td><td>货号：002014&amp;nbsp;</td><td>供体 Th17 细胞来源</td></tr><tr><td>CB17-SCID 小鼠</td><td>Jackson 实验室</td><td>货号：001303</td><td>受体小鼠</td></tr><tr><td>Balb/c 小鼠</td><td>Jackson 实验室</td><td>货号：000651</td><td>供体 Th17 细胞来源</td></tr></tbody></table>

免疫缺陷小鼠口咽念珠菌病的th17炎症模型

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

口咽部念珠菌病（OPC）的发病不仅与宿主免疫防御功能缺失有关，也与感染诱导的免疫病理反应缺乏适当调控密切相关。尽管Th17细胞被认为参与抗真菌免疫防御，但其在免疫病理过程中的作用尚不明确。本研究介绍了一种在免疫缺陷小鼠中建立与口腔念珠菌感染相关的口腔Th17免疫病理的方法。该方法基于将淋巴细胞减少的小鼠重建为 体外 培养的 Th17 细胞，随后进行口服感染 白色念珠菌 (C. albicans). 结果表明，不受控制的 Th17 细胞会导致炎症和病理变化，并与多种可测量的指标相关，包括体重减轻、促炎细胞因子产生、舌组织病理学改变和死亡率，说明该模型在研究口腔念珠菌病免疫病理学方面可能具有重要价值。调节性细胞（T调节性T细胞）对照并减轻炎症反应，表明该模型可用于测试抑制口腔炎症的新策略。该模型还可用于研究其他口腔疾病背景下的口腔Th17免疫病理学。

在此模型中，两者均 假丝酵母感染小鼠与Rag-1缺陷型未感染小鼠-/- 免疫缺陷背景的小鼠在感染前3-5天过继转移了Th17细胞。实验共使用10-12只小鼠，每组假感染（Sham infected）组包含2只小鼠，每组实验组包含4-5只小鼠 假丝酵母 感染组。初始细胞来源于同源的 Thy1.1 或 CD45.1 小鼠，以便追踪移植的 Th17 细胞 体内 分别使用 Thy1.1 或 CD45.1 染色（图1A。共转移的T调节性T细胞 源自CD45.2小鼠，以便与CD45.1 Th17细胞区分开来。在部分实验中，使用C.B-17 Thy1.2 scid 受体小鼠，从Thy1.1 Balb/C小鼠获取的Th17供体细胞以及T调节性T细胞 来自同源型 Thy1.2 小鼠的样本被使用。仅 假丝酵母感染小鼠而非未感染小鼠表现出重建的CD45.1细胞的募集与扩增+ 舌引流淋巴结中的Th17细胞，即引流淋巴结。该结果表明，真菌特异性的Th17...

尽管已有用于研究宿主免疫抗性的 Candida 感染模型，但目前尚缺乏用于研究在 Candida 感染背景下T细胞介导的免疫病理学的模型。本文中，我们描述了一种在免疫缺陷小鼠中建立与口腔念珠菌感染相关的Th17免疫病理学的方法。

免疫缺陷小鼠口咽念珠菌病的Th17炎症模型

口咽部念珠菌病（OPC）不仅由宿主免疫抵抗力缺乏引起，还与适当的调控缺失有关……

本实验的总体目标是建立一种由致病性 TH17 细胞介导的、感染依赖性的口腔炎症模型。首先将 TH17 细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，以实现该模型的构建。下一步是培养白色念珠菌真菌，收集其芽生孢子，并用 PBS 缓冲液进行制备。最后一步是通过口服方式将芽生孢子注入小鼠体内，以促进所注射的 Th17 细胞增殖并诱导口腔炎症。结果显示，注射 Th17 细胞的小鼠会出现体重下降和舌部炎症，流式细胞术和舌组织免疫组化分析证实了这一结果。因此，该技术的应用前景可延伸至口腔免疫治疗领域，此小鼠模型为此提供了有力支持。TH17 炎症模型也可用于研究其他口腔疾病背景下的 TH17 炎症。本实验操作将由我以及实验室的血管生物学博士后研究员氮气（Nitrogen Vascular）共同演示。该实验需要经分选的初始 T 细胞，以及可选的调节性 T 细胞（Treg 细胞），以建立 TH17 细胞培养体系。将 CD4 阳性、CD44 低表达、CD62L 高表达、CD25 阴性的初始 T 细胞以每孔 30,000 个细胞的密度接种于 U-bottom 96 孔板中，在 TH17 诱导条件下培养 3 至 4 天。作为对照，可将 30,000 个 CD4 阳性、CD25 阳性、FOXP3 阳性的 Treg 细胞与初始 T 细胞共同置于相同的培养条件下以诱导 TH17 细胞生成。培养 4 天后，使用移液器收集 TH17 细胞。留取少量等分试样以检测其活力。将这些细胞悬浮于0.5毫升RPMI培养基中，并加入100纳克碘化丙啶。进行流式分析时，收集大部分细胞并制备用于细胞注射。应将大部分细胞用 PBS 洗涤，离心后制备成悬液用于注射小鼠。将细胞重悬于冷 PBS 中，浓度为每毫升1000万个细胞，使用25号针头，每只小鼠腹腔注射100微升细胞悬液。其他小鼠应注射 PBS 或对照用 TH17/Treg 共培养细胞。计划在注射后三至五天用白色念珠菌感染小鼠，感染前一天做好准备。用白色念珠菌感染小鼠时，取五份CAF2-1实验室菌株的菌落，分散于100微升无菌PBS中，并将菌液悬液加入20毫升无菌培养基中。将接种后的培养基在30°C、130转/分钟振荡条件下过夜培养。次日，取10毫升培养物置于15毫升离心管中，然后在1900 × g离心5分钟。在室温下，沉淀物中含有芽生孢子，上清液应弃去。将所有收集的芽生孢子混入10毫升无菌PBS中，并转移20微升Eloqua至微量离心管中。向Eloqua中加入20微升2% XPFA，固定15至20分钟后，在固定期间使用血细胞计数板对芽生孢子进行计数。用 PBS 至少再清洗一次孢子体两次。将孢子体沉淀物置于室温下的 AB SL 一型罩内，直至确定计数。然后将孢子体重新悬浮于室温 PBS 中，浓度为每毫升 2 亿个细胞。使细胞保持待用状态，以感染小鼠。该方法此前已进行过综述，本

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医学

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了解在免疫缺陷小鼠中建立Th17细胞介导的口咽念珠菌病炎症模型的方法。该技术通过注射Th17细胞和白色念珠菌芽生孢子诱导口腔炎症，为研究T细胞免疫病理机制及开发口腔免疫治疗策略提供重要实验平台。

免疫缺陷小鼠口咽念珠菌病的Th17炎症模型

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