造血干细胞的自动定量 - 在脱钙骨的组织学图像间质细胞的相互作用

该程序的总体目标是量化骨髓中特定细胞亚群之间的关联。这是通过首先从小鼠股骨肿瘤中收集组织学冷冻切片来实现的。在第二步中，对切片进行染色以进行免疫荧光分析并获取共聚焦图像。

然后对图像进行数字分析。最终，可以模拟不同细胞类型的位置，以计算感兴趣的特定免疫细胞与其微环境之间的接触速率和频率。当我们分析骨髓中长寿命浆细胞的微环境生态位时，我们首先想到了这种方法，我们需要一种方法来明确量化骨髓组织内的细胞关联。

RA Maya 将为您演示从成年小鼠身上冷冻抽吸股骨的程序。首先，将配备硬组织刀片的标准切片机的样品和刀片温度设置为负 24 摄氏度。经过 15 分钟的适应。

将样品块固定在带有冷冻包埋介质的金属样品架上，并根据需要调整样品块的方向。修剪样品，直到骨骼完全打开并且可以看到骨髓。然后将截面厚度调整为 7 微米。

接下来，使用亲爱的皮革覆盖的木刮刀将一块粘性面的 kawamoto 胶带固定在样品块的顶部，并将样品切片并使用镊子。转动胶带，使该部分位于顶部。然后将胶带转移到玻璃显微镜载玻片上。

收集完最后一部分后，用透明胶带将胶带固定在载玻片上。让样品驱动至少 30 分钟，并将载玻片储存在零下 80 摄氏度。两名女性对样品进行成像，根据常见的免疫荧光方案对解冻的冷冻切片进行染色。

确保包括用于观察组织完整性的核染色。切片染色后，向每个样品中加入一滴落地支架，然后在激光扫描共聚焦显微镜上加入一号玻璃盖玻片。选择 20 倍物镜，并将 708 点 15 x 708 点 15 微米的视场视图设置为。

然后以每张图像 2048 x 2048 像素的速度一次对一个样本进行成像，以保持结果的可比性。将图像记录在一个通道中，用于可视化基质结构，一个通道用于细胞核，必要时将其他通道记录在感兴趣的造血细胞中。使用线平均法记录图像。

理想情况下，捕获单个相邻图像以覆盖整个股骨切片。然后以显微镜图像文件格式保存图像。然后为每个成像区域的每个通道导出一个 JPEG 文件，并在执行随机单元的模拟之前使用图像分析工具执行共定位和邻域分析的图像分割量化。

分析的骨髓图像上定位每个要模拟的图像。将以下文件放在一个文件夹中，即单元格联系人工具提供的单个 CSV 文件。原始 DPI 通道 JPEG 文件和原始基质通道 JPEG 文件对来自单个股骨样本的一系列图像进行批量模拟，以将所有原始 JPEG 文件及其相应的单个 CSV 文件同时传输到另一个文件夹中。

组装完所有文件后，启动模拟工具。然后选中 Auto load image data 框。选中此选项后，将自动打开与分析图像对应的 CSV 文件。

接下来，输入 CSV 文件的通用标签以及应用于批处理模式仿真的图像集数量。然后加载从 S Stroma 通道生成的 J peg 文件，文件名以 3 结尾，以生成 DPI 通道的蒙版。选中 应用掩码 框并将将 DPI 图像转换为二进制掩码的阈值设置为 10。

选中 8 位和扩张框，并将膨胀等级设置为 5 像素。然后选中 width erosion 框。然后为用于分析模拟图像的邻近半径输入所需的值，并选中使用 OSU 框以使用 OSU 算法自动检测造血细胞的基质结构。

模拟为圆形。使用任何包含适当对象分割功能的图像分析软件测量分析细胞类型的细胞大小分布，并从这些测量中确定所有造血类型的 sigma。可以确定像元大小截断值，即描述图像分析工具仍识别为完整像元的最小对象的像素直径。

然后输入单元大小截止值和以像素为单位的 sigma，以模拟红色、绿色和蓝色单元的单元大小分布。接下来，在 cells and mask 选项卡中，选中 delete 框，以允许程序为单元格选择新位置（如果它与蒙版的禁止区域内的至少一个像素重叠）。在 cell exclusion 选项卡下，也选中 avoid cell overlap 框。

然后输入两个单元格中心之间允许的最小距离（以像素为单位）。如果重叠是由从一个单元格中心到另一个单元格中心的最小距离定义的，请将最大重叠面积设置为 100%然后将模拟工具设置为 1000 次重复。然后选中 auto save sales 框，将批次中每个图像的所有重复的模拟对象的坐标保存为文本格式的 wrecked 文件。

同时为保存的文件输入通用标签。最后，单击 Run simulation（运行仿真）并确定与每个记录的图像对应的 1000 个模拟图像集的平均接触频率和邻近频率。对于此划分，平均接触和邻近计数按每张图像记录的细胞计数，并将频率与记录图像的自动共定位分析结果进行比较。

在该图中，提出了嗜酸性粒细胞、浆细胞和 B 细胞与荧光嵌合骨髓的基质细胞微环境的定位分析。由像元接触和邻近分析工具生成的 CSV 文件包含每个像元群的像元计数和总面积（以像素为单位）以及接触或邻近计数。在执行随机细胞定位的模拟之前，必须确定将细胞大小分布描述为高斯分布的参数，在此模拟中，保持为三个细胞群测量的 sigma 的相对值。

虽然以像素定义的 Sigma 值被设置为与记录的单元格的视觉外观相匹配，以定义可以放置单元格的区域，但从 DAPI 通道生成了掩码。然后确定值 10 是生成二进制图像的最佳密度阈值。然后按预期测试浆细胞、嗜酸性粒细胞或 B 细胞与基质细胞接触的相关性。

这些分析显示，与浆细胞和 B 细胞的模拟相比，记录图像中的接触率明显更高。相比之下，在嗜酸性粒细胞基质细胞接触方面没有观察到明显差异。该方法可以帮助回答任何需要分析骨髓复杂组织结构的领域的关键问题，例如免疫学、血液学、病理学或干细胞生物学。