Name: 造血干细胞的自动定量 - 在脱钙骨的组织学图像间质细胞的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜对小鼠股骨骨髓组织切片进行免疫荧光染色和数字图像分析，以定量评估特定免疫细胞亚群之间的相互作用和接触频率。该方法为免疫学和干细胞生物学研究提供了可靠的技术手段。

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我们感谢Andreas Radbruch的宝贵讨论。感谢Sabine Gruczek、Patrick Thiemann和Manuela Ohde在动物护理方面的协助，以及Robert Günther提供的出色技术支持。感谢我们培训过的评分员Laura Oehme、Jannike Bayat-Sarmadi、Karolin Pollok、Katrin Roth、Florence Pache和Katharina Horn对组织学样本的评估，以及Randy Lindquist对稿件的校对。我们感谢美国亚利桑那州斯科茨代尔梅奥诊所（Mayo Clinic）的J.和N. Lee提供的MBP特异性抗体。
本工作由德国研究基金会（DFG HA5354/4-1）、DFG 活体显微成像核心设施网络资助项目 JIMI、TRR130/TP17 以及 DFG FOR 2165（HA5354/6-1）资助，资助对象为 A.E.H。S.Z. 获得柏林传染病与免疫学国际马普研究生院（IMPRS-IDI）的支持。

动物实验已获得相应的州级动物福利委员会（柏林健康与社会事务局）批准，并依照现行指南和规定进行（动物实验许可证 G0194/11）。
1. 荧光骨髓嵌合小鼠的制备
注意：用于观察骨髓基质细胞的荧光骨髓嵌合小鼠的制备方法如前所述9。
<ol>
	<li>开始处理 Del-Cre x ROSA-tdRFP 小鼠（该小鼠普遍表达串联红色荧光蛋白（tdRFP）11-13），以准备进行辐照。或者，也可使用任何其他普遍表达荧光蛋白的小鼠品系。在辐照前两天，通过饮用水给予小鼠 1 mg/ml 新霉素和 1 mg/ml 维生素（A、D3、E、C）。</li>
	<li>使用铯-137 γ射线辐照仪，在 3 小时间隔内对小鼠进行两次 3.8 Gray 的辐照。操作时，将小鼠放入适用于相应辐照仪的辐照用扇形笼中。 
	注意：&#160;本研究所对小鼠辐照无需麻醉。&#160;请遵循所在机构关于辐照过程中是否使用麻醉的政策。&#160;若小鼠出现疼痛迹象，应在辐照后每天皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。</li>
	<li>次日，通过静脉注射将来自 C57BL/6 供体小鼠长骨的 3 × 106 个骨髓细胞悬浮于转移缓冲液9中，以重建小鼠造血系统。继续给予新霉素和维生素达两周，并在此期间监测小鼠的健康状况和体重变化。在开始特定实验处理（例如，免疫接种）前，至少等待 4 周，以确保免疫系统充分重建9。</li>
	<li>处死小鼠&#160;并将其&#160;置于解剖板上，用 70% 乙醇消毒腿部。&#160;应依照所在机构的政策实施安乐死。&#160;本研究所采用颈椎脱臼法。</li>
	<li>使用镊子和剪刀去除大腿部位的皮肤。清除肌肉组织以暴露股骨。用镊子和剪刀从髋关节和膝关节处脱位股骨。注意避免折断或切割骨骼。</li>
	<li>用剪刀小心去除骨骼上残留的大块肌肉组织和软骨。再用实验室纸巾轻轻擦拭骨骼以去除残余肌肉组织。将清理干净的骨骼收集至含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。</li>
	<li>将完整的股骨在 4% 多聚甲醛（PFA，电子显微镜级）中固定 4–6 小时。</li>
	<li>弃去 PFA，将骨骼在含 10% 蔗糖的 PBS 中过夜孵育。次日，将骨骼在含 20% 蔗糖的 PBS 中过夜孵育。再下一日，将骨骼在含 30% 蔗糖的 PBS 中过夜孵育。</li>
</ol>
2. 骨组织的冷冻切片
注意：在30%蔗糖中放置16 - 24小时后，将骨骼冷冻并根据川本的胶带法进行冷冻切片14,15。
<ol>
	<li>在通风橱内准备一个大烧杯（2,000 ml 体积），加入干冰和丙酮（体积比约为 2:1，例如 400 ml 干冰和 200 ml 丙酮）。将一个小烧杯（150 - 250 ml 体积）内装入约 30 - 50 ml 正己烷，并放入大烧杯中。等待混合物冷却（约 10 分钟，直至大烧杯外壁出现霜层）。</li>
	<li>将标记好的冷冻模具用 Super Cryoembedding Medium（SCEM）填充至 ¾ 体积；小心地将骨组织放入其中，使其完全浸没，并避免接触模具边缘。用大镊子夹住冷冻模具，使模具底部轻轻接触正己烷液面。
	<ol>
		<li>等待 SCEM 外围边缘冻结（以变浑浊为标志，约需 15 秒）。随后将模具完全浸入正己烷中，继续冷冻 1 - 2 分钟。取出已冻结的样品，先用玻璃纸包裹，再用铝箔包裹（以防止样品干燥及避免光照）。储存于 -80 °C，直至进行冷冻切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对股骨进行冷冻切片时，使用适用于硬组织的标准切片机和切片刀。</li>
	<li>将切片机的样品温度和刀片温度均设定为 -24 °C。切片前让样品在切片机中平衡约 15 分钟。
	<ol>
		<li>用 SCEM 或最佳切割温度（OCT）包埋介质将样品块固定在金属样品托上。必要时调整样品块的方向。修块至骨组织完全暴露且骨髓可见。将切片厚度设为 7 µm（弃去第一张切片）。</li>
		<li>使用鹿皮包裹的木制刮刀，将 Kawamoto 胶带的粘性面朝上贴附在样品块顶部。随后进行切片，并翻转胶带使切片位于上表面。用镊子将胶带转移至载玻片上，并用透明胶带将胶带固定在载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让切片在室温下干燥至少 30 分钟，之后储存于 -80 °C 备用。未染色和未封片的载玻片应存放于塑料载玻片盒中，每张载玻片之间用隔片隔开，以防粘连。染色并封片后的载玻片可在 4 °C 的纸板载玻片盒中保存最多一周。</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>根据常规免疫荧光实验方案解冻并染色冷冻切片9。包括使用细胞核染料，例如，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI），以观察组织完整性。 
	注意：例如，使用RFP染色以显示基质细胞（抗RFP-生物素抗体和链霉亲和素-Alexa Fluor 555），用大鼠抗主要碱性蛋白（MBP）抗体及抗大鼠-Alexa Fluor 647抗体染色嗜酸性粒细胞，用大鼠抗B220-Alexa Fluor 594抗体染色B细胞，以及用抗κ轻链-异硫氰酸荧光素（FITC）和抗λ1轻链-FITC抗体染色浆细胞（染色步骤的详细信息见9）。</li>
	<li>封片：在切片上滴加一滴荧光封片剂，然后小心地加盖#1玻璃盖玻片，避免产生气泡。随后使用配备适用于所用染色荧光染料激光线的仪器进行激光扫描共聚焦显微镜成像。</li>
	<li>为利用Wimasis工具对骨髓造血细胞与基质细胞进行自动共定位分析而采集图像时，请采用以下设置：
	<ol>
		<li>使用20倍物镜，视野大小为708.15 × 708.15 µm。为实现自动化分析，所有图像应保持一致的分辨率，即2,048 × 2,048像素（px），以确保结果具有可比性。</li>
		<li>记录一个基质结构通道（例如，561 nm激光线），一个细胞核通道（例如，DAPI，405 nm），以及额外的造血细胞目标通道（例如，3个通道，488/594/633 nm分别用于嗜酸性粒细胞、B细胞和浆细胞）。</li>
		<li>使用4次线平均进行图像采集16。理想情况下，通过连续拍摄相邻图像覆盖整个股骨切片区域；或者，也可从骨髓不同区域（骨干和骨骺）拍摄非相邻图像。 
		注意：应避免相邻图像之间出现重叠（以防在重叠区域重复分析细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将图像保存为显微镜图像文件格式。在图像查看/分析软件中检查各通道的对比度，并在必要时进行调整。</li>
	<li>每个图像文件导出3个.jpg文件：一个为DAPI通道的.jpg文件（红/绿/蓝（RGB）格式，伪彩色编码为黄色），一个为基质通道的.jpg文件（灰度图像），以及一个包含造血细胞各通道的.jpg文件（最多3个通道，RGB格式，例如，FITC（浆细胞，伪彩色：绿色）/ Alexa Fluor 594（B细胞，伪彩色：蓝色）/ Alexa Fluor 647（嗜酸性粒细胞，伪彩色：红色））。</li>
</ol>
4. 自动化图像分析
<ol>
	<li>使用图像分析工具进行图像分割、共定位量化以及邻域分析（参见讨论部分）。</li>
	<li>若使用 Wimasis 工具，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>每幅图像上传3个 .jpg 文件，文件名相同，后接下划线及表示图像类型的数字。</li>
		<li>使用 _1 表示造血细胞的 .jpg 文件，_2 表示 DAPI 通道的 .jpg 文件，_3 表示基质通道的 .jpg 文件。例如：Image1_1.jpg（造血细胞）、Image1_2.jpg（DAPI 通道）和 Image1_3.jpg（基质通道）。通过客户账户上传图像。</li>
		<li>如需进行细胞接触量化，请点击相应区域选择“细胞接触”工具；如需进行细胞邻近量化，请选择“细胞邻近”工具，并输入偏好的邻近半径（单位为 µm，从细胞边缘开始测量）。</li>
		<li>下载结果。 
		注意：结果包括 .jpg 文件，显示造血细胞和基质通道，并高亮标注所检测对象的边界；还包括每个图像的单独 .csv 文件，以及一个包含所有上传图像数据的汇总 .csv 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据接触测量结果，确定与基质细胞接触的造血细胞（红色、绿色或蓝色细胞）的频率，或红色、绿色或蓝色细胞与其他类型造血细胞接触的频率（代表性结果见图4）。为计算频率，将每幅图像中的接触计数除以该图像中的总细胞计数。
	<ol>
		<li>对于单只小鼠的实验，将单只小鼠所有图像的总接触计数相加，再除以所有图像总细胞计数之和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据邻近测量结果，确定在选定距离内位于基质细胞周围的红色、绿色或蓝色细胞的频率，以及如步骤 4.3 所述，红色、绿色或蓝色细胞与其他类型造血细胞处于偏近邻关系的频率（参见代表性结果，图4）。</li>
</ol>
5. 随机骨髓定位的模拟
<ol>
	<li>在对分析的骨髓组织学图像执行随机细胞定位模拟之前，需预先准备以下文件：细胞接触分析工具提供的单个 .csv 文件、DAPI 通道的原始 .jpg 文件以及基质通道的原始 .jpg 文件。</li>
	<li>为了对一系列图像执行批量模拟（例如， 将来自同一股骨切片的所有图像（包括所有原始 .jpg 文件（_1、_2 和 _3）以及对应的单个 .csv 文件）收集到一个文件夹中。 
	注意：随机骨髓细胞定位的模拟工具可应要求提供。</li>
	<li>启动模拟工具，勾选“自动加载图像数据”选项。 
	注意：程序将自动从 .csv 文件中读取细胞计数和平均细胞大小。这些数值将显示在“细胞数量”和“细胞大小平均值”对应的框中。图5A).</li>
	<li>输入 .csv 文件的通用标签， 即， 它们名称中的共同因素。输入应用于批处理模式模拟的图像集数量。</li>
	<li>加载由基质通道生成的 .jpg 文件（文件名以 _3 结尾）。</li>
	<li>输入从 DAPI 通道生成掩膜的设置参数：
	<ol>
		<li>勾选“应用掩膜？”选项。将DAPI图像转换为二值掩膜的阈值设置为10（范围0 - 255）。</li>
		<li>勾选“8位？”复选框。勾选“膨胀？”复选框，并将膨胀程度设置为5像素。勾选“含腐蚀？”复选框。</li>
		<li>输入用于分析模拟图像的邻域半径（vicinity radius）的期望值。对于一幅尺寸为 708.15 × 708.15 µm、像素大小为 2,048 × 2,048 px（像素缩放比例 xy：0.346 µm）的图像，29 px 对应 10 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>勾选“使用Otsu？”以启用Otsu算法17 用于间质结构的自动检测。 
	注意：此算法与接触和邻近工具所使用的算法相同。在对记录图像和模拟图像进行自动化分析时，使用相同的图像分割算法对于保持数据的可比性至关重要。</li>
	<li>输入造血细胞的设置参数，这些细胞被模拟为圆形结构。 
	注意：红、绿、蓝细胞的数量直接从 .csv 文件中加载（另见步骤 5.6）。
	<ol>
		<li>使用模拟工具计算红色、绿色和蓝色细胞的平均直径（像素）。通过将图像中每种细胞类型的总面积（像素）除以每张图像的总细胞数，确定单个细胞的平均面积。利用平均面积，根据公式计算圆盘的半径。将半径乘以2得到平均直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用任何包含目标分割功能的图像分析软件，测量所分析细胞类型的细胞大小分布。确定所有造血细胞类型的σ值18 和 图5B). 
	注意：由于所记录细胞的细胞大小分布未通过自动图像分析确定，因此使用高斯分布来近似真实分布。分布曲线的宽度由 σ 描述，不同细胞类型之间的 σ 值可能差异较大。（详见 图5B).
	<ol>
		<li>根据这些测量结果，确定“细胞大小阈值”：即图像分析工具仍能识别为完整细胞的最小物体的像素直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在图形用户界面上的相应输入框中输入参数图5A).
	<ol>
		<li>输入细胞大小的截断值， 即， 模拟中允许的最小细胞尺寸（以像素为直径）。</li>
		<li>输入用于模拟红、绿、蓝细胞（来自步骤 5.9）大小分布的 σ（单位：px）</li>
		<li>在“掩膜中的细胞”子部分中勾选“删除”选项。通过此设置，如果细胞与掩膜的禁入区域中至少一个像素重叠，程序将为该细胞选择一个新的位置。在“细胞排除”子部分中勾选“避免细胞重叠？”选项。</li>
		<li>输入两个细胞中心之间允许的最小距离（单位：px）。 
		注意：最小距离需从记录的图像中确定。若最小距离测量错误，将导致记录图像与模拟图像比较结果出现偏差或人为假象。</li>
		<li>如果重叠区域由中心到中心的最小距离定义，则将最大重叠面积设置为100%。</li>
		<li>将模拟工具设置为重复1,000次。</li>
		<li>勾选“自动保存细胞？”选项，以将每批次图像中所有重复模拟对象的坐标保存为 .rect 文件（文本格式）。勾选“自动保存图像？”选项，以将每个模拟图像保存为 .tiff 文件。为保存的文件输入一个通用标签。 
		注意：“自动保存细胞？”选项与保存实际的模拟图像相比，可减少模拟运行时间和总体数据量。.rect 文件将模拟细胞的坐标保存为矩形，如有需要，可据此转换为模拟图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单击“运行模拟”以开始模拟。 
	注意：该模拟工具会自动为每幅图像的1,000次模拟生成一个.csv文件，其中包含在每组重复模拟中，红、绿、蓝细胞与红、绿、蓝及基质细胞之间的平均接触计数和邻近计数。此外，针对所有这些数值，还提供了1,000次模拟结果的平均值、标准差（STD）和平均值标准误差（SEM）。</li>
	<li>计算一组1,000张模拟图像的平均接触频率和邻近频率。为此，将平均接触次数和邻近次数除以每张图像中记录的细胞数量。将所得频率与记录图像的自动共定位分析结果进行比较。</li>
	<li>根据分析选择适当的统计方法19 （用于 图7我们采用了双尾 Wilcoxon 符号秩检验。</li>
</ol>

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<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
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</ol>

Juan Escribano Navarro 隶属于德国慕尼黑的 Wimasis GmbH。其他作者声明无利益冲突。

尽管现代光学成像技术已取得进展，但组织学数据的分析仍常受限于缺乏适当的定量工具和方法，或受限于仅关注小范围感兴趣区域的有偏分析。本文介绍的协同方法结合了覆盖整个骨髓区域的图像分析、多种造血和基质细胞类型的自动分割与对象识别、共定位分析，最后通过一款新设计的定制模拟软件提供非随机接触事件的验证工具。
由于骨组织中存在多种不同的组织密度，对包含骨髓在内的完整骨骼进行组织学切片一直较为困难——一方面为非常坚硬的矿化骨组织，另一方面则是极为脆弱的骨髓，后者在与骨骼共同切片时极易遭到破坏。作为一种替代方法，本文所介绍的胶带辅助骨骼切片法14,15具有稳定组织的优势，从而可保持骨内膜区域的完整性（图1）。这些区域不仅富含成骨细胞，还被认为在干细胞维持中发挥一定作用20。
基质细胞在发育过程及骨髓细胞维持中的关键作用正变得日益明确。然而，由于以下两个原因，对这些稀有且脆弱的细胞进行分析已被证明是困难的：首先，它们难以从骨髓中分离；其次，基质细胞群体内部的异质性程度...

由于显微技术（包括光学成像）的近期快速发展，免疫学家越来越能够对完整组织环境中的细胞进行分析。悬浮状态下单个细胞的表征是理解细胞和分子功能的一种重要且不可或缺的方法。然而，对细胞在其（微）解剖学环境中进行分析，对于理解在免疫应答发育等复杂过程中协同作用的不同细胞类型之间的相互作用至关重要。
尽管显微镜观察者从图像中获取定性信息相对容易，但对这些数据进行量化仍是一个挑战，部分原因在于该领域的分析方法落后于图像采集技术的发展。许多研究人员仍然依赖耗时的手动细胞计数方法来分析组织学图像，这不仅在不同评分者之间引入了偏差，也阻碍了其他研究团队的重复验证。通常情况下，一篇论文中仅选择一幅代表性图像来支持关于细胞定位或共定位的结论，使得读者难以判断此类事件的统计学意义。
结合图像数据的全部信息含量很少被充分利用这一事实，凸显了对组织学图像进行更无偏、更快速和更全面分析方法的需求。
骨髓是一种复杂的组织，在成年脊椎动物中作为造血器官承担着重要的生命功能。除了是造血细胞1,2的起源地并在B淋巴细胞发育过程中发挥重要作用3之外，骨髓还是启动免疫反应的场所4，并支持成熟的、再循环的B细胞存活5。此外，在过去十年中，骨髓在维持免疫记忆方面的作用日益受到重视，因为已发现多种构成免疫记忆的细胞类型定位于此6-9。
骨髓复杂的组织结构与其功能之间的关系仍不明确。与具有T细胞区和B细胞区等宏观区室的次级淋巴器官不同，骨髓缺乏明确的宏观区室化结构。迄今为止，骨髓中的不同区室主要根据其与骨皮质或血管系统的相对位置来定义。骨髓中多种定居的基质细胞群体在支持干细胞、B细胞发育以及维持免疫记忆细胞群体（如长寿浆细胞（PCs）、CD4+ 和 CD8+ 记忆T细胞）等过程中的重要作用，明确提示骨髓中存在一定程度的微区室化结构。
这些观察结果促使人们提出了骨髓中存在不同微解剖生态位的概念，这些生态位分别特化于特定功能（如干细胞维持、不同阶段的B细胞发育以及免疫记忆的维持）。尽管执行不同功能的生态位之间似乎存在一定程度的异质性，但某些由基质细胞产生的因子，如CXC趋化因子配体12（CXCL12）或白细胞介素7（IL-7），是多种此类生态位的关键组分10。由于骨髓基质细胞具有细长的树突状突起，贯穿整个骨髓形成网络状结构，且缺乏可用于区分基质细胞亚群的特异性标记物，因此对其可视化和表征十分困难。
目前尚不清楚这些微环境在细胞和分子组成方面有多少共同特征，以及哪些组分使得某一特定微环境具有独特性。除了基质细胞外，造血细胞类型也被证明至少在某些微环境中通过提供特定信号发挥关键作用。显然，微环境组成的复杂性 necessitates 对其进行深入分析 原位，免疫学家和血液学家对骨髓微结构的关注日益增加， 例如， 通过分析其细胞组分之间的空间关系。
本文介绍了一种自动化且无偏倚地定量分析骨髓中细胞共定位及邻近关系的策略。详细流程包括构建嵌合小鼠（携带荧光基质细胞和非荧光造血细胞）、制备未脱钙骨组织的组织学切片、获取覆盖整个骨骼的共聚焦图像，以及通过模拟工具对细胞共定位进行自动化图像分析及其与随机分布的验证与区分（图8）。

<table><tbody><tr><td>新霉素</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>N6386 SIGMA</td><td>新霉素三硫酸盐水合物，欧盟危险品代码：GHS08</td></tr><tr><td>Ursovit AD3EC</td><td>Serumwerke Bernburg</td><td></td><td>每1 ml含有：50,000 I.E. 棕榈酸视黄酯、5,000 I.E. 胆钙化醇、30 mg 醋酸生育酚、100 mg 抗坏血酸、1 mg 山梨酸、200 mg 聚氧35蓖麻油、0.5 mg 没食子酸丙酯</td></tr><tr><td>转移缓冲液（100 ml PBS，1 ml 1 M HEPES，50 U/ml 青霉素/链霉素）</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>P4333, H3375</td><td></td></tr><tr><td>与鸡γ球蛋白偶联的4-羟基-3-硝基苯乙酰半抗原</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡γ球蛋白（CGG）100 mg</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>D602-0100</td><td></td></tr><tr><td>20% 甲醛溶液（电镜级）</td><td>Science Services</td><td>15713</td><td>欧盟危险品代码：GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>D(+)-蔗糖</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>179124 SIGMA-ALDRICH</td><td>欧盟危险品代码：GHS02, GHS07</td></tr><tr><td>己烷</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>208752 SIGMA-ALDRICH</td><td>欧盟危险品代码：GHS02, GHS07, GHS08, GHS09</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 冷冻模具（标准型）</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4557</td><td>25 x 20 x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kawamoto 的 SCEM 包埋介质</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kawamoto 的冷冻切片制备试剂盒&amp;nbsp;</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kawamoto 的 Cryofilm 2C(9)型</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片 MX35 premier plus，低剖面</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>3052835</td><td>长 × 宽：80 x 8 mm (31.5 x 3.13")，厚度：0.25 mm (0.01")</td></tr><tr><td>兔抗RFP多克隆抗体，生物素标记</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>600-406-379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 链霉亲和素</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>S-32355</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗MBP</td><td>J. and N. Lee</td><td></td><td>可从以下地址获取：J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, 美国，克隆号 MT-14.7</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠-Alexa Fluor 647</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗B220 - Alexa Fluor 594</td><td></td><td></td><td>由本实验室（DRFZ）自行制备和偶联，克隆号 RA3.6B2，Alexa Fluor 594 来自 Life Technologies</td></tr><tr><td>小鼠抗Ig轻链 - FITC</td><td></td><td></td><td>由本实验室（DRFZ）自行制备和偶联，克隆号 LS136</td></tr><tr><td>大鼠抗κ轻链 - FITC</td><td></td><td></td><td>由本实验室（DRFZ）自行制备和偶联，克隆号 187.1</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>D9542 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td><a href="http://www.dako.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> DAKO</a></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（24 x 24 x 0.13–0.16 mm）</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>H875.2</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片（75 x 25 mm）</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR</a></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td>配备405、488、561、594、633 nm激光线和20X/0.8 NA空气物镜。我们使用的是蔡司LSM710显微镜及Zen 2010版本6.0软件。</td></tr><tr><td>骨髓自动图像分析工具</td><td><a href="http://www.wimasis.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Wimasis, 慕尼黑</a></td><td></td><td>细胞接触工具和细胞邻近工具可根据请求由Wimasis提供。</td></tr><tr><td>VC2012运行库</td><td>Microsoft</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679" target="_blank"&gt;免费下载&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>随机细胞定位模拟工具</td><td></td><td></td><td>可根据请求由我们提供</td></tr><tr><td>具备图像分割功能的图像分析软件</td><td></td><td></td><td>我们使用Volocity（Perkin Elmer）测量骨髓中造血细胞类型的细胞大小分布（&lt;strong&gt;图5&lt;/strong&gt;）。其他可选软件包括Definiens图像分析（Definiens）或Cell Profiler（&lt;a href="http://www.cellprofiler.org" target="_blank"&gt;免费下载&lt;/a&gt;）</td></tr><tr><td>Fiji图像分析软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank"&gt;免费下载&lt;/a&gt;。Fiji由经过培训的评分员用于手动细胞计数（&lt;strong&gt;图3&lt;/strong&gt;）。</td></tr></tbody></table>

未脱钙骨组织切片中造血细胞与基质细胞相互作用的自动化定量分析

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

共聚焦显微镜是分析多种细胞类型在骨髓等复杂组织中定位的首选方法。然而，细胞定位的分析与定量较为困难，因为在许多情况下依赖于人工计数，从而可能引入评分者依赖性偏差，并降低评分者间的一致性。此外，当两种细胞的共定位是由随机分布所致还是反映了细胞间的偏好性关联时，往往难以判断，尤其是在不同细胞类型的出现频率差异较大的情况下。本文介绍了一种对骨髓中细胞共定位进行无偏定量的方法。该方案描述了用于获取包含骨髓的完整小鼠长骨组织切片的样本制备流程，以及染色步骤和高分辨率图像的采集方法。同时提供了一套分析流程，从在二维（2D）骨髓图像中识别造血与非造血细胞类型，到定量分析这些细胞之间的直接接触。该流程还包括邻域分析，以获取围绕特定细胞类型的细胞微环境信息。为了评估两种细胞类型的共定位是随机细胞分布的单纯结果，还是反映了细胞间的偏好性关联，采用了一种适用于检验造血细胞及基质细胞假设的模拟分析工具。该方法不仅限于骨髓研究，还可扩展至其他组织，以实现组织学数据的可重复、定量分析。

采用Kawamoto胶带法切割未脱钙骨的冷冻切片，可将整块骨以完整切片的形式进行切取，骨髓腔内壁区域的骨髓仍附着于矿化骨组织上，无论是在骨干区域还是在富含小梁骨的骨骺区域均能保持完整（图1）。切片的核染色显示，尽管制备过程中难以完全避免出现微小裂纹，但窦状隙、动脉结构以及实质的网状网络均得以完整保留。
以红色荧光嵌合骨髓的免疫荧光染色及其后续分析为例，展示了嗜酸性粒细胞（主要碱性蛋白，MBP）、浆细胞（κ和λ轻链）以及B细胞（B220）的染色结果。小鼠在重建后4周通过腹腔注射含100 µg 4-羟基-3-硝基苯乙酰半抗原偶联鸡γ球蛋白（NP-CGG）的铝佐剂疫苗进行免疫，21天后经尾静脉加强注射50 µg NP-CGG的PBS溶液，并在加强免疫后第30天进行分析。自动图像分析能够非常精确地识别基质结构，包括网状突起的微小片段。由于本系统无法确定基质细胞的数量（另见讨论部分），因此未对基质通道设置大小阈值，以确保图像中所有片段均能被检测到（图2）。浆细胞和嗜酸性粒细胞比B细胞更大，且形态更具异质性。这三种细胞类型在初...

本文介绍了一种对骨髓组织学数据进行定量分析的策略。通过对组织切片中荧光标记细胞进行共聚焦显微镜成像，获得二维图像，并对其进行自动分析。通过将不同细胞类型的共定位分析结果与模拟图像数据进行比较，可获得有关细胞间相互作用的定量信息。

共聚焦显微镜是分析多种细胞类型在骨髓等复杂组织中定位的首选方法。

本实验的总体目标是定量分析骨髓中特定细胞亚群之间的相互作用关系。首先，从鼠股骨肿瘤中获取组织学冷冻切片；第二步，对切片进行免疫荧光染色，并采集共聚焦图像用于分析。随后对图像进行数字化分析。最终，可以模拟不同类型细胞的位置，以计算特定免疫细胞与其微环境之间相互接触的速率和频率。我们最初提出该方法的想法，是在分析骨髓中长寿命浆细胞的微环境生态位时，当时迫切需要一种能够明确量化骨髓组织内细胞间关联关系的方法。RA Maya 将为您演示如何从成年小鼠中通过冷冻吸力法获取股骨。首先，将配备硬组织刀片的标准切片机的样品温度和刀片温度设置为零下24摄氏度。经过15分钟的适应后。使用冷冻包埋介质将样品块固定在金属样品托上，并根据需要调整样品块的方向。修块至骨组织完全暴露且骨髓可见为止。然后将切片厚度调整为七微米。接下来，使用包有鹿皮的木制刮刀将一段 Kawamoto 粘性胶带的粘性面朝下固定在样本包埋块的顶部，用镊子对样本进行切片。翻转胶带，使切片位于上方。然后将胶带转移至玻璃显微镜载玻片上。当收集完最后一张切片后，用透明胶带将胶带固定在载玻片上。让样本干燥至少30分钟，并将载玻片存放在负80摄氏度条件下。两名女性对解冻的冷冻切片进行成像，并根据常规免疫荧光实验方案染色样本。确保包含核染色以观察组织完整性。切片染色完成后，在每个样本上加入一滴封片剂，然后在激光扫描共聚焦显微镜上加盖一张1号玻璃盖玻片。选择20倍物镜，设定视野为708.15 × 708.15 微米。然后以每幅图像 2048 × 2048 像素逐个成像样品，以确保结果具有可比性。使用一个通道记录基质结构的图像，一个通道记录细胞核，根据需要另设其他通道记录目标造血细胞。采用逐线平均法记录图像。理想情况下，应获取单个相邻图像以覆盖整个股骨切片区域，然后将图像保存为显微镜图像文件格式。随后，对每个成像区域的每个通道分别导出一张 JPEG 文件，并使用图像分析工具对共定位和邻域分析进行图像分割定量，再进行随机细胞模拟。针对每张待模拟的骨髓图像，在分析的骨髓图像上进行定位。将以下文件放置于同一个文件夹中：由细胞接触分析工具提供的单个CSV文件、原始DPI通道的JPEG文件以及原始基质通道的JPEG文件，以便对单个股骨样本的一系列图像进行批量模拟。此时，也需将所有原始JPEG文件及其对应的单个CSV文件一并转移至另一个文件夹中。当所有文件组装完毕后，启动模拟工具，然后勾选自动加载图像数据选项。启用此选项后，系统将自动打开与已分析图像对应的 CSV 文件。接下来，输入 CSV 文件的公共标签以及用于批量模式模拟的图像集数量。然后加载由 S stroma 通道生成的 JPEG 文件，该文件的文件名以数字 3 结尾，以生成 DPI 通道的掩膜。勾选“应用掩膜”复选框，并将 DPI 图像转换为二值掩膜的阈值设置为 10。勾选八位和膨胀框，并将膨胀等级设置为5像素。然后勾选宽度腐蚀框。接着输入用于分析模拟图像的邻域半径的期望值，勾选使用OSU框以采用OSU算法自动检测造血细胞的基质结构。模拟为圆形结构。使用任何包含适当对象分割功能的图像分析软件，测量所分析细胞类型的细胞大小分布，并根据这些测量结果确定所有造血细胞类型的 sigma 值。可确定细胞大小的截断值，即以像素为单位的直径，用于描述图像分析工具仍能识别为完整细胞的最小物体。然后输入用于模拟红、绿、蓝细胞大小分布的细胞大小截断值以及以像素为单位的 sigma 值。接下来在“细胞与掩膜”标签页中，勾选删除选项，以便程序在细胞与掩膜的禁用区域内的至少一个像素发生重叠时，自动为该细胞选择新的位置。在“细胞排斥”标签页下，同时勾选避免细胞重叠选项。然后输入两个细胞中心之间允许的最小距离（单位：像素）。如果重叠由一个细胞中心到另一个细胞中心的最小距离定义，请将最大重叠面积设置为100%。接着将模拟工具设置为1000次重复。然后勾选自动保存选项，以将每批次图像每次重复的模拟对象坐标保存为文本格式的 wreck 文件。同时为保存的文件输入一个通用标签。最后，单击运行模拟，确定每组对应于各记录图像的1000张模拟图像的平均接触频率和邻近频率。为此，将平均接触次数和邻近次数除以每张图像的记录细胞数，然后将所得频率与记录图像的自动共定位分析结果进行比较。在此图中，展示了利用荧光嵌合骨髓对嗜酸性粒细胞、浆细胞和B细胞在基质细胞微环境中的定位分析。由细胞接触和邻近分析工具生成的CSV文件包含每种细胞群体的细胞计数、以像素为单位的总面积，以及接触或邻近计数。在进行细胞随机分布位置的模拟之前，需先确定用于描述细胞大小分布的高斯分布参数；在此模拟中，三种细胞群体测得的sigma相对值保持不变。尽管以像素定义的Sigma值被设定为与记录细胞的视觉外观相匹配，以界定细胞可分布的区域，但仍需从DAPI通道生成掩膜。随后确定10为生成二值图像的最佳密度阈值。接着按预期检验了浆细胞、嗜酸性粒细胞或B细胞与基质细胞接触的相关性。这些分析结果显示，与模拟数据相比，记录图像中浆细胞与B细胞的接触率显著更高。相反，嗜酸性粒细胞与基质细胞的接触则未观察到明显差异。该方法有助于回答免疫学、血液学、病理学或干细胞生物学等任何需要分析骨髓复杂组织结构领域的关键科学问题。

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。...

由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

学习使用共聚焦显微镜对小鼠股骨骨髓组织切片进行免疫荧光染色和数字图像分析，以定量评估特定免疫细胞亚群之间的相互作用和接触频率。该方法为免疫学和干细胞生物学研究提供了可靠的技术手段。

未脱钙骨组织切片中造血细胞与基质细胞相互作用的自动化定量分析

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