一时间差别染色技术再加上双边完全失神经支配吉尔在鱼类研究Ionocytes

该程序的总体目标是研究缺乏外源性神经支配的金鱼鳃中臂细胞的增殖。这是通过首先将鱼放入线粒体特异性染料浴中以对先前存在的线粒体（丰富的臂细胞）进行染色来实现的。第二步是对鳃进行完全双侧去神经支配。

接下来，对鱼实施安乐死。收获鳃。在 TPA 处使用抗钠钾抗体标记细胞。

然后最后一步是对预先存在的和新分化的细胞进行成像和计数。最终，这种具有双侧 guild 去神经支配的时间差分染色技术用于显示金鱼中鳃细胞的增殖和分布，而无需来自中枢神经系统的任何神经输入。因此，该技术的主要优点是它可以用来了解离子的动态摄取并检查细胞在鱼类胃肠道上皮细胞中的重新分布。

首先，通过将 50 μg 溶解在 94 μL 二甲基亚砜中来制备一种毫摩尔二尖瓣追踪剂红色储备液，并避光。接下来，准备 3 到 6 个最大容量为 600 毫升的暗盒。在每个盒子中装满 400 毫升系统水，并在每个盒子中放置一个气石以提供氧气来源。

将重达 30 至 40 克的金鱼放入盒子中。30 分钟后，添加 Mitre 追踪器溶液，得到全浓度的 0.1 微摩尔染料和 0.01% DMSO。将鱼洗澡四个小时。

四个小时后，打开流向盒子的水流，让染料冲走。如果这些是对照动物，请将鱼恢复 3 到 5 天，然后进行免疫组化，否则进行完整的双侧去神经术程序。首先，将鱼放入充气的苯佐卡因水浴中麻醉鱼。

停止呼吸后，将鱼放在手术台上，并将一根管子插入颊腔 要用充气麻醉液冲洗鳃，请放置鱼的位置，使头部略微向下倾斜，以便更好地进入第四鳃弓后面的区域。用直的标准镊子轻轻提起鳃盖， 然后将组织牵开器放置在鳃盖和头部内侧之间。小心地打开组织牵开器，使鳃盖远离头部并保持鳃暴露在外。

将牵开器手柄放在头部旁边，以提供对所有四个鳃弓的访问。检查麻醉溶液是否正在冲洗鳃，并在第四鳃弓和后脑勺之间放置弯曲或笔直的标准图案镊子。轻轻打开镊子，在韧带中产生张力。

用一对 5 号镊子将第四个鳃弓连接到头部。通过刺穿上皮，将鳃弓的背端连接到耳腔，形成一个 2 到 3 毫米的开口。小心不要深入太深，因为有损坏主要血管的风险。

接下来，用五号镊子拿着一个小棉签，用它小心地扩大切口，露出第九和第十神经。使用数字 5 镊子将神经从任何结缔组织中解放出来。同样，注意不要损伤血管。

暴露并识别神经后，使用弯曲的弹簧剪刀在握住切口的同时小心地剪断神经。用标准形状的直镊子打开。切断神经后，轻轻缩回弯曲的镊子并取出组织。

不需要牵开器缝合，因为切口应在 24 至 48 小时内自行闭合。在头部的另一侧重复该过程后，将鳃的冲洗从麻醉切换到新鲜的充气水，让鱼从麻醉中恢复过来。一旦耳廓运动恢复，将鱼移入实验水箱中休养至少 24 小时。

最后，在对鱼实施安乐死之前，通过刺穿第四鳃弓后面的上皮而不切断神经，对另一组鱼进行假手术。将 3 至 4 毫升 4% PFA 放入闪烁瓶中。每个鳃弓使用一小瓶。

此外，乘坐一艘小型乳清船，装满一艘 XPBS。这将用于在切除组织后清洗组织。将所有溶液放在冰上。

用过量的苯佐卡因对鱼实施安乐死后，用钝镊子提起头部一侧的烫发，用弯曲的剪刀切断肱鳃篮的每一端。接下来，使用钝镊子小心地通过 Rackers 夹起鳃并将其从耳腔中提起。立即用冰冷的 XPBS 清洗鳃，以去除多余的苯和血液，然后将切除的鳃放入装满 4%PFA 的小瓶中，固定后在 4 摄氏度下固定所有切除的鳃过夜。

在一个 XPBS 中洗去 X-S-P-F-A，然后将组织放入装有 1.5 毫升 1%Tritton x 的 2 毫升子弹管中。将子弹管在摇床上室温下放置 6 小时或在 4 摄氏度下过夜。为了渗透组织，通过将 4 μL NKA 和 ZN 12 一抗添加到 992 μL 的 1 个 XPBS 中，制备 1 至 250 稀释的每种一抗。

确保两种一抗已在同一宿主中产生。吸出 Triton X 溶液，先不洗涤组织和一抗溶液，然后在摇床上室温孵育 6 小时或在 4 摄氏度下过夜。孵育后，吸出一抗溶液并洗涤一抗 3 次，每次 3 分钟。

使用一个 XPBS。通过将 5 μL 二抗储备液混合到 995 μL 的 1 个 XPBS 中，制备 1 至 200 稀释度的二抗。从上次洗涤中吸出 PBS 后，涂抹二抗并在室温下孵育 6 小时或在摇床上在 4 摄氏度下孵育过夜。

最后，像以前一样洗涤组织 3 次，每次 5 分钟，去除多余的二抗，洗涤后，首先将鳃放入 200 μL 的 XPBS 液滴中，放在平坦的显微镜载玻片上，以固定组织。确保组织不会干燥。用弯曲的微型剪刀将鳃半 Brinks 分开。

然后将一滴 XPBS 和一滴封固剂放入凹面载玻片的凹陷处。将分离的半曲柄放入凹形载玻片中，细丝的前缘朝上，用盖玻片盖住，用指甲油轻拍盖玻片的边缘。为了防止盖玻片四处移动和移位组织，在成像前让组织沉降到凹玻片底部 10 到 15 分钟。

对于每个鳃弓，随机选择六根鳃丝进行成像，每个鳃弓产生六张图像。使用常规共聚焦显微镜对组织进行成像，取 1 到 3 微米的光学切片，在下面的图像中，箭头指示的细胞用 alpha 5 抗体染色，箭头指示的神经用 ZN 12 抗体染色。这张来自对照鱼的鳃丝的共聚焦图像显示了外源性神经支配和中枢神经束的广泛薄片分支，可能起源于第 9 和第 10 神经，如插图所示。

指示的一些细胞也是神经支配的。这张图片显示了双侧完全去神经支配两天后的鳃丝。中枢神经束减少，而层状神经支配似乎基本完整。

在这里，双侧完全去神经支配 5 天后显示的鳃丝表明外源性神经支配现在基本上不存在。定性分析表明，完全双侧去神经支配导致外源性鳃支配退化，同时保持鳃丝内细胞体的神经，通过细丝形成神经网络并进入跛行。该程序可以与其他方法结合使用，例如测量离子通量，使用钠 22 等放射性离子来回答其他研究问题。