Name: 一时间差别染色技术再加上双边完全失神经支配吉尔在鱼类研究Ionocytes (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 了解时间差染色技术结合双侧完全去神经支配方法，用于研究金鱼鳃离子细胞的增殖与分布动态。该技术可揭示外周神经支配对鱼类鳃上皮离子调控功能的影响机制。

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我们感谢渥太华大学的 William Fletcher 在动物护理方面提供的帮助。作者还要感谢不列颠哥伦比亚大学的 William Milsom 博士，他向 VT 教授了完整的双侧去神经技术。本次研究的差旅资助由渥太华大学研究生院与研究生研究部提供。本研究还得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 VT 提供的博士奖学金（PGS-D）以及向 SFP 提供的发现研究资助项目的支持。

两种实验方案均符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南，并获得了渥太华大学动物护理委员会（方案编号 BL-226）的批准。
1. 时间差异染色技术：富含线粒体的染料浴
<ol>
	<li>通过将50 µg溶于94.0 µl二甲基亚砜（100% DMSO）中，配制1 mM MitoTracker Red储存液。不使用时，将储存液避光保存于-20 °C。避免反复冻融。</li>
	<li>准备3至6个避光容器，每个容器最大容积为600 ml。向容器中加入400 ml系统用水（即鱼类常规饲养用水），并在每个容器中放入一个充气石以提供氧气（O2）。取金鱼（30–40 g），放入装有400 ml水和充气石的容器中。30分钟后，加入活体线粒体富集染料，使终浓度达到0.1 µM和0.01% DMSO。染色孵育4小时。
	<ol>
		<li>若为对照组鱼类（即未进行去神经处理），开启容器的流水系统，冲洗掉染料，并按照实验方案规定的时间恢复饲养鱼类。通常恢复时间为3至5天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>恢复期结束后，进入第3节：时间差异染色技术：免疫组织化学。若需对鱼类进行去神经处理，则进入第2节： 完全双侧去神经手术流程。</li>
</ol>
2. 完整双侧去神经手术步骤
<ol>
	<li>准备1对学生用Vannas弹簧剪（弯型）、1对标准型直头镊子、1对标准型弯头镊子、2对5号镊子、1对组织牵开器、直径1–2 mm的小棉球以及棉签（Q Tips或等效产品）。</li>
	<li>配制麻醉用水浴。首先，将10 g苯佐卡因溶解于99%乙醇中，定容至100 ml，配制成储备液。配制麻醉水浴时，取15 ml上述苯佐卡因储备液加入30 L已充气并调节至所需温度的系统水中。通过将连接空气泵或中央供气管路的气石放入水箱中，对水体进行充气。
	<ol>
		<li>将鱼放入麻醉水浴中（图1A）。</li>
		<li>待呼吸停止后，将鱼置于手术台上，并如图1B所示进行插管。方法是将导管插入其口腔腔，以持续灌流含氧气的麻醉液至鳃部。灌流鳃部可确保在去神经操作过程中，鱼体持续获得足够的O2和麻醉剂。将鱼体摆放为头部略向下倾斜的位置，以便更好地暴露第四鳃弓后方区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用直头标准型镊子轻轻抬起鳃盖，并将组织牵开器置于鳃盖与头内侧之间。小心打开牵开器，使鳃盖远离头部，保持鳃部充分暴露。</li>
	<li>在操作过程中，确保麻醉液持续灌流鳃部。将牵开器手柄放置于头部旁侧，以便充分接触全部四个鳃弓。</li>
	<li>将弯头标准型镊子插入第四鳃弓与头后部之间，轻轻张开以牵拉连接第四鳃弓与头骨的韧带，产生张力。使用一对5号镊子刺穿连接鳃弓背侧末端与鳃腔的上皮组织，制造一个2–3 mm的小切口。注意不要刺入过深，以免损伤主要血管。</li>
	<li>用5号镊子夹持小棉球，缓慢而小心地扩大切口，以暴露第IX（舌咽神经）和第X（迷走神经）神经。使用5号镊子分离神经周围的结缔组织，注意避免损伤血管。 
	注：金鱼的鳃部分支IX和X神经位于第四鳃弓后方较深位置，邻近向鳃弓供血的主要血管。</li>
	<li>确认神经后，用弯型弹簧剪在弯头标准型镊子撑开切口的同时，小心切断神经。切断神经后，轻柔撤出弯头镊子。由于上皮组织非常薄，切口通常可在24–48小时内自行闭合，因此无需缝合切口。移除组织牵开器。</li>
	<li>在头部另一侧重复相同操作。</li>
	<li>将鳃部灌流液由麻醉液切换为新鲜的充气水，使鱼从麻醉状态恢复。待鳃盖运动恢复后，将鱼转移至实验水箱中至少恢复24小时。</li>
	<li>对另一组鱼实施“假手术”操作。“假手术”操作包括在第四鳃弓后方刺穿上皮组织，但不切断神经。</li>
</ol>
3. 时间差异染色技术：免疫组织化学
<ol>
	<li>首先，配制4%多聚甲醛（PFA）于1×磷酸盐缓冲液（PBS；4 g PFA溶于96 mL PBS中）。PFA在室温下不易溶于PBS，需将溶液置于水浴中加热以助溶解。此操作应在通风橱中进行。待PFA完全溶解后，冷却至室温后使用。4 °C下可保存最多2周。</li>
	<li>在处死鱼类并取出鳃组织前，将3–4 mL 4% PFA分别加入8个闪烁瓶中（每片鳃弓对应1个闪烁瓶）。另取一小号称量舟，加入1×PBS，用于组织切除后的清洗。所有溶液均需置于冰上保存。</li>
	<li>在线粒体活性染料暴露实验结束后，将金鱼置于含过量苯佐卡因的水浴中处死。</li>
	<li>使用钝头镊子抬起头部一侧的鳃盖，用弯头剪刀切断鳃篮两端。用钝头镊子夹住鳃耙小心提起鳃组织，将其从鳃腔中取出。立即用冰冻的1×PBS清洗鳃组织，以去除残留的苯佐卡因和血液。</li>
	<li>将切除的鳃组织分别放入盛有4% PFA的独立闪烁瓶中（每片鳃弓对应一瓶），于4 °C过夜固定（O/N）。</li>
	<li>固定完成后，用1×PBS洗涤去除多余的PFA，然后将组织转移至2 mL离心管中，每管加入1.5 mL 1% Triton-X，于室温下摇床孵育6小时或4 °C过夜。此步骤用于组织通透。若整片鳃过大无法放入2 mL离心管，可将其切成足够小的片段以便放入，注意避免损伤鳃丝。
	<ol>
		<li>配制一抗稀释液：将每种一抗的原液各取4 µL（共8 µL），加入992 µL 1×PBS中混匀。确保NKA抗体（标记NKA富集细胞）与zn-12抗体（标记神经元）由同一宿主动物制备。若研究人员计划同时鉴定特定的离子细胞（IC）亚型，则需使用来自不同宿主物种的一抗与二抗，此点尤为重要。</li>
		<li>吸除Triton-X溶液，无需洗涤，直接向组织中加入1:250稀释的一抗溶液（以1×PBS稀释），包括用于检测NKA富集细胞的NKA单克隆抗体（α-5）以及用于检测神经纤维的斑马鱼特异性神经元抗体（zn-12），于室温摇床孵育6小时或4 °C过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1×PBS洗涤一抗三次，每次3分钟。操作时用移液器吸取去除管内一抗溶液。</li>
	<li>将二抗原液取5 µL加入995 µL 1×PBS中，配制成1:200稀释液。加入二抗（Alexa Fluor 488），于室温摇床孵育6小时或4 °C过夜。 
	注：MitoTracker Red的激发波长约为594 nm，呈红色荧光。因此用于标记NKA与zn-12一抗的二抗必须具有约488 nm的激发波长并发出绿色荧光。</li>
	<li>通过洗涤去除多余的二抗：按步骤3.7所述方法，用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
</ol>
4. 成像
<ol>
	<li>洗涤后，将组织置于凹面载玻片上，用于细胞和神经纤维的整体共聚焦成像。在放置组织前，先将其置于载玻片上一滴 200 µl 的 1× PBS 中，以防止组织干燥。</li>
	<li>用弯头显微剪刀分离鳃的半鳃瓣。在凹面载玻片中加入一滴 1× PBS 和一滴封片剂。</li>
	<li>将分离的半鳃瓣放入凹面载玻片中，使鳃丝前端朝上，并加盖盖玻片。用指甲油涂抹盖玻片边缘，以防止盖玻片移动并扰动组织。成像前让组织在凹面载玻片底部静置 10–15 分钟。</li>
	<li>对每一片鳃弓，随机选取六根鳃丝进行成像，每片鳃弓获得六张图像。采用常规共聚焦显微镜，以 1–3 µm 光学切片进行组织成像。 
	注意：预先存在的细胞会被 MitoTracker Red 标记，且 NKA 阳性细胞仅显示为黄色。仅显示为红色的细胞是不含 NKA 的预先存在的离子细胞（ICs）。任何新增殖的细胞仅对 NKA 呈阳性，仅显示为绿色。神经纤维也呈绿色。</li>
</ol>
5. 离子细胞定量的图像分析
<ol>
	<li>对每条已成像的鳃丝，通过滚动浏览Z堆栈的各个层面，定量评估其ICs及其相关神经支配情况，计数存在的片状和丝状ICs数量，并判断它们是新分化的、已存在的和/或有神经支配的。</li>
	<li>定量每条鳃丝或每单位面积（mm2）鳃丝中的ICs数量。使用图像采集软件附带的绘图工具，勾勒出包含ICs定量区域的鳃丝鳃小片轮廓。大多数共聚焦成像软件均提供计算图像中勾勒区域面积的功能，请使用该功能获取相应面积。</li>
	<li>将计数得到的ICs数量除以软件计算出的面积，从而获得单位面积ICs密度（例如，每 mm2）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

时间差异染色技术可作为研究离子吸收动态调控机制以及检测鳃上皮中离子细胞（ICs）时间依赖性再分布的有用工具。尽管该方法操作简便，但其成功实施依赖于若干关键步骤。金鱼必须按照实验方案规定的时间暴露于富线粒体细胞染料中。若暴露时间过短，将导致富线粒体细胞对染料的摄取不足，即， 离子细胞）。固定过程中，必须迅速切除鳃组织并避光保存，以防止光漂白。组织固定后需在两周内完成成像处理。在进行双侧神经切断手术时，应确保鱼类已充分麻醉，清晰辨认神经与血管，并在转移至恢复缸前恢复完整的鳃盖运动功能。
淡水环境使鱼类面临双重挑战：既要平衡被动的离子流失，又要应对渗透性水分摄入14。这种被动离子流失的平衡主要通过分布在鳃丝和鳃小片上皮中的离子细胞（ICs）主动吸收盐分来实现，这些细胞可直接与外界环境接触2,4,8,9,16。然而，离子细胞在鳃上的位置并非固定不变。在过去三十年中，多项研究表明，当面临离子浓度和/或温度变化的压力时，多种淡水鱼类会将鳃部的离子细胞从鳃丝或鳃小片基部重新分布至鳃小片更远端的区域1,2,4,5,17-21。此类重新分布可能导致鳃小片增厚，从而影响鳃上皮的气体交换（O2、CO2）效率22。研究人员已利用本文所述的时间差异染色技术，在不同实验条件下追踪鳃上皮上离子细胞的迁移过程及新细胞的出现情况（图1C）1,4,5。
鳃以及可能存在的鳃部离子细胞受第Ⅸ和第Ⅹ脑神经支配7,23-25这些神经分别向鳃传递传出和传入信号。它们位于口腔背侧、第4鳃弓后方。th 鳃弓。神经的可及性以及双侧去神经手术操作的难易程度因物种而异。例如，在鳟鱼中，头部尖锐且扁平的解剖结构使得神经位于第四鳃弓后方的同一平面上th 鳃弓位于一层薄组织之下，这使得神经对研究人员而言清晰可见且易于接触，便于进行去神经操作。相比之下，金鱼具有较短的吻部和更圆的头部。在金鱼中，第Ⅸ和第Ⅹ对脑神经位于体腔背侧更深的位置，位于第4鳃弓之后。th 鳃弓位于不同的平面，这种空间取向限制了对神经的接近，因而需要更加谨慎地识别并切断相应神经。去神经手术的目的是消除鳃的感觉传入和传出神经支配。鳃弓的去神经处理还可与利用放射性同位素进行的离子通量实验相结合。例如， 22Na）。这些技术可联合使用，以研究神经输入对鳃上皮离子跨膜转运的贡献。去神经手术的另一局限性在于无法区分感觉神经元与运动神经元，因此在切断神经束时，可能同时去除了这两类神经支配。若切断了运动神经，可能会影响鱼类的鳃部及鳃盖运动。因此，在进行鳃去神经实验时，鱼类术后恢复期间应持续监测其呼吸活动，以确保鳃部运动足以维持气体交换和离子交换的正常进行。
本文所述方案使用成年动物，饲养条件为12:12明暗循环周期，并饲以商业颗粒饲料。这些方法可在多个方面进行修改。首先，线粒体富集染料暴露后的恢复期可根据研究人员的实验方案需求进行调整（例如， 1、3、5 或 14 天）。在实验室中，线粒体富集染料暴露后最长的恢复期为 14 天4,514天恢复后，线粒体富集染料的荧光强度未出现显著下降。其次，α-5一抗的使用仅限于识别Na⁺/K⁺-ATP酶（NKA）富集细胞，无法区分鳃部离子细胞（ICs）的不同亚型。幸运的是，在金鱼中已证实大多数离子细胞既为线粒体富集型（MitoTracker标记），也为NKA富集型（α-5标记），但这一情况可能并不适用于所有鱼类物种。4,27未来的实验可专注于利用特异性针对多种通道、泵和交换体的抗体，追踪特定内质网亚型的时间依赖性重新分布例如， NHE，H+ 泵）。先前的研究发现，大多数经线粒体富集染料染色的离子细胞均表现出NKA免疫反应性4可通过使用针对斑马鱼来源的神经元特异性抗原（zn-12）的一抗来检测ICs的神经支配。本研究中，α-5和zn-12一抗均使用相同的二抗（Alexa Fluor 488）进行检测。这一限制源于两种一抗均为小鼠来源，但可通过NKA富集细胞与神经元在形态学上的差异加以克服，尽管二者发出相同颜色的荧光。使用不同二抗进行连续染色（例如， 先使用 Alexa Fluor 488 标记的 α-5，再使用 Alexa Fluor 594 标记的 zn-12，也可用于消除两种标记物发出相同荧光颜色的问题。最后，完整的双侧神经切断方案可进行调整，以针对特定的鳃弓神经。例如，可通过轻柔分离第一和第二鳃弓，暴露鳃篮 dorsal 端通向第一鳃弓的神经，从而对第一鳃弓进行选择性神经切断。图2B-E）。时间差分技术还可用于研究斑马鱼幼鱼发育过程中离子细胞的分布变化，以及离子转运从皮肤向鳃过渡的过程。

离子细胞（ICs）是鱼类离子调节的功能单位，分布于鳃丝和鳃小片的上皮表面4,6-8,10。尽管已描述了多种具有独特特征的亚型，但多数离子细胞的特征是线粒体密度高（因此也被称为线粒体丰富细胞），和/或富含Na+/K+ ATP酶（NKA）。通常，这些离子细胞内还含有多种参与离子调节的其他泵、离子通道和交换体（例如，Na+/H+ 交换体、Na+/Cl- 共转运体、H+ 泵）2,10,11。在离子应激（例如，暴露于低离子水环境）期间，离子细胞的重新分布与增殖作为一种代偿机制，对维持离子稳态至关重要4,8,9。
本研究描述了一种时间差异染色技术1，用于鉴定鱼类鳃中新近增殖的离子细胞（ICs）。该技术结合了鳃弓的完全双侧去神经处理。研究中所用的金鱼（Carassius auratus）非常适合用于研究鳃上皮细胞的增殖，因其具有显著的鳃结构重塑能力2。鳃重塑是指当鱼类（通常在15–30 °C条件下饲养）分别适应低温（&#60;15 °C）或低氧环境时，鳃丝间细胞团（ILCM）发生生长或回缩的现象3。以往在金鱼上应用时间差异染色技术的研究，主要关注在鳃重塑背景下离子细胞在鳃组织中的重新分布、神经支配及增殖情况4,5。Katoh 和 Kaneko1 最初开发了这一新技术，用于研究将鳉鱼（Fundulus heteroclitus）从海水（SW）转移至淡水（FW）后，其鳃部离子细胞的转化与更替过程。本研究则聚焦于在25 °C条件下驯化的金鱼中离子细胞的增殖及其神经支配。
通过时间差染色技术发现，在鳃重塑过程中，金鱼在低氧暴露及随后的常氧恢复期间，离子细胞（ICs）的数量保持恒定，但在常氧恢复阶段，受神经支配的细胞比例逐渐下降5。早在70多年前就已提出，鱼类的离子吸收机制受神经系统调控12。硬骨鱼类的鳃由面神经（VII）、舌咽神经（IX）和迷走神经（X）支配，这些神经也被称为“鳃部神经”13,14。Jonz 和 Nurse（2003）对斑马鱼（Danio rerio）鳃部神经支配的研究表明，鳃的神经支配来源既包括外源性（神经纤维的胞体位于鳃外），也包括内源性（神经纤维的胞体位于鳃内）。同一研究者还证实，鳃部的离子细胞为外源性神经支配7。
本研究采用时间差异染色技术结合全双侧鳃去神经方法，以探究缺乏外在神经支配的离子细胞（ICs）在金鱼中的增殖情况。全双侧鳃去神经是指切断第IX和第X对脑神经。这两种方法在金鱼中是可行的，因为金鱼体型相对较大（30–200 g），便于进行精细的外科手术操作，且可通过标准免疫组织化学技术轻松识别离子细胞。在本研究中，离子细胞使用一种活体线粒体特异性染料（例如，MitoTracker Red）或针对Na+/K+-ATP酶α亚基的特异性一抗（α-5；Developmental Studies Hybridoma Bank，University of Iowa，Iowa City，IA）进行标记。本方案提供了一种直观的方法，用于观察和分析离子细胞在鱼鳃上的重新分布与增殖过程。

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Alrdich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-5 一抗</td><td>发育杂交瘤库</td><td>a5</td><td></td></tr><tr><td>zn12 一抗</td><td>发育杂交瘤库</td><td>zn12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488（抗小鼠）</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>苯佐卡因</td><td>Sigma Alrdich</td><td>E1501</td><td>对氨基苯甲酸乙酯，对氨基苯甲酸乙酯</td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>直头</td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-12</td><td>弯头</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>组织牵开器</td><td>Fine Science Tools</td><td>17009-07</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Alrdich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Alrdich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

一种结合全双侧鳃去神经术的时间差异染色技术用于研究鱼类离子细胞

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

鳃部离子细胞（ICs）是鱼类离子调节的功能单位。在成体中，它们分布于鳃的丝状和片状上皮，通过多种离子通道、泵和交换体转运 Na+、Cl- 和 Ca2+ 等离子。硬骨鱼类的鳃由面神经（VI）、舌咽神经（IX）和迷走神经（X）进行外部神经支配。其中，IX 和 X 神经也是鳃部离子细胞外部神经支配的来源。本文描述了两种用于研究离子细胞神经支配、增殖和分布的技术：时间差染色法和完全双侧鳃去神经术。简言之，先将金鱼暴露于一种活体线粒体特异性染料（例如，MitoTracker Red），该染料可标记已存在的离子细胞（呈现红色荧光）。随后，金鱼被分为两组：一组恢复 3 至 5 天，另一组则立即接受完全双侧鳃去神经处理。在恢复 3 至 5 天后，取其鳃组织并固定，用于免疫组织化学分析。接着，使用 α-5 一抗（靶向含 Na+/K+ ATPase 的细胞）与一种可标记所有离子细胞（包括新生和已存在的）的二抗联合染色，使后者呈现绿色荧光。通过共聚焦成像发现，已存在的离子细胞呈黄色（同时被线粒体特异性染料和 α-5 标记），而新生的离子细胞呈绿色（仅被 α-5 标记）。这两种技术结合使用，可用于研究鱼类在面临环境挑战时，鳃丝上离子细胞的神经支配、增殖及分布情况。

图1 展示手术台的设置（图1A），手术过程中鱼的放置位置（图1B）以及时间差异染色技术的三个最重要步骤（图1C）。在步骤1中，将鱼置于充气充足的水浴中静置30分钟 25 °C 在避光条件下。在30分钟期间，研究人员可准备溶于DMSO的富含线粒体的染料等分试样，该试样将在步骤2中加入水中。图1C）。步骤2中的孵育过程可使富含线粒体的染料从水中被富含线粒体的细胞摄取（即， ICs）。随后，鱼类可接受完整的双侧去神经手术，或假手术操作（即鱼类被麻醉并进行鳃盖操作，但神经保持完整）。第3步中的设置代表恢复室，为接受过完整双侧去神经或“假手术”处理的鱼类提供流动水体。
恢复期结束后，对鱼实施安乐死，切除鳃组织并固定，用于免疫组织化学分析。接受“假手术”处理的鱼其鳃丝上离子细胞的整体分布及神经支配情况如图所示。 图2ICs 存在于纤毛上皮以及鳃丝间区域的基部。 图 2A 显示用线粒体富集染料标记的预先存在的免疫复合物（ICs）即， 这些IC存在于去神经支配/假手术操作实施之前。 图2B 显示神经纤维支配丝状和小片状上皮中已存在和新形成的离子细胞（通过NKA免疫反应性鉴定）。最后，两幅图像的合并（图 2C） 清晰地显示出预先存在的ICs（呈黄色）和新形成的ICs（呈绿色）。 图2D 是所示细丝的IC定量代表性图 图2A-C在此特定纤维上，每毫米可见较多新增殖的ICs2 少于已有的内耳囊（N = 1）。为了消除鳃部外来神经支配的来源，切断了第IX和第X脑神经（外来支配）。 图3A 显示去除鳃丝及覆盖神经的上皮后暴露的鳃盖腔背侧区域，以显露从两大神经干延伸至支配全部四个鳃弓的第IX和第X脑神经（用罗马数字标示）图3A）；鳃弓按1至4编号。 图3B-E 示意图展示第一鳃弓的选择性去神经支配。第一鳃弓由第Ⅸ和第Ⅹ对脑神经共同支配。图3B）移除后不会影响其他鳃弓的神经支配（图3C-E）。完全的双侧去神经支配会导致鳃丝的外在神经支配逐渐丧失（图4A-C对照组鱼类表现出明显的神经束，沿鳃丝全长延伸（图4A）。完全双侧去神经支配在恢复2天后导致部分外在神经支配丧失（图4B）。在去神经支配后5天的恢复期，进一步观察到外在神经支配的消失（图 4C). 经过5天恢复后，若耳蜗内仍存在任何残余的神经支配，则可能源自鳃丝内部具有胞体的神经（内在神经支配； 图4C).
<img alt="水生麻醉装置、鱼类实验、水箱、示意图步骤：镇静过程概述。" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 去神经手术的实验装置及时间差异染色技术所用步骤顺序。(A) 用于去神经手术的手术台装置，显示麻醉池和恢复池。(B) 麻醉后插管鱼类放置方式的示例。(C) 时间差异染色技术中的关键步骤。步骤1：将鱼置于温度可控、静态曝气的水浴中，持续30分钟。步骤2：加入线粒体富集染料，终浓度为0.1 µM，使鱼在溶液中浸泡至少4小时。步骤3：重新启动水流，此时对鱼进行完全双侧鳃去神经手术或假手术。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MitoTracker Red 与鳃片中 α-5 zn-12 免疫染色显微图像；离子细胞柱状图结果。" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采用时间差异染色技术在金鱼（适应于 25 °C）完全双侧去神经后 2 天的光镜图像。（A） 通过富含线粒体的染料染色显示单个鳃小片上已存在的离子细胞（ICs；箭头）的分布情况。（B） 通过 α-5 和 zn-12 抗体分别染色显示离子细胞（新形成和已存在的）以及鳃神经（虚线箭头）的分布。箭头指示离子细胞。（C） （A）与（B）图像的叠加可区分已存在的离子细胞（呈黄色；由箭头头指示）和新增殖的离子细胞（呈绿色；由箭头指示）。（C）图插图为一个受神经支配的已存在离子细胞的放大图像。（D） 显示（A–C）各图中同一鳃小片离子细胞定量结果的代表性图表。N = 1。（C）图中的比例尺为 50 µm，适用于所有图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="Fish anatomy dissection; labeled gill arches and sensory organ; biological study microscope images." src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 显示鳃部神经支配不同阶段的代表性图像。（A） 显示第IX和X对脑神经支配全部4个鳃弓的口腔腔背侧视图。鳃弓编号为1-4。已去除鳃丝及覆盖神经的组织，以更清晰地观察神经支配情况。 （B） 1st 和 2nd 分离鳃弓以暴露感觉器官以及支配第Ⅸ和第Ⅹ对脑神经的分支st 鳃弓 （C-E） 显示选择性去神经支配过程的图像序列st 通过切断第九和第十对脑神经的分支来分离鳃弓。有关硬骨鱼类鳃部神经支配的示意图，参见Milsom的图1。 等26 图像中的白色线条是显微镜光源产生的水面反射，不代表任何形态学结构。比例尺位于图中 (E) 为4毫米，适用于所有图示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Neuronal network fluorescence microscopy image, diagram. Neuron analysis, synapse identification." src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 显示单根鳃丝上离子细胞分布及神经支配的光学显微照片st 适应25℃的金鱼的鳃弓 °C. 离子细胞（由箭头指示）用α-5抗体染色，神经（由箭头指示）用zn-12抗体染色。 （A） 对照鱼的鳃丝显示中央神经束，可能起源于IX和X脑神经（外在神经支配），并具有广泛的片状分支。部分指示的离子细胞也受到神经支配（插图）。 （B） 完全双侧去神经支配2天后的鳃丝。中央神经束有所减少，而鳃小片的神经支配则基本保持完整。 (C) 鳃丝在完全双侧去神经5天后，显示外部神经支配基本消失。定性分析表明，完全双侧去神经导致鳃丝外部神经支配退化，但保留了胞体位于鳃丝内部的神经（即内在神经支配），从而在鳃丝及鳃小片中形成神经网络。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本论文描述了一种利用时间差染色技术结合全双侧鳃去神经方法，追踪鳃部离子细胞及其神经支配重新分布的实验方案。

鳃部离子细胞（ICs）是鱼类离子调节的功能单位。在成体中，它们分布于鳃丝和鳃小片上皮组织中。

本实验的总体目标是研究缺乏外在神经支配的金鱼鳃中鳃细胞的增殖情况。首先将鱼置于线粒体特异性染料溶液中，以标记富含线粒体的已存在鳃细胞；第二步是进行鳃部双侧完全去神经手术。随后，对鱼类实施安乐死，采集鳃组织。使用针对钠钾 ATP 酶的抗体对红细胞进行标记。然后，最后一步是成像并计数已存在的和新分化的细胞。最终，这种结合双侧神经支配切除的时间差染色技术可用于展示在无中枢神经系统神经输入的情况下，金鱼鳃细胞的增殖与分布情况。因此，该技术的主要优势在于，可用于理解离子的动态摄取过程，并研究鱼类胃肠道上皮细胞的重新分布。首先，通过将 50 微克 mitral tracker red 溶解于 94 微升二甲基亚砜中，配制 1 毫摩尔的储备液，并避光保存。接着，准备 3 至 6 个最大容积为 600 毫升的避光容器。每个容器中加入 400 毫升系统水，并放入一个充气石，以提供氧气来源。将重30至40克的金鱼放入箱中。30分钟后，加入Mitre tracker溶液，使染料终浓度为0.1微摩尔，DMSO浓度为0.01%。浸泡鱼类四小时。四小时后，打开流向盒子的水流，使染料冲洗干净。如果是对照组动物，将鱼恢复饲养三至五天，然后进行免疫组织化学实验；否则，直接进行完整的双侧去神经手术。首先，将鱼置于充气的苯佐卡因水浴中，对其进行麻醉。一旦呼吸停止，将鱼置于手术台上，并将导管插入其口腔，以向鳃部灌注充氧的麻醉液。将鱼体摆放至头部略微向下倾斜的位置，以便更好地接触第四鳃弓后方区域。使用标准直头镊子轻轻提起鳃盖，然后将组织牵开器置于鳃盖与头部内侧之间。小心地撑开组织牵开器，使鳃盖远离头部，从而保持鳃部暴露。 将牵开器手柄放置在头部旁边，以暴露全部四对鳃弓。检查麻醉液是否正在灌流鳃部，并将弯型或直型标准图案镊子插入第四鳃弓与头后部之间。轻轻打开镊子，以在韧带上产生张力。使用5号镊子将第四鳃弓与头部连接。用穿刺法在上皮组织上造一个2至3毫米的开口，将鳃弓的背侧末端与耳囊腔相连。注意不要刺入过深，以免损伤主要血管。接着，用五号镊子夹住一小根棉签，小心地扩大切口以暴露第九和第十对神经。使用五号镊子将神经周围的结缔组织分离。注意不要损伤血管。神经暴露并辨认后，用弯头弹簧剪在保持切口张开的情况下小心剪断神经。使用直头标准形状镊子进行撑开。切断神经后，轻轻撤回弯头镊子，并移除组织。由于切口应在24至48小时内自行闭合，因此无需使用牵开缝线。在头部另一侧重复该操作后，将鱼鳃的灌流液从麻醉剂更换为新鲜的充气水，并让鱼从麻醉状态中恢复。一旦鱼的耳状运动恢复，立即将其转移至实验用鱼缸中，使其至少恢复24小时。最后，对另一组鱼类进行假手术操作：在安乐死前，刺穿第四鳃弓后方的上皮组织，但不切断神经。向闪烁计数瓶中加入三到四毫升的4%PFA，每个鳃弓使用一个计数瓶。此外，取一个小型浮舟，加入一份 XPBS。该溶液将用于组织切除后的清洗。所有溶液均需置于冰上保存。用过量的苯佐卡因处死鱼后，使用钝头镊子抬起头部一侧的鳃盖，再用弯头剪刀切断鳃篮的每一端。接着，用钝头镊子小心地夹住鳃丝，将鳃从鳃腔中取出。立即将鳃在冰冻的1×PBS中清洗，以去除多余的苯佐卡因和血液，并将切除的鳃放入装有4% PFA的离心管中，于4°C下固定过夜。用一毫升XPBS洗去X-S-P-F-A，将组织置于一个含有1.5毫升1% Triton X的2毫升离心管中。将离心管置于摇床上，室温震荡6小时或4°C过夜。为使组织通透，将NKA和ZN 12两种一抗分别用一毫升XPBS按1:250比例稀释，即在992微升一毫升XPBS中加入4微升的一抗。确保两种一抗均来自同一宿主。吸去 Triton X 溶液后，无需先洗涤组织，直接加入一抗溶液，在室温下于摇床上孵育六小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，吸去一抗溶液，用洗涤液将一抗洗涤三次，每次三分钟。使用1×PBS。将5微升储备的二抗与995微升1×PBS混合，配制成1:200稀释的二抗溶液。最后一次洗涤后吸去PBS，加入二抗溶液，在室温下孵育6小时，或在4°C下于摇床上过夜孵育。最后，如前所述，用 PBS 缓冲液将组织洗涤三次，每次五分钟，以去除多余的二抗。洗涤后，将组织进行封片：首先在平放的显微镜载玻片上放置一滴 200 微升的 1×PBS，将鳃组织放入其中，以防止组织干燥。使用弯头显微剪刀将鳃半边分开。然后在凹面载玻片的凹槽内分别加入一滴 XPBS 和一滴封片剂。将分离的半脑组织放入凹面载玻片中，使纤毛的前端朝上，并盖上盖玻片，用指甲油轻轻涂抹盖玻片的边缘进行密封。为防止盖玻片移动而导致组织移位，在成像前需让组织沉降到凹面载玻片底部，静置 10 至 15 分钟。对每个鳃弓，随机选取六根鳃丝进行成像，每个鳃弓获得六张图像。采用常规共聚焦显微镜对组织进行成像，获取1至3微米的光学切片。在下图中，箭头所示的细胞经ZN12抗体染色标记神经，箭头所示的细胞经α5抗体染色标记。此为对照组鱼类鳃丝的共聚焦图像，显示鳃丝存在外源性神经支配，中央神经束在鳃小片区域呈现广泛的分支结构，推测起源于第九和第十脑神经，如插图所示。部分所示细胞也存在神经支配。该图像显示完全双侧去神经支配两天后的鳃丝。中央神经束有所减少，而小叶的神经支配则基本保持完整。此处显示的是在完全双侧去神经处理五天后的鳃丝，表明外部神经支配现已基本消失。定性分析表明，完全双侧去神经会导致鳃的外部神经支配退化，同时保留细胞体位于鳃丝内部的神经，从而在鳃丝内及至鳃小片中形成神经网络。该操作可与其他方法结合使用，例如通过测量离子流，或使用放射性离子（如²²Na）来回答更多研究问题。

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科研

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