Name: 免疫组化和多标签与同一宿主物种抗体研究成人神经发生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习多重免疫荧光标记技术，用于定量分析成年海马神经发生各阶段。该方法通过血清和Fab片段阻断，解决同种宿主抗体交叉反应问题，提高神经前体细胞检测的特异性。

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作者感谢 S. Tausch 提供出色的技术支持。本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF，Bernstein Focus 01GQ0923）和德国研究基金会（DFG，FOR1738）资助。

注意：所有涉及活体动物的操作均依照欧盟指令86/609/EEC关于实验动物护理与使用的指南进行，并经当地伦理委员会（Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz）批准。
1. 胸腺嘧啶类似物的腹腔注射
<ol>
	<li>在注射前一天称量动物体重。根据次日计划进行的所有注射，计算所需的胸苷类似物总量，并计算每只动物按体重调整后的注射体积（使用10 mg/ml的储备液）。</li>
	<li>配制10 mg/ml的胸苷储备液。（注意！ 胸苷类似物具有毒性。请遵循供应商提供的具体材料安全数据表（MSDS）要求，即 穿戴实验服和手套，在化学通风橱中操作）。
	<ol>
		<li>从冷冻保存条件下取出胸苷类似物，恢复至室温（约21 °C）。称取10 mg，加入无菌生理盐水（用于BrdU和CldU）或含0.04 N NaOH的无菌生理盐水（用于IdU），涡旋混匀。置于50 °C水浴中至少10 - 15分钟，每2 - 3分钟涡旋一次，以充分溶解粉末。 
		注意：溶液在室温下可使用不超过24小时，在-20 °C下可保存数周。需避光保存（用铝箔包裹）。每次使用前应检查是否有沉淀，必要时重新溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抓住小鼠颈背部皮肤固定，使用带有30 G针头的精密注射器，在室温下经腹腔注射适当体积的储备液（根据体重调整剂量）。 
	注意：若需在同一动物中依次给予CldU和IdU，建议注射等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU，相当于50 mg/kg BrdU）。因此，应相应调整10 mg/ml储备液的注射体积。</li>
</ol>
2. 组织制备
<ol>
	<li>在灌注前一天配制4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中），4 °C保存。</li>
	<li>对深度麻醉的小鼠（3.5%异氟烷）经左心室进行心脏灌注，先用10 ml冰冻PBS灌注，随后用40 ml冰冻多聚甲醛（流速5 ml/min）灌注。取出脑组织，并在相同固定液中后固定24小时（4°C）。</li>
	<li>将脑组织依次转移至10%蔗糖溶液（4°C下24小时）和30%蔗糖溶液（直至脑组织沉底，约48小时）。冷冻时，将经抗冻保护处理的脑组织缓慢浸入-25 °C的异戊烷中，直至组织不再产生气泡。于-80 °C保存。</li>
	<li>使用冷冻切片机对脑组织进行冠状面切片，厚度为40 µm（切片机块温度为-25至-16 °C）。将切片按顺序转移至24孔细胞培养板的抗冻液各孔中（见图1）。于-20 °C保存。</li>
</ol>
<img alt="96-well plate layout, liquid handling pattern in laboratory experiment, diagram illustrating method." src="/files/ftp_upload/52551/52551fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 将切片机切片转移至24孔板的示意图。 从A1开始，将后续切片依次放入A行；到达A6后，移至下一行B，依此类推。到达D6后，返回A1并继续。此种切片排列方式可实现对每一个n的定量分析th 全脑切片。为定量新生细胞，取每6个th 脑切片（相当于一列的内容），用于免疫荧光表型分析时每隔12取一th 部分（相当于一列中两个交替行的内容）。
3. 免疫染色
注意：切片通常在配备载体板和网状插件的6孔板中以游离方式孵育。作为例外，封闭、抗体孵育和ABC反应步骤在无网状插件的12孔或24孔板中进行（每孔0.5至1 mL即可，具体体积取决于需染色的切片数量）。在这些步骤中，使用细毛刷转移切片（每次更换新溶液时需冲洗毛刷）。所有孵育步骤均需持续震荡（最高不超过150 rpm）。
<ol>
	<li>免疫组织化学（ABC法）
	<ol>
		<li>将切片从抗冻剂转移至TBS中，并彻底漂洗（4 °C下过夜一次，室温下每次10分钟，共5次），以完全去除抗冻剂。</li>
		<li>在含1.5% H2O2的TBS-T中孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。注意观察气泡产生情况，必要时重新将切片浸入溶液中。用TBS漂洗3次，每次15分钟。</li>
		<li>可选：同时将加热柜和2 N HCl预热至37 °C。将切片在2 N HCl中37 °C孵育30分钟以变性DNA。借助毛刷轻轻分离切片。</li>
		<li>可选：在0.1 M硼酸缓冲液（pH 8.5）中室温孵育10分钟以中和切片。转移时，将承载切片的网状插入物在纸巾上短暂轻拭，以去除残留的HCl。用TBS漂洗2次，每次15分钟。</li>
		<li>在TBSplus中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下1小时。</li>
		<li>将切片在用TBSplus稀释的一抗中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟。</li>
		<li>将切片在用TBSplus稀释的生物素化二抗中孵育，室温下3小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟。同时……</li>
		<li>根据制造商说明书配制ABC复合物（1% A + 1% B溶于TBS-T）。室温静置30分钟后使用。将切片在AB试剂中孵育1小时，室温。用TBS漂洗3次，每次15分钟。</li>
		<li>每6孔或12孔板准备50 ml含0.5 mg/ml DAB的TBS-T溶液，均分为两份，分别向每孔加入4 ml或2 ml。将切片转移至DAB溶液中（注意！ DAB具有毒性。请遵循供应商提供的具体MSDS要求，即穿戴实验服和手套，在通风橱中操作）。</li>
		<li>向剩余的25 ml DAB溶液中加入0.5 ml 1% H2O2，混匀后按上述体积分别加入各孔，以启动过氧化物酶反应。孵育12分钟。用TBS漂洗3次，每次15分钟。</li>
		<li>将切片用明胶封固于载玻片上，室温过夜干燥。用永久性封片剂加盖盖玻片。</li>
		<li>可选：在加盖盖玻片前进行复染（见第3.5节）。 
		注：若因背景过高导致信噪比较低，可在AB试剂孵育后（步骤3.1.8）重复H2O2处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多重免疫荧光染色
	<ol>
		<li>单重或同时多重免疫荧光染色
		<ol>
			<li>将切片从抗冻剂转移至TBS中，并彻底漂洗（4 °C下过夜一次，室温下每次10分钟，共5次），以完全去除抗冻剂。</li>
			<li>可选：参照步骤3.1.3–3.1.4。</li>
			<li>在TBSplus中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下1小时。</li>
			<li>将切片在用TBSplus稀释的一抗混合液（例如，大鼠抗BrdU、豚鼠抗DCX、山羊抗GFP）中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟。</li>
			<li>将切片在用TBSplus稀释的荧光染料标记的二抗混合液（例如，罗丹明红标记的驴抗大鼠、Alexa-647标记的驴抗豚鼠、Alexa-488标记的驴抗山羊；均来源于驴）中孵育，室温3小时或4 °C过夜。此后需避光操作。用TBS漂洗3次，每次15分钟。</li>
			<li>将切片用明胶封固于载玻片上，室温过夜干燥。用水溶性封片剂加盖盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用同一种属来源一抗的顺序多重免疫荧光染色
		<ol>
			<li>参照步骤3.2.1.1–3.2.1.3。</li>
			<li>将切片在第一种一抗（例如，兔抗抗原A）中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>将切片在第一种荧光染料标记的二抗（例如，罗丹明红标记的驴抗兔）中孵育，室温3小时。此后需避光操作。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>用与一抗同源的正常血清（例如，兔血清）在TBSplus中孵育3小时，室温，以饱和第一种二抗上未结合的抗原结合位点。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>在含50 µg/ml未标记单价Fab片段（针对一抗宿主来源，例如抗兔IgG (H+L)）的TBSplus中孵育，4 °C过夜，以封闭可能被第二种二抗识别的表位。</li>
			<li>至少用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。转移时，将承载切片的网状插入物在纸巾上短暂轻拭，以去除任何残留的Fab片段。</li>
			<li>将切片在第二种一抗（例如，兔抗抗原B）中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>将切片在第二种荧光染料标记的二抗（例如，Alexa-488标记的驴抗兔）中孵育，室温3小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟，然后按上述方法封片并加盖盖玻片。 
			注：若需使用不同宿主来源的抗体标记多个抗原，可将其加入步骤3.2.2.2，相应二抗加入步骤3.2.2.3。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>其中一种二抗与某一种一抗同种属 
		注：本方案适用于对BrdU或Ki67与GFAP、nestin-GFP及DCX进行四重染色。
		<ol>
			<li>严格遵循步骤3.2.1.1–3.2.1.5。在此阶段前仅使用驴血清配制TBSplus。</li>
			<li>在含3%山羊血清的TBSplus中孵育1小时，室温，以封闭α-山羊二抗上未结合的抗原结合位点。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>将切片在用TBSplus稀释的AMCA标记的山羊抗兔抗体中孵育，室温3小时或4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟，然后按上述方法封片并加盖盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>CldU与IdU共染
		<ol>
			<li>按照第3.2.1节（步骤3.2.1.1–3.2.1.2）所述方法漂洗、变性和中和切片。</li>
			<li>在含20 µg/ml未标记Fab片段（抗小鼠IgG (H+L)）的TBSplus中孵育1小时，室温。用TBS漂洗4次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>将切片在含大鼠抗BrdU（1:400；纯化IgG2）和小鼠抗BrdU（1:350）的一抗混合液中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>将切片在含生物素化驴抗大鼠（1:500）和FITC标记的驴抗小鼠Fab片段（1:100）的二抗混合液中孵育。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。</li>
			<li>将切片在罗丹明红标记的链霉亲和素中孵育，室温2小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟，然后按上述方法封片并加盖盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>nestin-GFP小鼠中荧光信号的放大
		<ol>
			<li>在原始一抗混合液中加入山羊抗GFP抗体。</li>
			<li>在二抗混合液中加入一种光谱特性与GFP相似的荧光染料标记的二抗（如Alexa 488标记的驴抗山羊）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>在漂洗去除抗冻剂后进行抗原修复。将含0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）的6孔或12孔板置于蒸锅中预热至95–99 °C（约25分钟）。</li>
		<li>将切片转移至热柠檬酸缓冲液中，蒸汽加热30分钟（用铝箔覆盖孔板，因塑料盖不耐高温）。</li>
		<li>立即放入冰浴中冷却。此步骤有助于保护组织形态，尤其在处理出生后动物脑切片时尤为重要。</li>
		<li>用TBS漂洗3次，每次10分钟，以去除并中和柠檬酸，随后继续染色步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在小鼠组织上使用小鼠来源抗体
	<ol>
		<li>在第一次封闭步骤中（例如，步骤3.1.5或3.2.1.3）加入20 µg/ml单价Fab片段（抗小鼠IgG (H+L)，与二抗宿主相同）。</li>
		<li>用TBS漂洗4次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟，然后继续相应染色流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>焦油紫复染
	<ol>
		<li>将焦油紫溶液预热至60 °C（置于玻璃瓶中）。将载玻片在热溶液中孵育3分钟。</li>
		<li>在去离子水中漂洗，然后依次在70%、96%和100%异丙醇中各脱水2次，每次1分钟。</li>
		<li>在二甲苯或二甲苯替代剂中透明5–6分钟，并用相容的永久性封片剂加盖盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>计数每6个经过过氧化物酶染色的新生细胞th 沿齿状回全长进行矢状切片。在400倍显微镜下使用光学显微镜观察。</li>
	<li>将所得细胞数量乘以间隔区间，以估算新生细胞的总数。</li>
	<li>使用配备适当激光器和滤光系统的共聚焦激光显微镜对荧光标记的切片进行成像。在齿状回全长范围内随机选取位置，以400倍放大倍数采集图像序列，并对每侧半球至少50个随机选取的兴趣细胞进行分析，以检测与其他标记物的共标记情况。</li>
	<li>将共标记细胞的百分比（%/100）乘以新生细胞的总数，以计算特定新生细胞群体的绝对数量。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

新生细胞亚群的定量与鉴定是成体神经发生研究中的核心问题。通过结合增殖标记物和针对成体神经发生特定阶段表达蛋白的抗体，可对这些亚群进行免疫组织化学检测。某些抗体或抗体组合需要特定的染色条件。
使用合成胸腺嘧啶类似物标记分裂细胞仍是研究成年海马神经发生的金标准。在实验开始前，必须考虑合适的注射方案。我们通常以50 mg/kg（体重，腹腔注射）的剂量给予BrdU，但具体浓度可根据实验需求进行调整（单次注射剂量可高达300 mg/kg）8,16。若需依次注射IdU和CldU以实现细胞群体的时间分辨，则必须使用等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU）。需要注意的是，胸腺嘧啶类似物可能对分裂细胞具有毒性，还可能标记正在进行DNA合成的受损细胞16。另一个缺点是，胸腺嘧啶类似物的免疫组织化学检测需要进行DNA变性处理，这可能会干扰抗体的抗原性或其他DNA标记技术（例如，DAPI、Hoechst 33258）。检测内源性增殖标志物（如Ki67）的免疫组织化学方法可能是一种合适...

大脑中有两个区域在整个生命过程中持续产生新的神经元，分别是侧脑室的室下区和海马齿状回（DG）的颗粒下区（SGZ）。新生神经元起源于神经前体细胞，并经历多个形态学和生理学发育阶段后最终成熟1,2。从缓慢分裂的放射状胶质样干细胞（1型）开始，依次产生一系列过渡性扩增的中间前体细胞。其中更未分化的亚型（2a型和2b型）形态不规则，具有较短的切向突起。这些细胞进一步生成神经母细胞（3型），后者逐渐退出细胞周期，转变为未成熟神经元（树突伸向分子层），最终作为成熟的颗粒细胞整合入海马神经网络。由于这些细胞具有特殊的生理特性，可为神经回路提供更强的可塑性3，提示其在海马功能中具有独特作用。事实上，过去十年的研究已积累大量证据表明，成年期神经发生参与空间记忆、模式分离以及情绪行为的调控4,5。
成年神经发生可通过多种方法进行研究。胸苷类似物可在细胞周期S期掺入DNA，从而实现新生细胞的出生时间标记、定量分析及命运追踪6-8。依次使用不同的胸苷类似物（例如，CldU、EdU或IdU）可用于研究细胞更替或在实验过程中不同时间点出生的细胞群体9。另一种内源性细胞增殖标记物是Ki67，它在细胞周期的所有分裂阶段（G1、S、G2、M）均有表达，但在静止期（G0）及G1早期除外&#160;10,11。为了分析成年齿状回中新生细胞群体的表型，可使用多种阶段特异性分子标记物，如GFAP、nestin、DCX和NeuN1,6。GFAP是成熟星形胶质细胞的标记物，但在成年前脑中的放射状胶质样细胞中也有表达；nestin是一种特异性表达于放射状胶质样细胞和早期中间前体细胞的中间丝蛋白；DCX是一种微管相关蛋白，表达于中间前体细胞、成神经细胞及未成熟神经元中。根据上述三种标记物的共表达情况以及标记细胞的形态特征，可识别出四种不同的前体细胞亚型：1型（GFAP+、nestin+、DCX-）、2a型（GFAP-、nestin+、DCX-）、2b型（GFAP-、nestin+、DCX+）和3型（GFAP-、nestin-、DCX+）1。将DCX与表达于有丝分裂后神经元的NeuN进行共标记，可区分未成熟（DCX+、NeuN+）和成熟（DCX-、NeuN+）颗粒细胞神经元。
上述标记物常用于免疫荧光共标记，随后通过共聚焦显微镜分析新生细胞的数量和类型。该过程通常需要使用来自不同宿主物种的抗体，以避免抗体之间发生非特异性交叉反应。然而，大多数适用于神经发生研究的初级抗体均由兔或鼠制备例如， 小鼠 α-BrdU、小鼠 α-NeuN、兔 α-Ki67、兔 α-GFAP）。这严重限制了在单一切片中可检测的抗原数量及其组合方式。进而不仅因需进行多次染色而增加染色工作量，还可能影响结果的可靠性。此外，某些抗原易受甲醛固定引起的表位遮蔽影响例如， Ki67、nestin）。本文描述了对经典单重和多重免疫标记方案的改进方法（例如， 表位修复，多重连续免疫染色，使用巢蛋白-GFP转基因小鼠12) 可以克服上述诸多问题。特别是，多重免疫荧光染色的顺序标记方案允许对多达四种不同抗原进行染色，即使部分抗体来源于同一宿主。该方法能够在同一组织切片中同时检测 I 型、IIa 型、IIb 型和 III 型前体细胞及其增殖活性。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;胸苷类似物给药&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷，BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>有毒（致突变性，致畸性）</td></tr><tr><td>5-氯-2&amp;prime;-脱氧尿苷，CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>有毒（致突变性，致畸性）</td></tr><tr><td>5-氯-2&amp;prime;-脱氧尿苷，CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>有毒（致突变性，致畸性）</td></tr><tr><td>5-碘-2&amp;prime;-脱氧尿苷，IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>有毒（致突变性，致畸性）</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;组织制备&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>异氟烷-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛粉末（PFA）</td><td>Riedel-De H&amp;auml;en</td><td>16005</td><td>有毒，易燃</td></tr><tr><td>灌注泵 PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon 实验室管路，&amp;Oslash; 0.8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>饲喂针头，直型，21 G，1.75 mm 橄榄尖，40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;免疫组织化学&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine 蒸汽炉</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm 聚酯网膜插件</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>预装于6孔培养板中</td></tr><tr><td>Netwell 15 mm 聚酯网膜插件</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>预装于12孔培养板中</td></tr><tr><td>Netwell 塑料6孔支架套件</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>用于24 mm 聚酯网膜插件</td></tr><tr><td>Netwell 塑料12孔支架套件</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>用于15 mm 聚酯网膜插件</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB（3,3&amp;prime;-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>致癌性，光敏感</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;一抗&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>兔 IgG1 &amp;alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100；需抗原修复</td></tr><tr><td>兔 &amp;alpha;-GFAP，AS-3-GF</td><td>Synaptic Systems</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊 IgG (H+L) &amp;alpha;-GFP</td><td>Acris Antibodies</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 &amp;alpha;-巢蛋白（nestin）</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200；需抗原修复</td></tr><tr><td>豚鼠 IgG (H+L) &amp;alpha;-双皮质素（Doublecortin）</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a &amp;alpha;-BrdU（腹水）</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>用于BrdU检测；DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a &amp;alpha;-BrdU（纯化）</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于CldU检测；DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 &amp;alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1&amp;#954; &amp;#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>用于IdU检测；DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;二抗&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-豚鼠 IgG (H+L)-生物素</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-大鼠 IgG (H+L)-生物素</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-小鼠 IgG (H+L)-生物素</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;-大鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-山羊 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-小鼠 IgG (H+L)-FITC，Fab片段</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-小鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-豚鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-大鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-兔 IgG (H+L)-罗丹明红-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-豚鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>链霉亲和素-罗丹明红-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;-兔 IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250，仅适用于兔 &amp;alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;封闭&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Fab片段 驴 &amp;alpha;-小鼠 IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab片段 驴 &amp;alpha;-兔 IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>正常兔血清</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;组织学&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>焦油紫（Cresyl violet）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>无毒二甲苯替代品</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>永久封片剂</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;显微镜&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

成年神经发生是一个受到高度调控的多阶段过程，新的神经元由激活的神经干细胞通过一系列逐步定向分化的中间前体细胞亚型产生。这些前体细胞亚型各自表达一组特定的分子标记物，并结合特定的形态学标准，可用于其识别与鉴定。通常采用免疫荧光技术，结合亚型特异性抗体以及外源性或内源性增殖标记物进行检测。本文描述了用于检测和定量成年海马神经发生各阶段的免疫标记方法，包括胸腺嘧啶类似物的应用、经心脏灌注、组织处理、热诱导表位修复、ABC免疫组织化学、多重间接免疫荧光、共聚焦显微镜观察以及细胞定量分析。此外，我们还介绍了&#160;一种连续多重免疫荧光染色方案，可避免因使用同一宿主物种来源的一抗而通常引发的问题。该方法能够在单个切片中同时精确定位所有海马区前体细胞亚型及增殖标志物。这些技术为并行研究不同前体细胞亚型的调控机制、其在脑部病理过程中的参与以及其在特定脑功能中的作用提供了强有力的工具。

我们采用上述方法对出生后及成年海马体中的新生细胞进行定量与表征。因此，我们使用了野生型以及神经发生缺陷型的细胞周期蛋白D2基因敲除（Ccnd2KO) 小鼠，饲养条件已知会影响神经发生速率（即， 富集环境（enriched environment, EE）13,14. 针对Ki67、BrdU、CldU或IdU的免疫组织化学DAB染色 consistently 显示了野生型与突变型之间新生细胞数量的差异 Ccnd2KO小鼠（图3)15此外，通过连续等摩尔浓度的CldU和IdU注射，我们能够区分在特定环境富集（EE）时期内生成的细胞群体图3C,D）。采用3.2.4节的方法，我们能够成功检测到在同时给予CldU和IdU后，两者信号强度相等且具有优异的重叠性。图4）。通过同时使用 BrdU 和 NeuN，可采用标准免疫荧光方法对 BrdU 标记的新生细胞进行表型鉴定（图5）或 BrdU、GFAP、nestin-GFP...

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。

成年神经发生是一个高度调控的多阶段过程，该过程中新的神经元通过激活的神经干细胞经由逐步分化的中间阶段产生……

本实验的总体目标是克服间接免疫荧光技术在研究神经前体细胞时的局限性，尤其是在无法获得来自不同宿主物种的合适一抗的情况下。首先注射一种胸腺嘧啶类似物以标记正在分裂的细胞，随后采集组织并进行处理，将其切片为冷冻切片。然后开始进行连续多重免疫荧光染色。首先加入未标记的一抗，再由荧光标记的二抗与之结合。接着，使用一抗来源物种的血清封闭第一种二抗上未结合的抗原结合位点，同时用未标记的 Fab 片段封闭所有可能被第二种二抗识别的免疫球蛋白。这使得组织可以与第二种一抗进行孵育，该一抗可通过不同的二抗进行标记。最终，通过观察切片图像来研究神经前体细胞在特定刺激下的发育与调控过程，以及其在特定脑功能中的作用。该技术相较于现有的多重免疫荧光等方法的主要优势在于，避免了因使用同一宿主物种来源的一抗而通常产生的问题。该方法有助于回答成年神经发生领域的关键问题，例如海马区祖细胞亚群在生理或药理刺激、脑部病理状态或衰老过程中的增殖情况。通常，初次接触该方法的研究者可能会遇到困难，因为使用同一宿主物种来源的一抗进行多重标记时，若阻断不充分，可能导致非预期的一抗交叉反应。首先，称量待注射的动物，并配制新鲜的10毫克/毫升胸苷类似物储备液用于注射。当溶液准备好后，使用带有30号针头的精密注射器，根据体重调整剂量。然后抓住小鼠颈部皮肤固定，于预定时间点将胸苷类似物深部腹腔注射。随后将小鼠深度麻醉并进行心脏灌流，先用10毫升冰冻PBS灌注，再用40毫升新鲜的冰冻甲醛溶液灌注。然后解剖取出脑组织，并在固定后用相同的固定液进行后固定。将收集的脑组织在4°C条件下于10%蔗糖溶液中孵育24小时。次日，将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，继续孵育48小时。将大脑准备好进行冷冻保护后，置于零下25摄氏度的异戊烷中冷冻。随后，使用冷冻切片机切割40微米厚的冠状切片，用于长期保存。将切片转移至抗冻液中，并在零下20摄氏度下保存。使用细毛刷将切片从抗冻溶液转移至TBS中。彻底清洗切片，先在4°C下过夜洗涤，随后在室温下进行五次每次10分钟的洗涤。所有这些孵育步骤均需在持续轻柔振荡条件下进行。如果所关注的抗原之一是胸腺嘧啶类似物，则此时需进行盐酸变性步骤，随后在硼酸缓冲液中进行中和。接着在含钙镁离子的 TBS 缓冲液（TBS plus）中对非特异性抗体结合位点进行通透和封闭处理。室温下孵育一小时后，于次日加入用 TBS plus 稀释的第一抗体，4°C 过夜孵育。用 TBS 清洗切片三次，每次 10 分钟；再用 TBST 清洗一次，持续 10 分钟。然后在室温下与荧光素标记的二抗孵育 3 小时。从现在开始，避免切片暴露于光照下。经过另一轮洗涤后，将切片转移至含有10%制备两种一抗的宿主物种血清的溶液中。在该溶液中孵育切片3小时，以封闭第一种二抗上的非特异性结合位点。随后用 TBS 清洗三次，再用 TBST 清洗一次，以去除血清。然后配制含有针对一抗宿主物种的未偶联单价 Fab 片段的 TBS 溶液，浓度为每毫升 50 微克。这样可封闭可能被第二轮二抗识别的表位。将切片转移至该溶液中，在 4 摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用 TBS 至少清洗切片三次，再用 TBST 清洗一次。转移过程中，将含有切片的网状插入物在纸巾上轻轻蘸拭，以去除残留的抗体片段残留物。现在将切片在4°C下与第二种一抗孵育过夜。经过另一轮洗涤后，在室温下加入第二种二抗孵育3小时。最后用TBS洗涤切片3次，并进行明胶封片。将载玻片风干，并使用抗荧光淬灭封片剂（ANTIFA mounting medium）进行封片。使用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光标记的切片，在齿状回全长范围内随机选取位置，以400倍放大倍数采集图像序列。每半球至少分析 50 个随机选择的目标细胞，以检测不同标记物的共标记情况。为计算特定新生细胞群体的绝对数量，需将共标记细胞的百分比乘以通过 DAB 染色分析估算出的新生细胞总数。上述方法已用于量化和表征神经发生缺陷型循环小鼠出生后及成年海马中的新生细胞。在D敲除小鼠模型中，针对不同增殖标志物（如KI-67或BrdU）进行DAB染色， consistently 显示出野生型小鼠与敲除小鼠之间新生细胞数量的差异。通过常规的多重免疫荧光染色方法，同时使用针对BrdU、GFP、NeuN、GFA-P和双皮质素的初级抗体，可对BrdU标记的新生细胞进行表型鉴定。该方法使得在单个样本中成功鉴定出新生的I型、IIA型、IIB型和III型前体细胞。或者，通过延长BrdU注射与动物处死之间的时间间隔，可利用BrdU与新生神经元的免疫共染色来分析新生神经元的最终数量。若切片先与兔源抗KI-67抗体、山羊源抗GFP抗体和豚鼠源抗Doublecortin抗体同时孵育，再与兔源抗GFAP抗体孵育，则该连续免疫标记方案效果理想；但顺序颠倒则不可行。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单个组织切片中使用同一宿主产生的多种一抗来可视化多达四种不同抗原的技术。在进行该实验操作时，务必注意设置适当的对照，以排除抗体交叉反应或假阳性结果的可能性。需注意，一抗孵育的顺序可能会显著影响实验方案的结果。

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

科研

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Neuroscience

神经科学

免疫组化和多标签与同一宿主物种抗体研究成人神经发生

该视频展示了一种免疫荧光染色方法，用于检测成年海马体中的神经发生。首先，对小鼠脑切片进行处理，使用针对神经前体细胞中与神经发生相关的标志蛋白的一抗孵育。接着，用带有荧光染料标记的二抗进行标记。然后在共聚焦显微镜下观察脑切片，根据不同的标志蛋白组合表达模式，区分各种前体细胞亚型。...

一种用于检测成年海马神经发生的免疫荧光染色技术

本视频演示了利用EdU掺入法对脑组织切片中新生增殖的神经干细胞进行染色，随后通过免疫荧光技术可视化特定蛋白，以增强对细胞动态及增殖过程的理解。...

小鼠脑切片中增殖神经干细胞的免疫荧光染色可视化

蛋白质的定位与分布为其细胞功能的研究提供了重要信息。电子显微镜（EM）具有较高的空间分辨率，可用于免疫组织化学后特定抗原亚细胞定位的确定。对于中枢神经系统（CNS）组织而言，在电子显微镜研究中同时保持结构完整性和抗原性尤为困难。本文采用一种已用于保存CNS中结构与抗原的方法，以研究和表征大鼠海马CA1区锥体神经元中的突触蛋白。...

海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

在成年海马神经发生过程中，当静息态神经干细胞依次进展并发育为在神经环路中功能整合的神经元时，会表达一组独特的遗传标记。通过热诱导抗原修复技术，可更有效地识别那些原本难以检测的前体细胞类型。...

热诱导抗原修复：一种在成年海马神经发生过程中检测与鉴定前体细胞类型的高效方法

本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。...

冷冻切片大鼠脑组织免疫组织化学染色初学者指南：小胶质细胞与神经元染色示例

我们描述了一种免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。...

神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

由于缺乏特异性抗体，将基因表达定位到特定细胞类型可能具有挑战性。本文中，我们描述了一种通过结合双重荧光RNA原位杂交与免疫染色技术，实现基因表达同时三重检测的实验方案。...

双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。...

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

本文介绍了四种最常用的可视化BrdU阳性细胞的技术，用于检测大鼠中的成年神经发生。本研究包括试剂制备、胸苷类似物给药、经心脏灌注、组织制备、过氧化物酶免疫组织化学反应、免疫荧光、信号放大、复染、显微镜成像以及细胞分析的操作说明。...

利用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖与神经发生的免疫组织化学技术

本方案描述了如何使用同一物种来源的初级抗体进行双重标记免疫荧光，以研究宿主-病原体相互作用。此外，该方案还可包含来自不同宿主的第三种抗体。此方法适用于任何类型的细胞和病原体。...

使用同种来源抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

学习多重免疫荧光标记技术，用于定量分析成年海马神经发生各阶段。该方法通过血清和Fab片段阻断，解决同种宿主抗体交叉反应问题，提高神经前体细胞检测的特异性。

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

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