使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

本实验的总体目标是克服因缺乏来自不同宿主物种的合适一抗而无法进行间接免疫荧光染色的局限性，从而研究神经前体细胞。首先注射一种胸腺嘧啶类似物以标记正在分裂的细胞，随后采集组织，进行处理，并将其切成冷冻切片。

然后开始进行连续多重免疫荧光染色。首先加入未标记的一抗，再用荧光标记的二抗与一抗结合。接着，使用一抗来源物种的血清封闭第一种二抗上未结合的位点，同时用未偶联的 Fab 片段封闭所有可能被第二种二抗识别的免疫球蛋白。

这使得组织可以与第二种一抗孵育，该一抗可通过不同的二抗进行标记。最终，通过观察切片图像来研究神经前体细胞在特定刺激下的发育与调控过程，以及其在特定脑功能中的作用。该技术相较于现有的多重免疫荧光等方法的主要优势在于，它避免了因使用同一宿主物种来源的一抗而通常引发的问题。

该方法有助于回答成年神经发生领域的关键问题，例如海马区前体细胞亚群在生理或药理刺激、脑部病理状态或衰老过程中的增殖情况。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为使用来自同一宿主物种的一抗进行多重标记时，若阻断不充分，可能导致非预期的一抗交叉反应。首先，称量待注射的动物，并配制新鲜的胸苷类似物储备液，浓度为10毫克/毫升，用于后续注射。

当溶液准备好后，使用带有30号针头的精密注射器，根据体重调整剂量。然后抓住小鼠颈背部皮肤固定，于预定时间点将胸腺嘧啶类似物进行深部腹腔注射，随后对小鼠实施深度麻醉并进行心脏穿刺。先用10毫升冰冻的磷酸盐缓冲液灌注，接着用40毫升新鲜的冰冻甲醛溶液灌注。

然后取出脑组织并固定，使用相同的固定液进行后固定。将收集的脑组织在4°C条件下于10%蔗糖溶液中孵育24小时。次日，将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，继续孵育48小时。

将大脑准备好进行冷冻保护后，置于零下25摄氏度的异戊烷中冷冻。随后，使用冷冻切片机切割40微米厚的冠状切片，用于长期保存。将切片转移至抗冻液中，并在零下20摄氏度下保存。

使用细毛刷将切片从防冻液转移至TBS中。彻底清洗切片，先在4°C下过夜洗涤，随后在室温下进行五次、每次10分钟的洗涤。所有这些孵育步骤均应在持续轻柔振荡条件下进行。

如果感兴趣的一种抗原为胸腺嘧啶类似物，则此时需进行盐酸变性步骤，随后在硼酸缓冲液中进行中和。接着在含TBS plus的溶液中对非特异性抗体结合位点进行通透和封闭处理。室温下孵育一小时后，于次日在4°C条件下用TBS plus稀释的第一抗体进行过夜孵育。

用TBS清洗切片三次，每次10分钟，再用TBST清洗一次，每次10分钟。然后在室温下与荧光素标记的二抗孵育三小时。

从现在开始，避免切片暴露于光线下。经过另一轮洗涤后，将切片转移至含有10%宿主物种血清的溶液中，该血清来源于制备两种一抗的同一物种。将切片在此溶液中孵育三小时，以饱和第一种二抗上的非特异性结合位点。

随后用 TBS 洗涤三次，再用 TBST 洗涤一次，以去除血清。然后配制含有针对一抗宿主物种的未标记单价 Fab 片段的 TBS 溶液，浓度为每毫升 50 微克。这样可封闭可能被第二轮二抗识别的表位。

将切片转移至该溶液中，在4°C下孵育过夜。孵育结束后，用TBS至少清洗切片三次，再用TBST清洗一次。在转移过程中，将含有切片的网状插入物在纸巾上轻轻蘸拭，以去除残留的组织碎片。

现在将切片在4°C条件下与第二种一抗孵育过夜。经过另一轮洗涤后，在室温下加入第二种二抗孵育3小时。最后用TBS洗涤切片3次，并进行明胶封片。

将载玻片空气干燥，并使用抗荧光淬灭封片剂（ANTIFA mounting medium）进行封片。使用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光标记的切片，在齿状回全长范围内随机选取位置，以400倍放大倍数采集图像序列。

每侧半球至少随机选取 50 个目标细胞，分析不同标记物的共标记情况。为计算特定新生细胞群体的绝对数量，可将共标记细胞的百分比乘以通过 DAB 染色分析估算出的新生细胞总数。上述方法可用于定量和表征神经发生缺陷型小鼠出生后及成年海马中的新生细胞。

在D基因敲除小鼠模型中，针对不同增殖标志物（如KI 67或BRDU）进行DAB染色， consistently 显示出野生型小鼠与敲除小鼠之间新生细胞数量的差异。通过常规的多重免疫荧光染色方法，同时使用针对B-R-D-U、G-F-A-P、nestin、GFP以及doublecortin的初级抗体，可对BRDU标记的新生细胞进行表型鉴定。该方法使得在单个样本中成功鉴定出新生的I型、IIA型、IIB型以及III型前体细胞成为可能。

或者，在BrdU注射与动物处死之间采用较长的时间间隔后，可通过BrdU与新生神经元的免疫染色同时分析新生神经元的最终数量。若切片先与兔源抗KI-67抗体、山羊源抗GFP抗体和豚鼠源抗doublecortin抗体共同孵育，再与兔源抗GFAP抗体孵育，则该顺序免疫标记方案效果理想；但顺序颠倒则不行。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单个组织切片中使用来自同一宿主动物的多种一抗，实现最多四种不同抗原的可视化。

进行该实验操作时，务必注意设置适当的对照，以排除抗体交叉反应或假阳性结果的可能性。需注意，一抗孵育的顺序可能会显著影响实验方案的结果。