环介导等温扩增（LAMP）检测法用于特异性检测感染鸡的Eimeria物种

本实验的总体目标是诊断鸡或鸡群中是否存在伊氏疟原虫（I myea）物种寄生虫。首先配制环介导等温扩增（LAMP）反应所需的试剂，随后在死后从一个或多个肠道部位提取总基因组DNA，以完成检测。

然后将基因组DNA加入LAMP主混合液中并进行孵育。最后，评估LAMP检测的结果。最终，利用LAMP检测来确定特定I. miria物种的存在，以改进种群管理，并作为疾病诊断的工具。

因此，与传统的形态学显微镜检查或PCR等方法相比，该技术的主要优势在于主观性更低，且无需昂贵的实验室设备。采用该方法可通过改进对禽类感染的诊断，从而提升鸡的健康与福利。为准备Erea lamp ase的模板，需选择待检测的肠段。

使用本表格作为采样位点选择以及最可能存在的艾美耳球虫（Eimeria）物种的参考指南。这一点至关重要，因为每种感染鸡的艾美耳球虫均以其靶向的肠道区域为特征，可使用无菌剪刀或解剖刀进行区分。切取选定用于检测艾美耳球虫的肠段，长度应为五厘米或更长。

沿纵向切开样本，去除大部分肠道内容物，使用无菌玻璃显微镜载玻片的边缘或已灭菌的剪刀刀片刮取黏膜层细胞。

将刮取的材料放入含有100微升无菌TE缓冲液（含10% w/v Cell X 100树脂）的无菌1.5毫升螺旋盖微量离心管中，拧紧管盖。剧烈振荡样品1分钟，然后在沸水浴中孵育10分钟。煮沸后，让每个样品在室温下冷却1至2分钟。

在每个LAMP检测中，取两微升上清液作为模板，用于制备足够进行100次检测的I miria LAMP引物储备液。将样品在10,000 × g条件下离心一分钟。通过加入分子生物学级水，使每种冻干的I miria LAMP引物重悬至100微摩尔的浓度。根据本表所示体积，分别为每种待检测的iria物种，在单独的0.5毫升翻盖微量离心管中加入60微升分子生物学级水。

将引物 F-I-P-B-I-P-F three B three LF 和 LB（针对目标 eria 物种的特异性引物）加入水中，配制一系列七种物种特异性的引物混合液。轻轻颠倒混匀引物溶液，短暂离心，然后冻存备用。

根据本表所列体积及文本方案中的指南，为每种待检测的鸢尾属物种配制LAMP反应预混液。将23微升针对特定鸢尾属物种的Bst DNA聚合酶LAMP预混液移入0.5毫升微量离心管中。加入2微升先前制备的DNA模板，使最终反应体积达到25微升，作为阳性对照。向其中一个反应中加入2微升特定鸢尾属物种的基因组DNA。

向反应体系中加入 2 µL 分子生物学级别的水作为阴性对照，在 62 °C 的水浴或加热块中孵育 30 分钟。可选步骤：在 80 °C 加热 10 分钟以灭活 B-S-T-D-N-A 聚合酶。如果孵育结束后不能在室内光线下立即读取结果，则通过肉眼评估每个反应的颜色变化。

阴性结果呈现粉红色至紫色，阳性结果则呈现天蓝色（可选）。为确认LAMP检测结果，取5 µL LAMP反应产物与1 µL DNA凝胶上样缓冲液混合，在预染的2% ARO凝胶上电泳运行。

使用一种分子大小的DNA标记物来确定片段大小，测试三组。作为监测项目的一部分，从美国肉鸡养殖场采集的鸟类样本获得了三组肠道样本，如图所示。针对每种伊氏菌（I miria）优先选择的肠道部位，应用特异性环介导等温扩增（LAMP）检测方法。

使用羟基萘蓝作为指示剂时，可通过肉眼观察鉴别所有受试鸟类体内是否存在伊里安感染。使用羟基萘蓝时，阴性LAMP反应呈现的颜色可能从紫色到粉红色不等，但始终与阳性结果产生的蓝色明显不同。通过琼脂糖凝胶电泳进行确认，结果与此处所示相当。

每只鸡从特定肠道部位采集的样本中各取一份进行DNA提取，并使用全部七种LAMP检测方法进行测试，所得结果与对每个肠道部位分别处理时的结果一致。一旦掌握，若严格按照本方案操作，该技术可在45分钟内完成。此外，还可开展其他技术（如病变评分）以评估肠道整体健康状况。