Name: 使用摇蚊科（双翅目）的表面浮蛹蜕为快速生物议定书水体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解摇蚊科表面浮蛹蜕的采集与处理技术，用于水质快速生物评估。该方法通过野外采样、形态分组和玻片装片，实现高效、经济的水环境监测。

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本文的撰写与发表得到了明尼苏达大学昆虫学系摇蚊科研究组（L. C. Ferrington, Jr. 为项目负责人）获得的多项资助和合同的支持。&#160;感谢 Nathan Roberts 分享用于本论文相关视频中作为图示的野外工作照片。

1. 野外采集用品的准备
<ol>
	<li>根据研究设计确定应采集的SFPE样本数量，并获取一个样本瓶（例如， 每个样品 60 ml。</li>
	<li>为每个样本瓶准备两张日期和地点标签，一张放在瓶内，另一张贴在瓶外。确保每张日期和地点标签均包含以下信息：&#160;&#160;国家、州、县、城市、水体、GPS坐标、采样日期及采样人员姓名。</li>
	<li>收集其他特定材料和设备（见特定材料/设备列表）。</li>
</ol>
2. 野外采集
<ol>
	<li>一手持幼虫托盘，另一手持筛网。将幼虫托盘浸入 SFPE 聚集的水中例如， 泡沫堆积物、障碍物、挺水植物、碎屑、回流涡流以及河岸边缘图2A），让水、蜕皮和碎屑进入幼虫托盘，并将这些物质倒入筛子中过滤。若在流水生态系统中采样，应从采样河段的下游端开始，向上游方向进行（图2B）。若在静水系统中采样，应从下风向的岸边开始。&#160;
	<ol>
		<li>重复步骤2.1，持续10分钟（或根据特定采样方案的其他规定时间）&#160;在每个预设的样本次数范围内（通常对于从溪流中采集的样本为100–200米，但取决于水生监测站点的整体面积）；根据实际情况在SFPE聚集区域之间移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用装有采样点水样的洗瓶将筛网上的碎屑集中到一个区域，借助镊子和洗瓶中的乙醇流，小心地将SFPE样品转移至预先标记的样品瓶中。用乙醇充满样品瓶。</li>
	<li>对所有样品重复步骤 2.1 至 2.2。</li>
</ol>
3. 样品挑选
注意：本方案其余部分适用于300个SFPE的子样本，若用于其他子样本量可能需要进行调整。有关根据具体研究目标和资源定制SFPE方法的子采样和采样频率指南，请参见Bouchard和Ferrington的9。
<ol>
	<li>为每个SFPE样品分配一个1 dram的小瓶；准备日期和 &#160;将产地标签放入每个小瓶内，并填充小瓶 &#190; 用乙醇充满。</li>
	<li>打开相应的样本罐盖子，检查是否有附着的蛹壳。使用装有乙醇的洗瓶，轻轻将盖子上的内容物冲洗至培养皿中。用镊子从样本罐内取出标签，并轻轻将标签上的内容物冲洗到培养皿中，随后将标签放置一旁。</li>
	<li>将样品罐中的内容物转移至&#160;幼虫托盘，用乙醇冲洗以确保样本瓶中无SFPE残留。将托盘中的部分蛹壳、残渣及乙醇转移至培养皿中，确保样本完全浸没在乙醇中。&#160;</li>
	<li>将培养皿置于体视显微镜下，系统性地检查培养皿内是否存在蛹壳。使用镊子将所有蛹壳从培养皿中拾取并放入小瓶中。不要拾取破损的标本即， 不要采集头胸部和腹部不足一半、已干燥或被压扁的标本，以免后续难以鉴定。 
	注意：鉴定到物种通常需要&#160;整个标本完整存在，尽管&#160;在某些情况下，&#160;对于不完整的标本，可能仍可进行属级鉴定。
	<ol>
		<li>轻轻搅动培养皿，仔细检查是否有额外的蛹壳，包括可能附着在皿壁上的蛹壳，以及最初可能未被发现的微小且透明的标本。重复检查过程，直至连续两次扫描均未发现新的蛹壳为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 3.3 和 3.4，直至挑取完全部或共计 300 个蛹壳。&#160;当挑选出300个蛹壳后，将培养皿中的残留物倒回幼虫托盘，并用乙醇冲洗培养皿。然后，将幼虫托盘中的残留物转移至空的样品瓶中，贴上日期和采集地点标签，并盖上瓶盖。&#160; 保留或根据项目特定方案处理残留物。</li>
</ol>
4. 样品分选
<ol>
	<li>将标记好的小瓶中所有采集到的蛹壳倒入培养皿中，加入足量乙醇，以刚好浸没样本为宜。</li>
	<li>在体视显微镜下，将样本按不同形态特征分为若干组即， 形态分类单元）并将每个形态分类单元分别放入&#160;装有3/4液体的带标签小瓶th 用乙醇充满。
	<ol>
		<li>利用外部形态特征区分摇蚊科形态分类单元。例如，根据头胸部的头结节、额瘤、额刚毛以及胸角在有无、大小、形状和颜色上的差异进行区分；根据腹部各体节的刺、钩列、砂纸状结构、刚毛和距，以及肛叶的特征进行区分&#160;用于形态分类群的分离（图 4A）。参见 Ferrington， 等 5,Sæther 26,Pinder 和 Reiss 27 有关形态特征的更多描述和图示。</li>
		<li>如果标本开始变干，可使用额外的乙醇。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 载玻片封片
<ol>
	<li>为每个形态分类单元在多孔板中填充一孔95%乙醇。
	<ol>
		<li>放置多个表示（例如， 将每个形态分类单元（占总数的25%）分别放入载玻片制片用板的各个孔中。让标本在孔中静置至少10分钟。&#160;脱水&#160;充分地。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用适当的部位、采集和识别信息标记载玻片（图3).</li>
	<li>将载玻片置于体视显微镜下。 
	注意：将载玻片模板粘贴到载物台上有助于实现一致的定位。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴 Euparal；将 Euparal 液滴铺展至与盖玻片大小相近。使用 Euparal 时应确保通风良好。 
	注意：使用Euparal时应确保适当通风。</li>
	<li>使用镊子将第一个形态分类单元的代表性样本嵌入Euparal中。 
	注意：使用镊子轻轻将样本在实验室擦拭纸上轻敲，以去除多余的乙醇 &#160;在将其包埋于Euparal之前。</li>
	<li>使用精细尖头镊子和/或解剖探针将头胸部与腹部分离（图4A).
	<ol>
		<li>沿蜕皮缝切开头胸部图4B）并打开头胸部，使缝合边缘位于相对的两侧（图4C).</li>
		<li>将头胸部摆放至腹面朝上图4C).</li>
		<li>将腹部背侧朝上，置于头胸部正下方图4C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片置于样本上。手持盖玻片呈一定角度，使其一边缘接触载玻片，然后缓慢放下盖玻片，以减少气泡产生。轻轻按压盖玻片，使样本展平。</li>
	<li>重复步骤 5.3 至 5.7，处理所有脱水样本&#160;样本。</li>
</ol>
6. 属的鉴定
<ol>
	<li>使用复式显微镜观察载玻片上的标本，确定其属级分类。参照 Wiederholm 28 和 Ferrington 提供的检索表与诊断特征，将标本鉴定至属。 等5如有需要，可使用Ferrington的方法确认科级分类鉴定。 等5. &#160;&#160;注意：自Wiederholm以来，已有大量通用描述和修订版本28 和 Ferrington， 等5因此，这些检索表和鉴定方法尚不完整，需结合原始文献进行补充。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

成功进行SFPE样本采集、挑选、分拣、制片及鉴定的最关键步骤是：（1）在野外采集过程中，确定研究区域内SFPE大量聚集的区域图2A）；（2）缓慢扫描培养皿中的内容以检测所有&#160;样品挑选过程中的SFPE；（3）在载片过程中培养出必要的手工灵巧性，以分离头胸部与腹部图 4A）；以及（4）识别摇蚊蛹壳的关键形态特征&#160;准确鉴定到属。
检测SFPE高积累区域（图2A） 成功采集SFPE样本的最重要步骤。蛹壳可被截留在水生植被或船坡道等人工结构中，而波浪可将漂浮物聚集到近海的“风成条带”中30对于较大的水体，需确定自然聚集区域&#160;可能需要根据风向确定研究地点，或使用船只进入蛹壳聚集的区域。必须采集到足够数量的SFPE样本，以准确检测新出现物种的存在，并高精度估计各物种的相对丰度。在样本分拣过程中，需多次缓慢扫描培养皿，以发现体型较小（体长3-6 mm）、色素较浅的标本。SFPE常附着于藻类、树叶、枝条、种子和花朵上，因此可能在初次扫描时被遗漏。此...

生物监测项目通过使用生物体来评估环境健康状况，常被用于评价水质或监测生态系统恢复项目的成效。自1989年以来，利用底栖大型无脊椎动物群落进行的快速生物评估方案（RBP）在各州水资源管理机构中广受欢迎1。传统采集底栖大型无脊椎动物以用于RBP的方法，如网捞法、苏伯采样器（Surber sampler）和赫斯采样器（Hess sampler）2，可能耗时较长、成本较高，且仅能反映特定微生境中的群落特征3。一种高效且可替代的RBP方法是收集摇蚊科（Chironomidae）的水面漂浮蛹壳（SFPE），以获取特定水体的生物学信息3。
摇蚊科（Chironomidae）（昆虫纲：双翅目），通常被称为非吸血性摇蚊，是一类完全变态的昆虫，通常在水生环境中发育，随后在水面羽化为成虫&#160;。摇蚊科物种丰富，全球已描述约5,000种，但估计实际存在的物种可能多达20,000种4。由于其高度的多样性以及对污染耐受性的差异，摇蚊常被用于记录多种水生生态系统的水质与生境状况5。此外，在水生系统中，摇蚊通常是数量最多、分布最广的底栖大型无脊椎动物，通常占群落中物种数的50%或以上5,6。陆生成虫羽化后，其蛹壳（蜕下的蛹皮）会残留在水面上（图1）。由于风力或水流的作用，蛹壳会聚集在岸边或障碍物后方，可被快速、便捷地采集，从而获得过去24–48小时内羽化的摇蚊物种的全面样本7。
所采集的摇蚊蛹皮（SFPE）的相对丰度和分类组成反映了水质状况，因为某些物种对污染具有很强的耐受性，而另一些则非常敏感5。与传统的摇蚊幼虫采样技术相比，SFPE 方法具有多项优势，包括：（1）采样区域的生境干扰极小，甚至没有干扰；（2）样本采集不针对活体生物，而是非生命的蜕皮，因此不会影响群落动态的变化轨迹；（3）在具备适当检索表和描述的情况下，鉴定到属级甚至种级相对容易3；（4）与传统采样方法相比，样本的采集、处理和鉴定更为高效且经济3,8,9；（5）积累的蜕皮代表了来自多种微生境的分类单元10；（6）该方法几乎适用于所有水生环境，包括溪流和河流、河口、湖泊、池塘、岩池以及湿地；（7）SFPE 可能是生态系统健康状况更敏感的指示指标，因为它们代表了已完成所有未成熟阶段并成功羽化为&#160;成虫的个体11。
SFPE 方法并非收集摇蚊群落信息的新方法，Thienemann 最早提出了使用 SFPE 的建议。12 20世纪初。已有多种研究采用SFPE进行分类学调查（例如，&#160;13-15），生物多样性与生态学研究（例如 7,16-19）以及生物学评估（例如，20-22）。此外，一些研究探讨了样本设计、样本量以及为达到不同物种或属的检测水平所需的样本事件数量等方面的问题。例如，8,9,23）。这些研究表明，通过中等程度的努力或样品处理成本，即可检测到较高比例的物种或属。例如，Anderson 和 Ferrington8 根据100个计数的子样本确定， &#160;1/3rd 所需时间更短&#160;与网捞样本相比，选择SFPE样本更具优势。另一项研究确定，每采集一个网捞样本，可筛选和鉴定出3-4个SFPE样本，且随着物种丰富度的增加，SFPE样本在物种检测效率上高于网捞样本。3例如，在物种丰富度为15-16种的样地，平均拖网采集效率为45.7%，而SFPE样品的采集效率为97.8%3.
重要的是，SFPE 方法已在欧盟实现标准化24 （称为摇蚊蛹皮技术（CPET））和北美25 用于生态评估，但该方法尚未被详细描述。Ferrington 曾描述过 SFPE 方法的一个应用实例。 等3；然而，该研究的主要重点是评估SFPE方法的效率、功效和经济性。本工作的目的是详细描述SFPE方法的全部步骤，包括样品采集、实验室处理、玻片制备和属水平鉴定。目标读者包括研究生、研究人员以及有意将传统的水质监测工作拓展到其研究中的专业人员。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>菲舍尔科技</td><td>S25309B&amp;nbsp;</td><td>70-95%</td></tr><tr><td>塑料洗瓶</td><td>菲舍尔科技</td><td>0340923B</td><td></td></tr><tr><td>样品瓶</td><td>菲舍尔科技</td><td>0333510B</td><td>建议使用玻璃或塑料材质，60 mL 容量</td></tr><tr><td>试验筛</td><td>Advantech</td><td>120SS12F</td><td>125 微米筛孔尺寸</td></tr><tr><td>幼虫培养盘</td><td>BioQuip</td><td>5524</td><td>白色</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>菲舍尔科技</td><td>0333926B</td><td>1 dram 规格</td></tr><tr><td>塑料滴管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1371110</td><td>每毫升 30 至 35 滴</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>BioQuip</td><td>4524</td><td>#5</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Carolina</td><td>741158</td><td>玻璃或塑料材质</td></tr><tr><td>多孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>144530</td><td>玻璃或塑料材质</td></tr><tr><td>玻璃载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3010002</td><td>3 × 1 英寸</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-519-21G</td><td>圆形或方形</td></tr><tr><td>Euparal 封片介质&amp;nbsp;</td><td>BioQuip</td><td>6372B</td><td></td></tr><tr><td>绘图笔</td><td>BioQuip</td><td>1154F</td><td>黑色</td></tr><tr><td>探针</td><td>BioQuip</td><td>4751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>金佰利专业品牌&amp;trade;</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

利用摇蚊科（双翅目）水面漂浮的蛹壳作为水体快速生物评价的方案

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

利用底栖大型无脊椎动物群落进行快速生物评价的方案已成功用于评估人类活动对水质的影响。然而，传统的底栖幼虫采样方法（如舀网法）可能耗时且成本较高。一种替代方案是收集摇蚊科水面漂浮的蛹壳（SFPE）。摇蚊科是双翅目中一个物种丰富的科，其幼虫阶段通常生活在水生环境中。成虫摇蚊从水中羽化后，会将蛹壳留在水面漂浮。由于风力或水流的作用，这些蛹壳常沿河岸或障碍物后方聚集，便于采集以评估摇蚊类的多样性和丰富度。摇蚊可作为重要的生物指示物种，因为不同物种对污染的耐受性存在差异。因此，所采集SFPE中各类群的相对丰度和物种组成能够反映水质的变化。本文详细描述了摇蚊科SFPE在野外采集、实验室处理、玻片制备及鉴定方面的相关方法。SFPE方法的优点包括对采样区域干扰极小、样品采集和实验室处理高效经济、易于鉴定、几乎适用于所有水生环境，并可能更灵敏地反映生态系统所受的胁迫。其局限性在于无法确定幼虫的微生境利用情况，且若蛹壳未与成年雄虫建立关联，则难以鉴定到物种水平。

图1展示了摇蚊的生命周期；其幼体阶段（卵、幼虫、蛹）通常在水生环境中发生，或与水生环境密切相关。幼虫完成发育后，会构建一个管状庇护所，并通过丝状分泌物将自身附着于周围基质上，随后进行化蛹。当发育中的成虫成熟后，蛹体脱离附着物并游至水面，成虫由此从蛹壳中羽化而出。蛹壳充满空气，且由于体壁外层具有一层蜡质，可使其漂浮于水面，直至细菌开始分解蜡质层。
水流或风会将漂浮的蛹壳聚集到某些堆积区域，例如河岸植被或倒下的树木与水面接触的地方，如图2A所示。可使用幼虫托盘和筛网从这些自然堆积区域收集蛹壳，以评估摇蚊科昆虫在多种微生境中的羽化情况，如图2B所示。对于某些应用而言，以一致且标准化的方式进行采样非常重要，以便在不同采样点之间或同一采样点不同时段之间进行比较。已有研究表明，10分钟的采集时间足以对摇蚊的相对多度进行有效评估3,25。例如，Ferrington 等3研究了Chironomus riparius物种...

利用底栖大型无脊椎动物进行快速生物评价的方案常用于监测和评估水质。一种高效的方案涉及摇蚊科水面漂浮蛹壳（SFPE）的采集。本文描述了摇蚊科SFPE的野外采集、实验室处理、玻片制备及鉴定技术。

利用底栖大型无脊椎动物群落进行快速生物评价的方案已成功用于评估人类活动对水质的影响。

本实验的总体目标是描述用于采集和处理摇蚊科幼虫（chironomid）水面漂浮样本以进行水质评估的技术。该过程首先从水生环境中采集摇蚊科幼虫的野外样本；第二步，从每个野外样本中挑取300个个体作为子样本，并将这些样本按不同的形态类群进行分类。最后一步是将每组的多个代表性个体固定在玻璃载玻片上。最终，通过鉴定到属或种来评估水质状况。与传统的底栖大型无脊椎动物采样等现有方法相比，该技术的主要优势在于样品的采集和处理高效、经济，并且几乎适用于所有水生环境。使用该技术可为生物监测研究提供有价值的信息，并有助于深入了解因干扰、污染事件或气候变化导致的样地随时间发生的变化。尽管我们重点介绍该技术在溪流生境中的应用，但它也可轻松应用于其他水生系统，如河流、湖泊、池塘、沼泽、潮池或岩池。在进入野外之前，为每个待采集的样品准备一个样本瓶，并在瓶内和瓶外各放置一张日期和地点标签。然后，用一只手持幼虫托盘，另一只手持筛网，将每个样品的幼虫托盘浸入水中，使瞳孔排出物随水流进入幼虫托盘或通过筛网进入样品中，此时水中的瞳孔排出物及碎屑即进入托盘或样品。收集10分钟后，使用一个装有从该采样区采集的水的瓶子，将筛网上所有碎屑冲洗并集中至筛网的某一区域。随后，用镊子配合一股乙醇流，小心地将瞳孔排出物转移至相应已预先标记的样品瓶中，并用乙醇充满样品瓶。开始取样时，为每位学生的化脓样本在对应的Dr Vial中放置相应日期和采集地点标签，并加入乙醇至瓶身四分之三满。接着，取下相应样本罐的瓶盖，检查瓶盖内是否有附着的化脓物。使用装有乙醇的冲洗瓶，轻轻将瓶盖上的内容物冲洗至培养皿中。然后从样品罐内侧取下标签，轻轻将标签上的内容物冲洗到培养皿中，并将标签放置一旁。接着将样品罐中的内容物转移至白色幼虫托盘中，并用乙醇冲洗样品罐，以确保罐内无残留的蝇蛆渗出物。将幼虫培养皿中的瞳孔渗出物残渣和乙醇转移至培养皿中。确保样本完全浸没在乙醇中。然后将培养皿置于体视显微镜下，系统性地扫描培养皿以寻找生物体。接下来，使用镊子将培养皿中的瞳孔渗出物转移至相应编号的样品管中。应尽量避免夹取已破裂或干燥的瞳孔渗出物，以防止后续鉴定困难。当所有可见的瞳孔渗出物均转移完毕后，需再轻轻旋转并检查培养皿三次，以确认是否有遗漏的样本，包括可能粘附在培养皿侧壁的样本。当挑选出300只蛹壳后，将培养皿中的残留物倒回幼虫托盘，并用乙醇冲洗培养皿。然后将幼虫托盘中的残留物转移至空的样品瓶中。在瓶上贴上日期和采集地点标签，并将瓶盖放在瓶口上方，以便分类样品。将标记好的小瓶中的蛹外泌物倒入装有足量乙醇的培养皿中，乙醇的量以刚好浸没样本为宜。接着，在体视显微镜下，利用摇蚊蛹期样本的外部形态特征将其归类到不同的形态分类单元，并将不同的形态分类单元分别转移至已标记的小瓶中，小瓶中预先装入四分之三满的乙醇。例如，在依据胸部角进行分类时，可通过胸角的有无、大小、形状及颜色差异来区分样本。若按腹部进行分类，应利用腹节及肛叶的刺、毛和距等特征进行形态区分。分选后，将每种形态型的样本分别放入多孔板的各个孔中，每孔加入95%乙醇，每个形态型需放入多个个体，置于孔中至少10分钟，以确保充分脱水。在样本干燥过程中，可同时在载玻片上标注相应的采集地点和鉴定信息，用于后续固定拟人蜉（people exus）标本。将载玻片的模板用胶带固定在显微镜载物台上，然后将一张载玻片放在该模板上。接着，在载玻片上滴加一滴URL，使其扩散后的面积接近盖玻片大小。用镊子轻轻将第一种形态轴突的代表性样本在实验室擦拭纸上轻触，以去除多余的乙醇。随后将样本封埋于URL中，并使用尖头镊子和解剖探针将头胸部与腹部分离。该操作中最困难的环节是在载玻片封片过程中，需要具备足够的手动灵巧性，以将头胸部从腹部完整分离。为确保解剖成功，应使用尖头镊子或解剖探针，将头胸部与第一腹节之间的外骨骼分开。如图所示，沿头胸部的外侧缝将头胸部切开。然后打开头胸部，使缝合边缘位于相对的两侧，并将其摆放为腹面朝上。将腹部背面向上放置，并立即置于头胸部下方。接着用镊子夹住盖玻片，使其呈一定角度，一端接触载玻片，缓慢降低并放下盖玻片，以减少气泡的形成。最后，轻轻按压盖玻片以展平样本，并使用复式显微镜确定载玻片上样本的属。在这些图表中，展示了从明尼苏达州16个城市湖泊采集的摇蚊幼虫样本的分类累积曲线，用以确定每个湖泊内总体的物种数量。每条数据线代表一个湖泊，每个数据点代表2005年4月至10月期间采集的一个月度样本，结果表明每个湖泊采集四个样本即可获得摇蚊群落的大部分物种，并能检测到湖泊内重要的季节性变化。对摇蚊的长期监测研究可用于评估明尼苏达州各湖泊的气候变化，因为湖泊深度和磷浓度等环境变量的变化会影响在不同湖泊化学梯度下累计检测到的物种数量。事实上，正如该图所示，随着平均磷浓度与平均水深比值的增加，所遇到的物种累积数量也随之增加。成功采集根际分泌物最关键的步骤是在研究区域内找到分泌物高度富集的区域。在实验室开始取样时，重要的是要缓慢扫描培养皿中的内容物，因为某些样本色素较浅，且可能附着在培养皿壁上不易察觉。观看本视频后，您应能够充分了解如何采集和处理用于水质监测与评估项目的水面漂浮微塑料样品。

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