Name: 动脉再狭窄小鼠模型：股导线损伤的技术方面 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习小鼠股动脉导丝损伤技术以诱导内膜增生并研究再狭窄机制。该方案通过精确操作建立可重复的血管生物学模型，为心血管疾病治疗策略提供研究基础。

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本研究得到了威斯康星州合作伙伴计划新研究者奖（编号 2832）、美国国家心肺血液研究所 R01 基金（HL-068673）以及 T32 培训基金（HL-110853）的支持。我们感谢西北大学 Melina Kibbe 博士课题组提供的有益信息。

注意：伦理声明：所有操作均遵循《实验动物护理与使用指南》（美国国家科学院出版社，第8版，2011年），并经威斯康星大学机构动物护理与使用委员会批准。所有手术均在异氟烷麻醉下进行（通过吸入，流速为2 ml/min），并尽一切努力减少动物痛苦。动物通过逐渐充满CO2的安乐死舱实施安乐死。
1. 全身麻醉的诱导与皮肤切口
<ol>
	<li>使用12–16周龄、体重23–28 g的雄性C57BL/6小鼠。通过密闭回路麻醉装置使用异氟烷对动物进行麻醉。通过捏压其脚趾确认麻醉效果。在眼睛上涂抹适量人工泪液软膏以防止干燥。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，左后肢轻度外展，膝关节轻度屈曲。剃除左大腿上部区域的毛发，并使用无菌棉签蘸取氯己定溶液擦拭三次以消毒皮肤&#160;。手术过程中使用灼热珠灭菌器保持器械无菌。</li>
	<li>在左腿上覆盖无菌纱布巾。从膝关节&#160;至腹股沟处沿左大腿内侧做一条1.5 cm长的直线纵向皮肤切口（图1A）。</li>
</ol>
2. 暴露股动脉及其分支
注意：图1B 显示了大腿上部的总体血管解剖结构。当沿大腿内侧中线正确做皮肤切口后，可通过解剖显微镜观察到股浅动脉（SFA）。
<ol>
	<li>用精细镊子打开覆盖在股浅动脉（SFA）上的薄层筋膜，然后用9-0尼龙缝线环绕SFA打结。 
	注意：在此过程中，股神经容易被推开，但邻近的股静脉需特别注意，因其管壁极薄，容易穿孔出血。关键技巧是专注于动脉本身；只要解剖操作紧贴动脉进行，即可避免意外损伤静脉。</li>
	<li>一旦完成SFA的套环，用蚊式钳夹住缝线并轻轻向下牵拉。此操作有助于进一步解剖，但应注意不可过度牵拉，以免损伤动脉。</li>
	<li>继续向近端解剖动脉，暴露并用9-0尼龙缝线环绕股总动脉（CFA）。 
	注意：通常在腹壁下动脉远端位置（图1B）环绕CFA已足以进行导丝插入。以相同方式用蚊式钳夹住CFA的缝线环。</li>
	<li>将CFA的缝线环向上牵拉，SFA的缝线环向下牵拉，以暴露SFA与股深动脉（DFA）的分叉处。DFA是CFA的主要分支，走向大腿肌肉方向（图1B）。 
	注意：后续将从DFA插入导丝。</li>
	<li>环绕DFA时需格外小心，因为邻近的静脉常缠绕于动脉下方。若静脉出血，通常使用纱布进行30至60秒&#160;的简单压迫即可实现止血。</li>
	<li>一旦用9-0尼龙缝线完成DFA的套环，需确认三条缝线环均处于正确位置（图2A）。</li>
	<li>继续向远端解剖DFA，并在尽可能远离分叉处的位置结扎该动脉。剪除多余的缝线，但保留一定长度，以便用蚊式钳夹住两端。这有助于稳定DFA，使导丝插入更加容易。</li>
</ol>
3. 制备导丝损伤模型
<ol>
	<li>通过股深动脉（DFA）插入导丝
	<ol>
		<li>收紧股总动脉（CFA）、股浅动脉（SFA）和股深动脉（DFA）的缝线，建立临时止血。</li>
		<li>使用显微剪刀在DFA上制作一个小孔。插入弯头显微镊的尖端，将孔扩大至足以容纳直径为0.015英寸的导丝（图2B展示了动脉与导丝之间的尺寸差异）。
		<ol>
			<li>在DFA上打孔前，先松开CFA的缝线环，并用钝头显微镊轻轻夹压DFA数次。此操作可显著扩张动脉直径，便于导丝插入。将导丝充分润湿PBS也对顺利插入至关重要。</li>
			<li>在DFA上打孔时，不要剪除动脉壁，而应做一个小的V形切口，并用尖头显微镊夹住瓣膜以便操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将导丝经充分扩张的DFA孔插入。在逐渐松开CFA周围缝线环的同时，轻柔地将导丝向髂动脉方向推进。在大多数情况下，推进5–8 mm即可覆盖整个CFA长度（图2C）。切勿用力插入导丝，因动脉穿孔通常会导致小鼠死亡。将导丝剪短至约15 mm长度有助于操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>留置导丝1分钟
	<ol>
		<li>将导丝插入至合适深度后，留置1分钟以过度拉伸动脉壁。期间需用PBS润湿导丝和动脉，防止干燥。在此等待期间，可在DFA上靠近导丝插入点的近端再放置一根9-0尼龙缝线。该缝线将在后续取出导丝后用于闭合DFA上的孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出导丝并恢复血流
	<ol>
		<li>用血管插管镊夹住导丝，轻柔地将其回撤；导丝应能顺利取出。若遇到阻力（通常由导丝粘附于动脉壁引起），可边轻轻旋转边回撤导丝，有助于克服阻力。再次强调，粗暴操作可能导致动物死亡。</li>
		<li>取出导丝后，使用9-0尼龙缝线在DFA分叉处进行结扎。结扎位置不宜过于靠近分叉点，以免影响SFA的血液流出。</li>
		<li>松开SFA和CFA的缝线环，恢复正常的血流。注意此时CFA已被导丝充分扩张（图2D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 皮肤缝合与术后护理
<ol>
	<li>控制出血。轻微渗血可通过简单压迫止血；一些较大的动脉出血则需要使用11-0尼龙缝线进行缝合。这些被缝合的动脉最终将导致动脉闭塞。</li>
	<li>使用皮肤缝合钉闭合皮肤伤口（通常使用3–4个缝合钉）。通过&#160;涂抹氯己定外科溶液保持伤口区域无菌。</li>
	<li>实施术后处理。通过皮下注射布托啡诺控制小鼠疼痛。将小鼠置于加热垫上，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。在完全恢复前，将其单独饲养于清洁的笼具中，避免与其他动物同笼。</li>
</ol>

<ol><li>Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+proliferation+and+atherosclerosis%3A+new+perspectives+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies.</a> Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).</li>
<li>Hui, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intimal+hyperplasia+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Intimal hyperplasia in murine models.</a> Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).</li>
<li>Ferns, G. A., Avades, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+coronary+restenosis%3A+insights+from+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models.</a> Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).</li>
<li>Sata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+vascular+injury+that+induces+rapid+onset+of+medial+cell+apoptosis+followed+by+reproducible+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia.</a> J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+arteriosclerosis%3A+from+arterial+injuries+to+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts.</a> Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT4+deficiency+protects+against+neointima+formation+following+arterial+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).</li>
<li>Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E+inhibits+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).</li>
<li>Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metabolic+syndrome+on+the+response+to+arterial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury.</a> J Surg Res. , (2014).</li>
<li>Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+in+genetic+determinants+for+injury-induced+neointimal+hyperplasia+and+diet-induced+atherosclerosis+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).</li>
<li>Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differential+neointimal+response+in+vein+grafts+and+wire-injured+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+J%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries.</a> Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).</li>
<li>Ishigami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+CuZn+superoxide+dismutase+promotes+inflammation+and+alters+medial+structure+following+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Atheroscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury.</a> J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

只要小鼠的解剖结构相似，导丝损伤术适用于所有品系的小鼠4。在本研究中，我们使用了12–16周龄的雄性C57BL/6小鼠。根据我们的预实验结果，10周龄以下小鼠的股动脉通常过小，导致导丝插入非常困难。而16周龄以上小鼠的导丝插入在技术上较为容易，但往往导致新生内膜增生的程度更具变异性。雌性小鼠的新生内膜形成通常少于雄性小鼠。尽管导丝损伤术可在股动脉的任一侧进行，但我们更倾向于选择左侧，因为对于惯用右手的操作者而言，左侧在解剖结构上更易于操作。
在所有用于研究血管成形术后再狭窄的小鼠模型中，动脉导丝损伤模型通过内皮剥脱和血管壁过度扩张，最接近真实血管成形术的病理过程2,5,6。导丝损伤常用的两个主要靶血管是股动脉和颈动脉。从技术角度来看，由于颈动脉比股动脉更宽，导丝插入操作更为容易。然而，颈动脉的新生内膜形成通常不如股动脉显著，这可能与内皮剥脱效果较弱有关。一些研究者使用自制装置以在颈动脉中实现更强烈的内皮剥脱7。相比之下，股动脉导丝损伤模型的优势在于可使用标准化生产、市售的导丝，以可重复的方式诱导新生内膜增生。...

在血管内治疗技术广泛应用于各类心血管疾病的当今时代，血管成形术后发生再狭窄是接受此类治疗患者面临的主要问题之一。血管成形术过程中对血管内皮的损伤，结合动脉粥样硬化的基础病变，会诱导中膜层平滑肌细胞过度增殖，从而导致新生内膜增生。1,2 因此，建立一种能够重现血管成形术后新生内膜增生的可行动物模型，不仅对于疾病机制的研究至关重要，而且对于开发治疗该病理状态的有效疗法也具有重要意义。
小鼠是再现内膜增生的优良动物模型，原因如下：实验小鼠的遗传背景明确；存在多种基因修饰品系2；易于获得相同遗传背景的同窝仔鼠；且饲养成本相对较低。动脉结扎模型和导丝损伤模型是机械诱导内膜增生最常用的两种小鼠模型。动脉结扎模型易于建立，但生理上与实际的血管成形术差异较大。导丝损伤模型能更真实地模拟实际血管成形术过程，但由于小鼠动脉管径细小，技术操作难度较高2,3。Sata et al. 首次基于血管解剖结构并采用合适尺寸的柔性导丝，描述了一种用于小鼠股动脉的导丝损伤方法。通过该技术，他们成功在多种小鼠品系中可重复地诱导出内膜增生4。
尽管股动脉导丝损伤是一种成熟的模型，但与其他模型（如结扎法）相比，该技术的某些操作环节极具挑战性。5 本文旨在详细介绍我们所采用的小鼠导丝损伤模型操作步骤，该方法是在Sata原始方法基础上的改良版本。我们主要进行了两项改进：1）仅套扎动脉；2）不使用利多卡因。

<table><tbody><tr><td>固定核心导丝</td><td>Cook</td><td>G02426</td><td>直径 0.015 英寸，直型</td></tr><tr><td>扩张钳</td><td>Roboz</td><td>RS-4927</td><td>弯曲，钝头</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td>直型，尖头</td></tr><tr><td>Dumont 血管插管钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>503373</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>501234</td><td></td></tr><tr><td>蚊式钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501291</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 尼龙缝线 9-0</td><td>Ethicon</td><td>7717G</td><td>9-0，黑色单丝尼龙</td></tr><tr><td>Micro AROSuture，无菌 11-0，70 微米，MET 针尖</td><td>AROSurgical</td><td>VT4A00N07</td><td>11-0，黑色单丝尼龙</td></tr><tr><td>3M Precise 多发式 DS 一次性皮肤缝合器</td><td>3M</td><td>DS-25</td><td></td></tr></tbody></table>

一种动脉再狭窄的小鼠模型：股动脉导丝损伤的技术要点

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

由动脉粥样硬化引起的心血管疾病是发达国家死亡的首要原因。由于动脉粥样硬化斑块的形成或已有斑块破裂导致血管管腔狭窄，会中断正常的血流，从而引发心肌梗死和脑卒中等多种疾病。临床上常采用血管成形术等血管内介入手段重新开通管腔。然而，这些治疗不可避免地会损伤血管壁及血管内皮，引发过度的愈合反应，导致新生内膜斑块向管腔内延伸，造成血管再狭窄（即管腔再次变窄）。再狭窄仍是动脉粥样硬化血管内治疗失败的主要原因之一。因此，再狭窄的临床前动物模型对于研究其病理生理机制以及血管介入治疗的转化研究至关重要。在多种小鼠实验模型中，股动脉导丝损伤模型被广泛认为是研究血管成形术后再狭窄最合适的模型，因其操作过程与血管成形术相似，均可同时损伤内皮和血管壁。然而，由于该模型技术难度较高，许多研究人员在使用时面临困难。这主要是因为需要将一根金属导丝插入直径约为导丝三分之一粗细的股动脉中，以产生足够损伤从而诱导显著的新生内膜形成。本文详细描述了克服该模型主要技术难点的关键手术步骤。通过遵循本文所述操作流程，小鼠股动脉导丝损伤模型的实施将变得更加简便。一旦熟练掌握，整个操作可在20分钟内完成。

术后四周，取股动脉导丝损伤部位，制备石蜡包埋标本以分析新生内膜形成情况。按前述方法诱导全身麻醉，迅速开胸，将20号蝶形针插入左心室，连接输液瓶，进行灌注固定。 通过 PBS 滴注，随后使用 4% 多聚甲醛（通常各 10–20 ml）灌注。灌注瓶应置于高于心脏水平约 140 cm 处，以确保动物在生理压力下进行灌注。等待 20 分钟后，取出导丝损伤的股动脉（CFA），并在 4% 多聚甲醛中于 4 °C 过夜固定 4 °C使用标准组织学技术将标本制成石蜡包埋块，并制备5-μm厚的横切面μm 组织学染色所需的厚度
苏木精-伊红染色可清晰显示股动脉损伤后内膜增生的形成情况（图3A，导丝损伤的股动脉；3B，未损伤的股动脉）。使用适当的软件测量横截面上的管腔面积（LA）、内弹性膜（IEL）面积和外弹性膜（EEL）面积（图3C）。通过从内弹性膜面积中减去管腔面积来计算内膜面积；通过从外弹性膜面积中减去内弹性膜面积来计算中膜面积。内膜面积与中膜面积的比值用于比较不同实验组之间的内...

再狭窄的小鼠股动脉导丝损伤模型在技术上具有挑战性。在本方案中，我们展示了成功实施导丝损伤以诱导稳定&#160;新生内膜，用于再狭窄研究的关键技术细节。

由动脉粥样硬化引起的心血管疾病是发达国家死亡的首要原因。由于……导致的血管管腔狭窄，

本实验的目的是通过导丝损伤法在小鼠股动脉中诱导形成明显的内膜增生。首先在左侧大腿做一纵向皮肤切口，随后定位股动脉，并在三个重要解剖部位进行结扎：浅股动脉（SFA）、股总动脉（CFA）和深股动脉（DFA）。然后在DFA管壁上制造一个小孔，插入一根金属丝并推进至CFA，在此位置留置一分钟。最后，取出金属丝，并在两个位置结扎DFA。最终，横截面的苏木精和伊红染色显示股动脉存在明显的内膜增生。通常，初次接触该方法的研究人员会面临两个困难。首先，他们必须从肌肉深层找到正确的穿刺动脉。其次，他们需要插入一根导丝，其直径约为穿刺动脉的三倍。在对一只雄性 C57 plaque six 小鼠进行麻醉后。根据文字方案，确认小鼠麻醉适当后，涂抹眼膏，将小鼠置于仰卧位，左肢稍外展，膝关节轻度屈曲。待毛发剃净并用精细镊子对区域消毒后，切开覆盖股浅动脉的薄层筋膜，使用9-0尼龙缝线。用蚊式钳夹住缝线环绕股浅动脉，并轻轻向下牵拉，以利于后续解剖操作。继续解剖血管，暴露股总动脉（CFA）。然后使用9-0尼龙缝线，在持住双线环的同时环绕股总动脉。向上牵拉CFA缝线环，向下牵拉SFA缝线环，以暴露SFA与向大腿肌肉分支的股深动脉（DFA）的分叉处。接下来，需格外小心地环绕DFA，注意避免损伤位于动脉下方交织的邻近静脉。若静脉出血，可使用GREs施加30至62秒的压迫以实现止血。当完成深部股动脉（DFA）成环后，确保所有三个缝线环均处于正确位置。随后向远端解剖DFA，并在尽可能远离分叉处的位置结扎动脉。剪断额外的缝线，但保留一定长度，以便使用蚊式钳夹住两端以稳定DFA，这将有助于导丝插入。开始插入导丝前，先适度拉紧C-F-A-S-F-A和DFA上的缝线。为了建立临时止血，松开股动脉（CFA）缝合环，并使用钝头显微镊子轻轻夹住或挤压深股动脉（DFA）数次。这将显著扩张动脉直径，便于导丝插入。接着，用尖头显微镊子在深股动脉（DFA）上剪出一个微小的V形切口，并夹起瓣膜组织。使用 PBS 充分润湿导丝，切勿用力。将导丝轻柔地穿过 DFA 上已充分扩张的孔，并向髂动脉方向缓慢推进。在松开围绕 CFA 的缝线环时，通常松开 5 至 8 毫米即可覆盖大多数情况下 CFA 的长度。将导丝插入至最佳长度后，静置一分钟，以过度扩张动脉壁；等待期间，使用 PBS 润湿导丝和动脉，防止干燥。在导丝插入点近端的深部股动脉（DFA）周围再放置九个零号缝线，以备后续使用。用于关闭 DFA 上的孔洞，以取出导丝并恢复血流。使用血管插管镊夹住导丝，轻柔地将其回撤，必要时可旋转导丝，以克服因粘附于动脉壁而产生的阻力。回收导丝后，使用9-0缝线将深股动脉（DFA）在靠近分叉处结扎，确保不会影响血液向浅股动脉（SFA）的流出。松开浅股动脉和共同股动脉的缝线环，以恢复正常的血流。通过插入导丝，CFA 将充分扩张，随后闭合皮肤，进行术后

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