Name: 组织工程血管在小鼠模型的生成和嫁接 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 了解利用部分诱导多能干细胞和脱细胞血管支架在小鼠模型中生成组织工程血管移植物的方法。该技术通过生物反应器双重接种实现功能性血管构建，为心血管疾病治疗提供新途径。

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本工作由英国心脏基金会和奥克基金会资助。

所有动物实验均须依照机构实验动物使用与护理委员会批准的方案进行。
1. 培养基的制备
<ol>
	<li>制备人成纤维细胞系 CCL-153 的培养基：F-12K 培养基，含 10% 胎牛血清（FBS）和 100 U/ml 青霉素-链霉素。</li>
	<li>制备用于 PiPSC 生成的重编程培养基：含 20% Knockout 血清替代物、0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM 最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子 2（bFGF-2）和 100 U/ml 青霉素-链霉素的 Knockout DMEM 培养基。每次使用前需新鲜添加 bFGF-2。</li>
	<li>制备诱导平滑肌细胞（SMC）分化的分化培养基（DM）：含 10% FBS、0.1 mM β-巯基乙醇、100 U/ml 青霉素-链霉素和 25 ng/ml 血小板源性生长因子（PDGF-ββ）的 α-MEM 培养基。</li>
	<li>制备诱导内皮细胞（EC）分化的内皮分化培养基（EC-DM）：含 50 ng/ml 血管内皮生长因子（VEGF）和 100 U/ml 青霉素-链霉素的内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）。</li>
</ol>
2. 将人类成纤维细胞重编程为部分诱导多能干细胞（PiPSC）
<ol>
	<li>在涂有0.04%明胶溶液的培养瓶中，使用培养基培养人成纤维细胞系CCL-153。</li>
	<li>每3天以1:6的比例传代一次细胞。为获得最佳PiPSC生成效率，应使用第9代之前的细胞。当细胞融合度达到80–90%时，即可进行转染。</li>
	<li>线性化含有4个重编程因子——八聚体结合转录因子4（OCT4）、SOX2、Kruppel样因子4（KLF4）和C-MYC（pCAG-OSKM）的多顺反子质粒pCAG2LMKOSimO。取5 µg质粒，加入5单位PvuI限制性内切酶，在37 °C下消化3小时。按照生产商说明书，使用 commercial kit 纯化质粒。</li>
	<li>通过电穿孔法，使用人真皮成纤维细胞（NHDF）核转染试剂盒，将4 µg线性化的pCAG-OSKM质粒转染至2 × 106个人成纤维细胞中，操作按照生产商说明书进行。将转染后的细胞轻柔接种至预先涂有0.04%明胶的T25培养瓶中，瓶内含5 ml预热的重编程培养基。</li>
	<li>24小时后，更换培养基，并添加25 µg/ml新霉素，以筛选出纯的转染细胞群体。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基，直至第4天。 
	注意：人成纤维细胞在重编程4天后即转化为PiPSC。</li>
</ol>
3. 将PiPSC分化为内皮细胞和平滑肌细胞
<ol>
	<li>将PiPSC接种于预先包被胶原蛋白IV的培养皿中，加入分化培养基（DM），培养4天以诱导其向平滑肌细胞分化。每隔一天更换一次培养基，直至第4天。</li>
	<li>将PiPSC接种于预先包被胶原蛋白IV的培养皿中，加入内皮细胞分化培养基（endothelial-DM），培养6天以诱导其向内皮细胞分化。每隔一天更换一次培养基，直至第6天。</li>
</ol>
4. 脱细胞主动脉移植物制备
注意：所有溶液和设备均应无菌。
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠，并在解剖显微镜下将小鼠仰卧固定。</li>
	<li>剪开胸骨及肋骨周围组织以暴露胸腔，移除心脏、肺和食管以显露主动脉。用镊子轻轻去除主动脉周围的脂肪组织。</li>
	<li>用剪刀从主动脉前端剪开，并用钝头镊子轻轻夹住末端。通过钝性分离将主动脉从其后方的脊柱上剥离。使用双极电凝仪对从主动脉发出的各个分支血管进行结扎，并在结扎远端用剪刀切断分支。</li>
	<li>使用5 ml注射器将含有100 U肝素的3 ml生理盐水冲洗主动脉腔，以防止血栓形成。</li>
	<li>在主动脉分出肾动脉之前，剪断其后端。在整个操作过程中，保持主动脉的完整性至关重要。</li>
	<li>用5 ml含0.075%十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗主动脉腔。</li>
	<li>将胸主动脉浸泡于10 cm培养皿中的0.075% SDS溶液中，将培养皿置于摇床上，室温下以150 rpm振荡2小时。</li>
	<li>用5 ml PBS冲洗主动脉腔。</li>
	<li>将主动脉浸泡于10 cm培养皿中的PBS中，置于摇床上，室温下以150 rpm振荡2小时，每20分钟更换一次PBS。</li>
	<li>用5 ml PBS再次冲洗主动脉腔。</li>
	<li>去细胞化后的主动脉移植物可保存在4 °C的PBS中，最长可保存一周。</li>
</ol>
5. PiPSC 的双重接种与生物反应器培养
注意：所有溶液和设备均应无菌。所有操作均须在组织培养罩内进行。
<ol>
	<li>按照图1所示组装生物反应器流动回路。使用管路连接孵育室、培养基储液罐、蠕动泵和顺应性腔室。循环所需的培养基最小体积为40 ml。</li>
	<li>通过将主动脉浸泡在10 cm培养皿中的DM培养基中，对脱细胞血管进行预处理。将培养皿置于摇床上，在室温下以50 rpm振荡1小时。</li>
	<li>在显微镜下将长度为1 cm的尼龙管（外径0.9 mm，内径0.75 mm）插入脱细胞血管的两端。用8-0丝线将血管与尼龙管结扎固定。</li>
	<li>通过将尼龙管连接至孵育室壁上的进样口和出样口（1/32”管路），将脱细胞主动脉移植物组装至孵育室内。每次孵育室内维持5 ml培养基。</li>
	<li>向培养皿中加入预热的胰蛋白酶覆盖细胞层，轻轻晃动培养皿10次以消化PiPSC。弃去胰蛋白酶，将培养皿放入培养箱中静置2–3分钟。加入预热的培养基，混匀细胞与培养基。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞数量。取两份细胞悬液，每份含5 × 105个细胞，于300 × g离心5分钟。彻底吸除上清液。</li>
	<li>完全吸除上清液后，将其中一份PiPS细胞沉淀重悬于50 µl DM培养基中。将该细胞悬液注入脱细胞血管的管腔内。</li>
	<li>将另一份PiPS细胞沉淀重悬于100 µl Matrigel中。小心地将混合物滴加至脱细胞主动脉移植物的外表面。</li>
	<li>静置10–15分钟，直至混合物形成凝胶状并均匀包裹血管外表面。随后向孵育室中加入DM培养基。</li>
	<li>将整个生物反应器系统置于37 °C、5% CO2的培养箱中。在最初的2小时内，每隔半小时手动将脱细胞移植物沿纵轴旋转90°。</li>
	<li>静置培养12小时，以促进细胞黏附。</li>
	<li>通过蠕动泵向管腔内输送DM培养基，以诱导平滑肌细胞分化。初始流速设为5 ml/min，并在24小时内逐步增加至20 ml/min。</li>
	<li>维持循环培养基流速为20 ml/min，持续24小时。</li>
	<li>停止培养基流动，并将生物反应器系统移出培养箱。</li>
	<li>对移植物管腔重新接种PiPSC。按照步骤5.5–5.6的方法，对1 × 106个PiPSC进行胰蛋白酶消化、计数和离心。将细胞重悬于50 µl含有50 ng/ml VEGF的EGM-2培养基中。将细胞混合物注入移植物的管腔内。</li>
	<li>将孵育室及整个循环系统中的培养基更换为含有50 ng/ml VEGF的EGM-2培养基，以诱导内皮细胞分化。</li>
	<li>将生物反应器系统重新放回培养箱中。在最初的2小时内，每隔30分钟手动旋转移植物90°，随后继续静置培养12小时。</li>
	<li>启动循环流动，初始流速为5 ml/min，并逐步增加至35 ml/min。维持35 ml/min的流速持续5天。每隔一天更换一次循环系统和孵育室中的培养基。</li>
	<li>收获工程化移植物，用于后续的小鼠移植实验。</li>
</ol>
6. 将双种子PiPSC移植物移植到小鼠体内
<ol>
	<li>使用 NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl 雄性小鼠作为血管移植物受体。确保小鼠年龄约为 10 周，体重在 25 - 35 g 之间，并处于良好健康状态。</li>
	<li>通过腹腔注射 Hypnorm（25 mg/kg）和 Hypnovel（25 mg/kg）的混合物对受体小鼠进行麻醉。在眼睛上涂抹凡士林眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。通过观察小鼠肌肉是否放松、呼吸是否平稳来确认麻醉效果充分。
	<ol>
		<li>将小鼠仰卧固定，颈部剃毛并伸展。联合麻醉剂给予硫酸阿托品（1.7 mg/kg），以确保小鼠呼吸道通畅。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小鼠下颌至胸骨处做正中切口。在放大 5 至 10 倍的解剖显微镜下，将右侧唾液腺向外侧牵拉，并切除右侧胸锁乳突肌，以暴露右侧颈总动脉。</li>
	<li>轻柔剥离附着组织，从远端向近端游离右侧颈总动脉。用 8-0 丝线在颈总动脉中段结扎两次，并在两结扎线之间进行分离。</li>
	<li>将由可高压灭菌尼龙管制成的套管分别套入血管两端，并用微型止血钳夹住每端固定。</li>
	<li>松开一端的结扎线&#160;，并在该端滴加肝素（100 U/ml）。随后立即将动脉远端翻转，使其完全包绕套管主体，并用 8-0 丝线将翻转后的血管固定于套管上。
	<ol>
		<li>对另一侧动脉段重复相同操作。用生理盐水冲洗动脉，以清除血凝块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脱细胞血管移植物植入颈总动脉两端之间，将脱细胞血管的两端分别套入动脉套管上，并用 8-0 丝线固定。在评估移植物搏动前，先移除两端的血管夹。</li>
	<li>将右侧唾液腺复位至原始位置。使用 6-0 聚乳酸羟基乙酸缝线对切口皮肤行间断缝合。</li>
	<li>手术完成后持续监测小鼠生命体征，直至其恢复意识。于术后 24 小时或 3 周后通过颈椎脱臼法处死受体小鼠，并取下血管移植物用于后续分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者没有相互冲突的财务利益。

本方案介绍了一种合理、快速、简便、高效且可重复的策略，可利用人成纤维细胞来源的PiPSC生成具有功能的组织工程血管。该技术将成为再生医学、组织工程以及未来潜在的患者特异性细胞治疗的重要工具。确保本方案有效性的关键步骤包括PiPSC的制备、无菌且完全脱细胞主动脉移植物的制备、PiPSC在支架中的成功接种与分化，以及在血管生物反应器中维持主动脉移植物的无菌状态。
为成功制备组织工程移植物，确保PiPSC的有效制备至关重要。本方案通过使用pCAG2LMKOSimO OSKM质粒对人成纤维细胞系进行核转染，成功实现了成纤维细胞向PiPSC的“重编程”。核转染后成纤维细胞的存活依赖于多个关键因素：使用高质量的OSKM质粒，质粒浓度维持在500–1,000 ng/µl之间；核转染后应立即接种细胞，避免延迟，因细胞在导入较大质粒后尤为敏感；此外，必须在使用前将FGF-2加入新配制的培养基中，该因子对细胞存活至关重要。我们还发现，使用传代数不超过第9代的细胞可避免复制性衰老，从而确保高效“重编程”为PiPSC，并支持其后续向内皮细胞和平滑肌细胞的有效分化。通过新霉素筛选核转染后的细胞，可提高PiP...

构建血管通路是修复由心血管疾病导致的受损或受伤血管的基本外科策略。迄今为止，手术中使用的移植物材料包括生物相容性合成聚合物（聚四氟乙烯[Teflon]、膨体聚四氟乙烯[ePTFE；Gore-Tex]或聚对苯二甲酸乙二醇酯[Dacron]）、同种异体移植物、自体组织（心包或大隐静脉）以及异种移植物1。尽管人工移植物（例如，Gore-Tex 和 Dacron）应用最为广泛，但这些材料可能引发多种短期和长期并发症，包括狭窄、钙沉积、血栓栓塞和感染。虽然使用生物移植物的患者血栓栓塞事件减少，但仍存在继发性移植物失效和因钙化降解导致耐久性缩短等局限性2。因此，尽管多年来外科技术已有显著进步，研究人员和临床医生仍面临寻找理想血管通路材料的需求。近年来，血管组织工程研究领域提出了一种新概念，即将细胞整合到可生物降解的支架中，旨在构建一种仿生微环境，以模拟具有正常功能的血管，实现成功的移植1。从根本上讲，血管构建物的成功依赖于三个基本要素：构成支架的细胞，即内皮细胞内层和平滑肌细胞层；含有适当细胞外基质的支架，以提供与天然血管相似的力学性能；以及启动和调控修复过程所必需的分子/细胞信号传导。
长期的移植物通畅性以及新生组织的持续发育在很大程度上依赖于支架上有效的细胞接种，因此细胞类型的选取至关重要。已有若干研究报告采用来自不同来源的成熟内皮细胞和平滑肌细胞来构建小直径血管通路3-6。尽管前景良好，但获取足够自体血管以分离成熟内皮细胞和平滑肌细胞的困难仍是目前面临的重要挑战。近年来，来自多种来源的干细胞已被广泛应用于血管组织工程。事实上，多种类型的干细胞，包括胚胎干细胞7、诱导性多能干细胞（iPSCs）8,9、PiPSC10,11、骨髓来源的单个核细胞12、间充质干细胞13、内皮祖细胞以及成体血管壁来源的干细胞抗原-1（Sca-1）+干细胞/祖细胞14,15，均已被证实可在特定培养基和培养条件下分化为功能性内皮细胞或平滑肌细胞。此外，干细胞具有无限的自我更新能力，而成熟内皮细胞和平滑肌细胞只能有限分裂，随后即进入生长停滞和衰老状态，因此干细胞是更具优势的候选细胞类型。
选择用于构建成功组织工程血管移植物的支架材料取决于多种因素，例如生物相容性、生物力学性能以及生物降解速率。从根本上讲，用于构建移植物的支架材料应具备可生物降解性，并且不会引发不必要的受体免疫反应。此外，材料必须具有适宜的孔隙率和微结构，以利于细胞附着及后续存活。迄今为止，血管组织工程中应用最广泛的支架材料包括聚乙醇酸、聚乳酸和聚ε-己内酯的聚合物16。近年来，脱细胞生物材料也已得到一定成功应用。多个实验室研究表明，将自体细胞接种于脱细胞的人源、犬源或猪源血管上，可获得具有抗血栓形成和抗内膜增生能力的生物移植物17-19。血管组织工程中的其他策略还包括基于细胞外基质蛋白的血管移植物，例如，在纤维蛋白凝胶中接种细胞13，以及在无支架支持下生成细胞片层20, 21。
本方案展示了将人源PiPSC分化为功能性内皮细胞和平滑肌细胞的过程，构建包含去细胞化血管支架以承载功能性PiPSC来源血管细胞的生物反应器，并将组织工程血管移植至重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内。PiPSC是进行血管移植物组织工程的理想细胞类型，因为这些细胞在小鼠体内不会形成肿瘤，且不引发伦理问题或异体免疫反应。此外，我们已证实生成PiPSC-内皮细胞和PiPSC-平滑肌细胞的策略具有高效性和可重复性10,11。随后，我们设计了去细胞化血管支架，用于接种PiPSC来源的血管细胞，以高度模拟天然血管中存在的基质蛋白，从而提高移植效率和细胞存活率。更重要的是，在接种PiPSC前对血管进行去细胞化处理，可防止巨噬细胞等免疫细胞引发的炎症反应。尤为关键的是，本方案不仅为开发具有临床转化前景的血管通路提供了方法学基础，同时也为通过小鼠模型研究和理解调控血管组织再生的分子机制提供了重要手段。

<table><tbody><tr><td>人成纤维细胞 CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>产前人胚胎成纤维细胞</td></tr><tr><td>ATCC F-12K 培养基（Kaighn 改良的 Ham's F-12 培养基）</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>适用于胚胎干细胞的 Knockout DMEM 培养基</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>人碱性 FGF-2&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM 培养基</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>人 PDGF</td><td>R&amp;D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>2% 明胶溶液</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>质粒 20866：pCAG2LMKOSimO（SOX2、OCT4、KLF4、C-MYC）</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PvuI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>核转染试剂盒（NHDF 试剂盒）</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>新霉素</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD，体视显微镜照明系统</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>体视显微镜用冷光源照明</td></tr><tr><td>尼康变焦体视显微镜 SMZ800</td><td>尼康</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS 储存液，分子生物学试剂</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（10 mg/mL）</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>IKA Vibrax 摇床，配备 VX 7 摇板&amp;nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke&amp;Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 数字泵驱动器</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6 通道、6 滚轮卡式泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 泵头用大容量卡式管</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 铂固化硅胶泵管，L/S 14，25 英尺</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>管路穿过蠕动泵</td></tr><tr><td>内径 0.5 mm，外径 0.8 mm 硅胶管</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>连接孵育室、培养基储液罐和顺应性腔室的管路&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 至 1.6 接头变径接头，天然聚丙烯</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>连接上述两种管路的适配器</td></tr><tr><td>1/32&quot; 管路，内径 0.01&quot;（250&amp;micro;m），材质：PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>穿过孵育室壁的管路，连接移植物与外部管路</td></tr><tr><td>一体式接头&amp;nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>将上述管路固定于孵育室壁上</td></tr><tr><td>尼龙管（外径 0.9 mm，内径 0.75 mm）&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>插入主动脉移植物两端的管路</td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;/NcrCrl 小鼠</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术缝线，8-0&amp;nbsp;丝线</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>用于小鼠的神经安定镇痛剂</td></tr><tr><td>Hypnovel（咪达唑仑）</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>麻醉诱导</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>尼龙管</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>直径 0.65 mm，长度 1 mm；用于制作动脉套环</td></tr><tr><td>电凝器</td><td>Martin&amp;nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>结扎主动脉分支动脉</td></tr><tr><td>双极微血管夹止血钳</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>固定血管末端</td></tr><tr><td>血管扩张器</td><td>S&amp;T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>血管扩张器</td><td>S&amp;T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>血管扩张器</td><td>S&amp;T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>微型施夹器&amp;nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>手术缝线，6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

在小鼠模型中组织工程血管的构建与移植

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

构建血管导管是修复由心血管疾病导致的受损和受伤血管的一种基本外科策略。本方案介绍了一种高效且可重复的策略，可通过人成纤维细胞来源的部分诱导多能干细胞（PiPSC）生成具有功能的组织工程血管移植物。我们设计了一种去细胞化血管支架生物反应器，可模拟天然血管内的基质蛋白结构和血流环境，用于在将PiPSC来源的内皮细胞或平滑肌细胞移植到小鼠体内前进行细胞接种。该方法已被证明具有显著优势：接受PiPSC来源移植物的免疫缺陷小鼠在术后3周的存活率明显提高。本方案为再生医学、组织工程以及未来潜在的患者特异性细胞治疗提供了一种有价值的工具。

在将携带四个转录因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC（OSKM）的线性化pCAG2LMKOSimO质粒转染人成纤维细胞后4天，成功获得了PiPSC。与成纤维细胞相比，PiPSC表现出显著不同的表型（图2A）并在mRNA水平表达4种重编程因子（图2B）和蛋白质（图2C）水平10PiPSC来源的血管移植物的有效性在很大程度上取决于PiPSC分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞谱系的能力。因此，验证PiPSC的这些特性至关重要。 体外 通过在特定培养基中对细胞进行分化，再利用这些细胞生成血管移植物。 图3 显示了PiPSC在基因水平上分化为功能性内皮细胞的能力（图3A）以及蛋白质（图3B-D）水平，依据内皮特异性标志物10同样，PiPSC 也能在特定培养基的诱导下分化为平滑肌谱系图3E-H)11.
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本文介绍一种制备功能性组织工程血管移植物的方案，该移植物可用于小鼠体内移植。该方法通过在脱细胞血管支架生物反应器上共接种部分诱导多能干细胞（PiPSC）来源的平滑肌细胞和PiPSC来源的内皮细胞来实现。

血管通路的构建是修复由心血管疾病导致的受损和受伤血管的一种基本外科策略。

本实验的总体目标是制备可用于移植到小鼠体内的功能性组织工程血管移植物。首先在体外将人成纤维细胞重编程为部分诱导的多能干细胞，这些细胞具有分化为内皮细胞和平滑肌细胞的能力。随后，从小鼠体内取出主动脉，并用十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行脱细胞处理，以制备脱细胞主动脉移植物。接下来，建立生物反应器流动回路，用于部分诱导的多能干细胞的双相接种。最后一步是将经过双相接种的部分诱导多能干细胞移植物移植到小鼠体内。最终，通过分析移植后三周小鼠的死亡率，以验证组织工程血管移植物的功能性。该技术在心血管疾病治疗方面具有广阔的应用前景，因为它已被证明可在短时间内利用PIPS细胞成功生成具有功能的血管。通常情况下，在整个操作过程中保持血管移植物的完整性和无菌性至关重要，特别是对于初次使用该方法的研究人员而言。本操作首先使用人皮肤成纤维细胞核转染试剂盒，将4微克线性化的OSKM质粒转入人成纤维细胞，从而将其重编程为部分诱导的多能干细胞（PIPS细胞）。人成纤维细胞在重编程四天后转变为PIPS细胞。通过颈椎脱位法处死小鼠后，将小鼠置于解剖显微镜下，仰卧位放置并进行混合。然后剪开胸骨并沿肋骨框架周围切割，以打开胸腔。取出心脏、肺和食管以暴露主动脉，随后用镊子轻轻去除主动脉周围的脂肪组织。用剪刀从主动脉前端剪开，并用钝头镊子轻轻夹住其末端。然后通过钝性分离将主动脉从其后方的脊柱分离。使用双极电凝器仔细结扎主动脉的所有分支动脉，并用剪刀从结扎端切断。使用5毫升注射器，以含有100单位肝素的3毫升生理盐水冲洗主动脉管腔。为防止血栓形成，在主动脉分出肾动脉之前将其后端切断。在整个操作过程中，保持主动脉的完整性至关重要。接下来，用五毫升的0.075冲洗主动脉管腔。将十二烷基硫酸钠（SDS）溶液用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使升主动脉在含有0.075% SDS的溶液中浸泡，置于直径10厘米的培养皿内，在室温下以150 RPM的转速于摇床上振荡处理2小时。随后用5毫升PBS冲洗主动脉管腔。接下来，将主动脉置于PBS中，放入直径10厘米的培养皿，于摇床上以150 RPM的转速在室温下振荡2小时。两小时后每20分钟更换一次PBS。用5毫升PBS冲洗主动脉管腔。首先，按照文本方案中所述组装生物反应器流动回路。接下来，在室温下，将脱细胞血管置于含有分化培养基的10厘米培养皿中，于旋转摇床以50 RPM转速孵育1小时，用培养基重新水化脱细胞血管。在显微镜下，将一段长1厘米的尼龙管插入脱细胞血管的两端。然后用8-0丝线将血管与尼龙管结扎固定。通过将尼龙管与培养室壁上的入口和出口端口连接，将脱细胞主动脉移植物组装到孵育室中。每次孵育室中维持加入五毫升培养基。接下来，向预热的胰蛋白酶中加入PIPS细胞进行消化。盖上培养皿，轻轻晃动培养皿10次。弃去液体，将培养皿置于培养箱中孵育2至3分钟。然后向培养皿中加入预热的培养基，混匀培养基与细胞。接下来，使用血细胞计数板离心机计数细胞数量。取两份细胞悬液，每份含五十万个细胞，在300 × g条件下离心五分钟。上清液弃去后，将其中一份PIPS细胞沉淀充分重悬于50 µL的DM中，然后将细胞悬液注入脱细胞血管管腔内。然后，用100微升Matrigel重悬另一份PIPS细胞沉淀。小心地将混合物滴加到脱细胞主动脉移植物上。静置10至15分钟，直至混合物转变为凝胶状，并均匀包裹在血管的外表面。此时，用 dm 构建孵育室。将整个生物反应器装置置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。然后将连接培养基储液罐与顺应性室之间的管路放置在蠕动泵上。在培养箱中。将脱细胞移植物在静置培养12小时后，于前两小时内每半小时手动绕纵轴旋转90度，以使细胞均匀分布，并通过蠕动泵以管腔灌注方式输送DM，诱导平滑肌细胞分化。初始流速设为每分钟5毫升。在将循环培养基流速保持在每分钟20毫升持续24小时后，随后在接下来的24小时内每分钟逐步增加20毫升，停止培养基流动，并将生物反应器从培养箱中取出。接下来，通过胰蛋白酶消化计数并离心，使用100万个人诱导多能干细胞（PIPS细胞）重新填充移植物管腔。同前，将细胞重悬于50微升内皮细胞生长培养基中。两个含有50纳克/毫升血管内皮生长因子的培养基。然后将细胞混合物注入移植物的管腔内。更换培养室和整个循环系统中的培养基为含VEGF的EGM-2，以诱导内皮细胞分化。将生物反应器放回培养箱后，在最初的两小时内每半小时手动将移植物旋转90度，随后保持静态培养12小时。12小时后，从5毫升/分钟开始启动循环流动，逐步增加流速至35毫升/分钟，然后维持35毫升/分钟的流速持续5天。之后通过切割尼龙管两端，明显获得工程化移植物。将移植物置于含有新鲜 e GM 两种培养基的培养皿中，为受体小鼠麻醉后移植做准备。将小鼠固定于仰卧位，颈部剃毛并伸展。在解剖显微镜下（放大5至10倍），从小鼠下颌至胸骨处沿中线做切口。将右侧颌下腺向外侧抬起，并移除右侧滑翔肌乳突肌。为暴露右侧颈总动脉，轻柔地去除附着组织，从远端向近端游离右侧颈总动脉。用8-0丝线在颈总动脉中段结扎两次，并在两结扎线之间进行分离。将由可高压灭菌尼龙管制成的套管分别穿过每条血管。用微型止血钳夹住两端并固定。然后松开一端的结扎线，立即滴加一滴肝素。将动脉远端翻转，覆盖整个套管主体，并用8-0丝线将翻转的血管固定在套管上。对动脉的另一部分重复相同操作后，用生理盐水冲洗动脉以清除血栓。接下来，将去细胞化血管移植物植入颈动脉的两个断端之间，将去细胞化血管的两端套入动脉套管，并用8-0丝线缝合固定。在评估移植物搏动之前，先移除两端的血管夹，然后将右侧颌下腺复位至其原始位置。使用6-0普罗灵缝线以间断缝合方式闭合手术部位的皮肤。术后护理请参照文中代表性实验方案进行。此处展示了人成纤维细胞经四天重编程为PIPS细胞后的形态。PIPS 细胞与成纤维细胞相比表现出显著不同的表型。正如预期，通过 SDS 处理两小时可完全实现主动脉脱细胞。因此，与新鲜获取的主动脉相比，脱细胞后的主动脉呈现出半透明的无细胞支架结构。在脱细胞主动脉内进行PIPS细胞双相接种后，所构建的组织工程血管移植物表现出内皮细胞和平滑肌细胞的特性，这与脱细胞血管移植物不同。此处通过内皮细胞的绿色染色和平滑肌细胞的红色染色得以可视化。移植PIPS细胞血管移植物的小鼠在术后三周的存活率达到60%，符合预期。移植脱细胞血管的小鼠在术后第1天即表现出显著升高的死亡率。该技术为心脏病学领域的研究人员探索利用PIPS细胞与脱细胞血管移植物构建功能性组织工程血管通路铺平了道路。在观看本视频后，希望您能够充分理解如何制备脱细胞血管移植物、如何组装生物反应器，以及如何将再细胞化的移植物重新植入小鼠体内。

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