Name: 马赛克斑马鱼转基因的候选基因合作在肿瘤发病机制的功能基因组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解利用马赛克瞬时转基因斑马鱼模型进行癌症功能基因组学研究的方法。该技术可快速分析ALK与MYCN基因在神经母细胞瘤发病机制中的协同作用，为肿瘤基因研究提供高效、经济的体内研究平台。

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我们感谢李政洙博士（Dr. Jeong-Soo Lee）与我们分享Tg(dbh:EGFP-MYCN)转基因鱼，用于本研究。本工作获得了美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）基金1K99CA178189-01、Pablove基金会与Friends for Life提供的博士后奖学金，以及Alex's Lemonade Stand基金会和儿童癌症治愈研究基金会（CureSearch for Children's Cancer Foundation）颁发的青年研究者奖的支持。

注意：所有斑马鱼研究及动物饲养均依照梅奥诊所研究所经 IACUC 批准的方案 # A41213 进行。
1. 转基因用DNA构建体
<ol>
	<li>使用 CH211-270H11 BAC 克隆（来自 BACPAC 资源中心 (BPRC)）作为 DNA 模板，通过适当的长片段高保真 PCR 系统扩增一段 5.2-kb 的多巴胺β羟化酶（dβh）启动子区域8。PCR 程序如下：94 °C 预变性 2 分钟；进行 10 个循环（94 °C 15 秒，50 °C 30 秒，68 °C 8 分钟）；随后进行 30 个循环（94 °C 15 秒，53 °C 30 秒，68 °C 8 分钟）；最后 68 °C 延伸 4 分钟（上游引物序列为 5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3’，下游引物序列为 5’- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3’）。</li>
	<li>使用商业化的重组克隆系统（如多片段 Gateway 系统）构建 dβh-pDONRP4-P1R 入门克隆8。将 1 μl 纯化的 dβh PCR 产物（172 ng/μl）、1 μl（150 ng/μl）pDONRP4-P1R 供体质粒（与其他 Gateway 载体均由犹他大学 Chi-Bin Chien 博士惠赠）、4 μl TE 缓冲液（pH 8.0）与 2 µl BP Clonase 酶混合物混合，在 25 °C 孵育 1 小时，然后按照制造商说明书转化至 One Shot TOP10 感受态 E. coli 中。</li>
	<li>使用步骤 1.2 中所述的重组克隆系统构建 dβh:EGFP-MYCN 转基因载体8。将各 1 μl 的入门克隆（150 ng/μl）混合，包括含 5.2-kb dβh 启动子的 dβh-pDONR P4-P1R 构建体、无终止密码子的 EGFP（pME-EGFP 构建体）以及人源 MYCN cDNA（由宾夕法尼亚儿童医院 Hogarty 博士惠赠，即 MYCN-pDONRP2R-P3 构建体），再加入 1 μl（150 ng/μl）含有侧翼 I-SceI 识别位点的修饰型目的载体（由德国卡尔斯鲁厄理工学院 C. Grabher 博士惠赠）、4 μl TE 缓冲液（pH 8.0）以及 2 µl LR Clonase 酶混合物，在 25 °C 孵育 1 小时，随后按照制造商说明书转化至化学感受态 E. coli（如 One Shot Top 10）中。</li>
	<li>通过在室温下使用 NotI 和 SalI 限制性内切酶对 PNP-mitf 载体（由华盛顿大学 D. Raible 博士惠赠）消化 2 小时，构建 mitf:mitf 转基因载体8，并将释放出的 2.65-kb DNA 片段（包含 mitf 启动子及斑马鱼 mitf 基因编码序列）利用 T4 DNA 连接酶按照说明书亚克隆至含有侧翼 I-SceI 识别位点的修饰型 pBluescript 载体（由波士顿大学 Hui Feng 博士惠赠）的 NotI 和 MluI 位点中。 
	注：为提高获得稳定表达 MYCN 转基因品系的效率，将 dβh:EGFP-MYCN 与 mitf:mitf DNA 构建体共注射至单细胞期 nacre 胚胎中。nacre 是一种在发育过程中缺乏神经嵴来源黑色素细胞的突变型斑马鱼36。因此，注射胚胎中色素细胞的出现表明 mitf:mitf DNA 构建体已整合入基因组。已有研究表明，两个或三个共注射的 DNA 构建体可同时整合至鱼类基因组中31。因此，由 mitf 表达引起的色素沉着可作为 dβh:EGFP-MYCN 转基因整合的标记，有助于更便捷地鉴定稳定的 MYCN 转基因品系。</li>
	<li>将 dβh:EGFP-MYCN 与 mitf:mitf DNA 构建体以 3:1 的比例混合，总体积为 15 μl 的反应体系中加入 1 μl I-SceI 酶和 0.75 μl 缓冲液。确保反应体系中总 DNA 量不超过 750 ng。</li>
	<li>在室温下进行 I-SceI 酶切反应&#160;4 小时或过夜。第二天，I-SceI 酶切后的 DNA 即可用于显微注射，或可储存于 -20 °C 以备后续使用。将 I-SceI 酶分装成小份并保存于 -80 °C，以维持其酶活性。</li>
	<li>使用 T4 DNA 连接酶按照说明书，将人源 ALKF1174L 和野生型 ALK 基因从 PCDNA3 载体（由达纳-法伯癌症研究所 George 博士惠赠）7 中亚克隆至 pENTRY1A 载体（由德国卡尔斯鲁厄理工学院 C. Grabher 博士惠赠）的 EcoRI 和 NotI 位点中。</li>
	<li>使用如协议 1.2 所述的重组克隆系统构建 dβh:ALKF1174L 或 dβh:ALKWT 转基因载体。简要而言，将三个入门克隆 dβh-pDONRP4-P1R、ALKF1174L-pENTRY1A（或 ALKWT-pENTRY1A）以及 p3E-polyA，与含有 I-SceI 识别位点的修饰型目的载体（由德国卡尔斯鲁厄理工学院 C. Grabher 博士惠赠）通过 LR Clonase 酶混合物按照制造商说明书进行重组反应。</li>
	<li>将 dβh: ALKF1174L（或 dβh:ALKWT）与 dβh:mCherry DNA 构建体以 3:1 的比例混合，并按照协议 1.5–1.6 所述方法使用 I-SceI 酶进行线性化处理。</li>
</ol>
2. 显微注射
<ol>
	<li>所有注射均使用直径为 1.0 mm 的玻璃微量移液管37。注射前用剃刀片将玻璃微量移液管的尖端折断。通过将 H2O 注射到一滴矿物油中来校准注射体积。测量所形成液滴的直径，并调整显微注射仪（压力或压力脉冲持续时间），以确保注射体积小于单细胞期胚胎总体积的 10%。</li>
	<li>为提高转基因效率，在注射前立即向含有 DNA 构建体的 5 μl 注射液中额外加入 0.5 μl 新鲜的 I-SceI 酶（5 单位/μl）38。将 50–80 pg 线性化的 DNA 构建体注入单细胞期胚胎的细胞质中。为确保注射成功，可将样品与 0.25% 酚红混合以便观察。若细胞在注射后变为红色，表明显微注射成功。为确保获得较高比例的转基因鱼，我们通常注射多达 500 个胚胎。</li>
	<li>为获得稳定表达 MYCN 的转基因鱼，需在单细胞期将线性化的 dβh:EGFP-MYCN 和 mitf:mitf DNA 构建体（按 3:1 比例）共注射至色素突变体 nacre 斑马鱼的胚胎中。Mitf 的表达可作为转基因构建体整合入鱼类基因组的报告标志。</li>
	<li>为在野生型或 MYCN 转基因胚胎中实现 ALK 的嵌合过表达，需将线性化的 dβh:ALK F1174L（或 dβh:ALKWT）与 dβh:mCherry DNA 构建体（按 3:1 比例）共注射至 F1 代杂合 Tg(dβh:EGFP-MYCN) 转基因鱼与野生型 AB 鱼杂交所得的单细胞胚胎中。因此，子代中约一半为携带 MCYN 的转基因个体，另一半为野生型。</li>
</ol>
3. 筛选稳定或嵌合型转基因鱼
<ol>
	<li>提高稳定株鉴定的效率 MYCN表达株系，主要注射后麻醉 珍珠层 在受精后第3至5天使用三卡因（0.02%）处理胚胎，并筛选色素沉着。将具有色素沉着的胚胎转移至含新鲜卵水的新培养皿中，培育至性成熟，以进一步筛选携带目标突变的创始人鱼（founder fish）。 dβh:EGFP-MYCN 生殖细胞中的转基因</li>
	<li>为了鉴定具有种系传递的创始个体 EGFP-MYCN, 将有色F0代成年鱼与野生型AB鱼杂交，并在受精后1-2天筛选EGFP阳性胚胎，用于进一步基因分型。&#160;将单个EGFP阳性的F1胚胎放入PCR管中，并移除所有液体。加入50 μl基因组DNA提取缓冲液，其中包含12.5 μl 4x裂解缓冲液和35 μl H2向单个胚胎中加入 O 和 2.5 μl 蛋白酶 K（10 mg/ml）。在 55 °C 下孵育反应 2–3 小时，随后在 98 °C 孵育 10 分钟以灭活蛋白酶 K。配制 50 ml 4x 裂解缓冲液：将 500 μl 1 M Tris（pH 8.4）和 2.5 ml 1 M KCl 加入 47 ml H₂O 中2O.&#160;注意：F0 之后&#160;MYCN 稳定转基因鱼与野生型 AB 鱼杂交，所有子代均具有色素。因此，色素沉着不能作为鉴定的标记&#160;MYCN-阳性鱼。尽管在&#160;MYCN&#160;转基因鱼中，EGFP-MYCN 融合蛋白在周围交感神经系统（PSNS）中表达，包括颈上神经节和交感链中连续节段性神经节的交感神经元，以及非 PSNS 的多巴胺能神经元，如延髓和颅神经节&#160;8因此，表达的&#160;EGFP&#160;可作为鉴定的标志物&#160;MYCN&#160;稳定转基因胚胎。</li>
	<li>使用从有色F1胚胎中提取的2 μl基因组DNA作为模板，以及引物 MYCN-test F1：5’-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3’； MYCN-R3：5’-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3’，并使用GC-RICH PCR系统进行如下程序：95 °C 3分钟，1个循环；随后95 °C 30秒、58 °C 30秒、72 °C 3分钟，共25个循环。我们通常对单次交配产生的14–16个有色胚胎进行基因分型，以确认整合序列的存在 MYCN 色素胚胎中的转基因，超过6条过表达的创始鱼 mitf 和 MYCN 通过该方法鉴定出。</li>
	<li>将剩余的EGFP阳性F1胚胎继续培养至2-3月龄，取鳍组织并按照上述方案进行基因型鉴定，以进一步确认外源基因的整合情况 MYCN 将转基因导入鱼类。将F1代MYCN稳定转基因鱼与野生型AB鱼杂交。共注射线性化的 dβh:ALK F1174L 或 dβh:ALKWT）与&#160;dβh:mCherry 将DNA构建体导入单细胞胚胎，具体步骤见方案2.4。</li>
	<li>排序 MYCN在2.4节所述实验中，使用体视荧光显微镜观察表达胚胎，并在受精后第1至3天筛选初次注射的胚胎中目标基因的表达情况 EGFP-MYCN 在PSNS中。随后，在受精后的第2至5天，用三卡因（0.02%）麻醉胚胎，并分选那些 MYCN-根据表达情况再次区分阳性或阴性胚胎 mCherry 在PSNS中使用体视荧光显微镜观察。表达的 mCherry 作为共表达的标记 ALK 在嵌合体初代注射动物的组织中。 
	注意：将MYCN稳定转基因鱼与野生型鱼杂交所得的约600条子代鱼，每组分别注射线性化DNA载体，包括 dβh:ALK F1174L 和 dβh:mCherry, dβh:ALKWT 和 dβh:mCherry，或 dβh:mCherry 分别单独观察。在显微注射的鱼中，70%–90% 可观察到 mCherry 的嵌合表达。有半数至三分之一的显微注射鱼可存活至幼体阶段，用于肿瘤观察。</li>
	<li>抬高所有 mCherry+MYCN+ 和 mCherry+MYCN- 根据《斑马鱼手册》中的标准方案处理胚胎 39 并在受精后5周开始监测肿瘤的发生。</li>
</ol>
4. 镶嵌型转基因鱼中的肿瘤监测
<ol>
	<li>监测 mCherry-从受精后5周开始，每2周对注射成功的鱼进行一次检查，以观察肿瘤发生情况。</li>
	<li>用三卡因（0.02%）麻醉鱼类，并筛选是否存在 mCherry- 和 EGFP在配备数字成像系统DS-U1相机的尼康SMZ-1500体视荧光显微镜下观察PSNS中表达的肿瘤。</li>
	<li>为了确认肿瘤是否表达 ALK 转基因，分离出 mCherry 和 EGFP 阳性的细胞团块 ALK 基因分型PCR</li>
	<li>使用 PCR，以以下引物扩增从已形成的肿瘤中提取的基因组 DNA： ALK P7：5’-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3’ 和 ALK P18：5’-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3’，以及以下PCR反应：94 °C 5分钟，1个循环；94 °C 30秒、55 °C 30秒、72 °C 60秒，30个循环。然后对PCR产物进行测序 ALK P7引物以进一步确认突变型或野生型的存在 ALK 在mCherry阳性肿瘤中。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在此项代表性研究中，我们采用瞬时共注射的方法，在表达MYCN的转基因鱼中共同表达活化的ALK基因与mCherry报告基因，结果显示这两个基因协同作用可显著加速神经母细胞瘤的发生，这与我们此前在稳定双转基因鱼（同时表达活化ALK和MYCN）中所观察到的结果一致8。这种嵌合型转基因方法相较于传统方法具有多项显著优势。最重要的是，它能够在主要注射个体（F0代）中快速评估候选癌基因共表达的效应，而无需构建稳定的转基因品系，从而避免了培育和鉴定表达ALK的稳定转基因鱼所需耗费的大量时间和人力。我们还进一步研究了野生型ALK过表达（无论是否同时过表达MYCN）对肿瘤起始的影响。结果表明，在本研究的鱼类模型中，仅瞬时过表达野生型ALK不足以启动神经母细胞瘤的发生，无论MYCN癌基因的表达状态如何。未来值得进一步探索的是，在野生型鱼类中瞬时共表达活化ALK和MYCN是否可在主要注射个体中诱导更早的肿瘤发生。该实验设计将...

癌症是随着时间推移，由病理性的基因突变、缺失以及染色体获得不断累积而引发的进行性疾病。这些遗传异常可影响多种细胞过程，从细胞周期、细胞死亡、能量代谢和细胞骨架组装，到缺氧等应激反应。因此，肿瘤发生反映了多种遗传畸变在一系列生物学过程中共同作用的结果。近年来，整合基因组学研究工作，包括全基因组测序、外显子组测序、靶向测序、深度测序和全基因组关联研究，已在几乎所有类型的肿瘤中鉴定出越来越多的新型遗传改变。 1-4在许多情况下，这些基因损伤会以非随机的方式共同出现 5-8，提示它们在疾病发病机制中的协同作用。解析这些基因组病变导致的大量异常表达基因的致癌作用，对于制定新的治疗策略以及理解肿瘤细胞对这些药物的反应至关重要，但这一任务极具挑战性，需要非常稳健的动物模型系统来开展高通量功能基因组学分析。 体内.
尽管哺乳动物，尤其是啮齿类动物，一直是癌症生物学研究中的首选模型，斑马鱼近年来也开始受到广泛关注。这种辐鳍鱼类斑马鱼（Dario rerio自20世纪60年代以来，) 一直被用作发育研究的模式生物，并于1982年首次应用于肿瘤发病机制的研究 9-11维护简便、体型小、繁殖力高，使斑马鱼成为适用于大规模正向遗传筛选的有力模型，可用于鉴定导致异常及病理表型的突变 10斑马鱼胚胎的光学透明性是支持该癌症模型更广泛应用的另一关键特征，因为它允许 体内 进行成像以实时定位肿瘤发展 9，这一应用在啮齿类动物中相对较难实现 12最近对斑马鱼参考基因组（Zv9）的比较基因组学分析揭示了26,206个蛋白质编码基因，其中71%具有人类直系同源基因，而这些直系同源基因中有82%与在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）中的疾病相关基因相关联 13,14因此，斑马鱼已被用于模拟多种人类癌症，包括神经母细胞瘤 8T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL） 15,16黑色素瘤 17,18，尤文肉瘤 19横纹肌肉瘤 20,21，胰腺癌 22肝细胞癌 23 髓系恶性肿瘤 24,25，并被选为异种移植研究的癌症模型 11,26.
在斑马鱼中建立稳定的转基因方法常用于研究基因功能获得效应对正常发育或疾病发病机制的影响27,28。为构建此类模型（图1A），需将包含目的基因且由组织特异性启动子驱动的DNA构建体显微注射至单细胞期野生型胚胎中。注射后三至四个月，当注射胚胎达到性成熟时，将其与野生型斑马鱼进行杂交，以筛选出其生殖系中整合了DNA构建体的个体，这类个体即被认定为创始人鱼（founder fish）。多个因素（如转基因的拷贝数和整合位点）会影响稳定转基因品系中转基因的表达水平。因此，为建立转基因肿瘤模型，需首先构建多个单一癌基因过表达的稳定转基因品系，并筛选其中转基因表达水平足以诱导肿瘤形成的品系。然而，若候选癌基因的过表达对生殖细胞具有毒性，则直接过表达该转基因将难以获得稳定的转基因品系29。因此，该方法耗时较长，且存在较高失败风险，难以成功构建合适的癌症模型。
本文展示了一种基于嵌合型瞬时转基因技术的替代策略（图1B），该方法在体内功能基因组学研究中相较于传统的稳定转基因技术具有独特优势。in vivo。在此方法中，将一个或多个转基因构建体注射到转基因或野生型胚胎的单细胞阶段。含有转基因的注射DNA构建体会以随机且嵌合的方式整合到被注射的首代鱼（F0）中，导致单条鱼体内多个细胞群体具有混合的基因型30。此外，在单细胞胚胎中共注射多个DNA构建体，可使这些构建体随机共整合至同一细胞的不同位点，从而能够追踪表达转基因的细胞，并在嵌合动物中探究不同基因在疾病发病过程中的相互作用31。作为原理验证，我们在野生型鱼及过表达MYCN的转基因鱼中，利用多巴胺β羟化酶（dβh）启动子驱动，在外周交感神经系统（PSNS）中瞬时过表达了突变激活型ALK（F1174L）及其与mCherry报告基因的融合序列。ALK编码一种受体酪氨酸激酶，是高危神经母细胞瘤中最常发生突变的基因5-7,32,33。其中，ALK（F1174L）是最常见且最具活性的体细胞激活突变之一，在伴有MYCN扩增的高危神经母细胞瘤患者中尤为多见，并可与MYCN的过表达产生协同效应，在稳定的转基因小鼠和转基因斑马鱼模型中均能加速神经母细胞瘤的肿瘤发生8,34,35。通过在MYCN转基因斑马鱼中进行ALK（F1174L）与mCherry的嵌合瞬时过表达，我们重现了在同时过表达ALK（F1174L）和MYCN的稳定转基因鱼中所观察到的肿瘤发生时间提前现象，表明嵌合转基因策略可用于在体内快速、高效地评估多个癌基因在肿瘤起始过程中各自的贡献。

<table><tbody><tr><td>扩增长片段PCR系统&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO载体&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II酶&lt;br/&gt;混合物</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II酶混合物</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC富集PCR系统&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>巨核酸酶I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500体视荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon数字成像DS-U1相机</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于肿瘤发病机制中候选协同基因功能基因组学分析的嵌合体斑马鱼转基因技术

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

全面的基因组分析在多种癌症中发现了数量惊人的遗传改变。在这些肿瘤中稳健且高效地识别致癌“驱动因子”，并明确它们在肿瘤发生过程中与伴随遗传改变之间的复杂关系，仍是一项艰巨的任务。近年来，斑马鱼已成为研究人类疾病的重要动物模型，主要得益于其易于饲养、繁殖力高以及在遗传操作和胚胎观察方面的显著优势。 体内 成像、癌基因及其分子通路的高度保守性、对肿瘤发生的易感性，以及最重要的，适用于鱼类的转基因技术的可及性。转基因斑马鱼癌症模型已被广泛用于解析多种肿瘤类型中的致癌通路。然而，构建稳定的转基因鱼模型既繁琐又耗时，而利用该方法研究多个基因在疾病发病机制中的协同作用则更加困难且耗时，因其需要构建多个分别过表达目标基因的转基因品系，随后进行这些稳定转基因品系之间复杂的杂交育种。因此，在斑马鱼中采用嵌合型瞬时转基因方法为功能基因组学分析提供了独特优势 体内简而言之，可将候选转基因共同注射到单细胞期的野生型或转基因斑马鱼胚胎中，使其以嵌合模式整合至各个体细胞，导致同一主要注射个体中出现混合基因型。这种方法可更快速、更经济地研究候选基因是否以及如何协同作用以驱动肿瘤发生。通过瞬时过表达激活的 ALK 在过表达的转基因鱼中 MYCN我们在此展示了这两个癌基因在一种对大多数现代治疗方法具有抵抗性的儿童癌症——神经母细胞瘤发病机制中的协同作用。

为了研究突变激活的ALKF1174L或野生型ALK的过表达是否能与MYCN协同诱导神经母细胞瘤，我们在过表达MYCN的转基因鱼中，利用dβh启动子在周围交感神经系统（PSNS）中过表达激活的人源ALK或野生型人源ALK。将以下任一构建体dβh-ALKF1174L或dβh-ALKWT与dβh-mCherry共同注射到单细胞期的野生型或MYCN转基因胚胎中（图2A）8。mCherry的表达用作嵌合型初级注射动物组织中ALK共表达的标记物。所有预期基因型均在注射后的鱼类中得到体现：（1）表达MYCN且嵌合共表达激活型ALKF1174L和mCherry的鱼，命名为MYCN;mosaic ALKmut；（2）表达...

本研究的目的是展示如何在斑马鱼中利用嵌合体转基因策略，快速高效地在活体（in vivo）条件下评估多种癌基因在肿瘤起始和进展过程中的相对作用。

全面的基因组分析在多种癌症中发现了数量惊人的遗传改变。为了稳健且高效地……

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-functional-genomic-analysis

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发育生物学

马赛克斑马鱼转基因的候选基因合作在肿瘤发病机制的功能基因组分析

我们展示了如何从发育调控基因中寻找潜在的增强子元件，并通过嵌合型斑马鱼转基因技术评估其功能。...

用于评估增强子序列的嵌合体斑马鱼转基因技术

本视频介绍了一种利用转基因斑马鱼肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因的方法。当注射黑色素瘤诱导型miniCoopR载体后，斑马鱼会发展出黑色素瘤，因此可用于研究影响斑马鱼肿瘤发育的遗传因素。...

基于miniCoopR载体的转基因技术：一种在斑马鱼肿瘤模型中筛选黑色素瘤诱导基因的方法

介绍了一种利用斑马鱼原位肿瘤模型快速筛选黑色素瘤调控因子的方法。该方法利用miniCoopR载体，可在黑色素细胞中表达候选黑色素瘤基因。文中描述了获取无黑色素瘤生存曲线的方法、侵袭实验、鳞片黑色素细胞的抗体染色方案以及黑色素瘤移植实验。...

使用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因

本文介绍了一种将斑马鱼骨骼肌及胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）细胞移植到成年免疫缺陷的 rag2E450fs...

正常与恶性肌肉细胞移植入免疫缺陷的成年斑马鱼

癌症细胞移植是研究癌症机制和治疗反应的重要工具。目前的技术依赖于免疫缺陷型动物。本文介绍一种将斑马鱼肿瘤细胞移植到免疫健全胚胎中的方法，用于长期分析肿瘤细胞行为 体内...

将斑马鱼儿童脑肿瘤移植到免疫健全宿主中以长期研究肿瘤细胞行为和药物反应

在此，我们展示了构建细胞电位报告斑马鱼品系的过程，以可视化胚胎发育、运动及斑马鱼肿瘤细胞 体内.

斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

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本文介绍了在神经母细胞瘤的斑马鱼模型中实时开发、表征和追踪肿瘤转移的方法，特别是针对MYCN和LMO1过表达的转基因斑马鱼品系，该品系可自发产生转移。...

神经母细胞瘤转移的斑马鱼模型

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。...

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

了解利用马赛克瞬时转基因斑马鱼模型进行癌症功能基因组学研究的方法。该技术可快速分析ALK与MYCN基因在神经母细胞瘤发病机制中的协同作用，为肿瘤基因研究提供高效、经济的体内研究平台。

用于肿瘤发病机制中候选协同基因功能基因组学分析的嵌合体斑马鱼转基因技术

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