高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂
2015年3月3日
在这里，我们将基于细胞的报告基因测定描述为一种有价值的工具，用于筛选化学文库以查找通过 3' UTR 施加的调节转录后控制机制的化合物。
本实验筛选了化学文库，以查找通过转录本的三个主要非翻译区调节转录后控制机制的化合物。首先，确定目标基因中的三个主要未翻译目标区域。将这三个引物 UTR 克隆到 El 荧光素酶对照报告质粒中，以产生 El 荧光素酶三个引物 UTR 嵌合转录本。
然后稳定地。将两种质粒整合到疾病相关细胞系中，接种携带嵌合转录物的细胞 96。孔板用化合物库处理它们 24 小时，然后鉴定影响荧光素酶活性的分子。
挑选选定的分子进行进一步的验证筛选，然后，用挑选的文库子集处理对照细胞和携带荧光素酶三种引物 UTR 嵌合转录物的细胞。结果将区分化合物的作用是通过三个主要非翻译区还是通过其他载体序列介导的。与大多数基于记者的筛选论文不同。
这些检测侧重于转录调控，这些报告基于细胞的检测侧重于鉴定通过三个引物区和翻译区调节 mRNA 转录水平的化合物。通过胰蛋白酶 Asian 收获稳定转染的神经母细胞瘤细胞。将细胞稀释至每毫升 10 至 5 个细胞的 2 倍浓度。
在含有 10% FBS 和 1%L-谷氨酰胺的 RPMI 中，用于 27 块板。准备至少 250 毫升的细胞悬液，同时考虑液体处理、槽死体积和重复的移液步骤。然后将细胞悬液倒入无菌储液槽中，并将其放在机器人桌面上。
装九个带条形码的白色平。机器人台上底部 96 孔板和一盒 200 微升无菌移液器吸头。混合细胞悬液，然后将 75 μL 细胞分配到 9 个板的每个孔中。
盖上板，让细胞沉淀到孔底 30 分钟，以尽量减少边缘效应。然后将所有 9 个板置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下，孵育 24 小时。同样，一次处理剩余的 9 个板。
在室温下解冻化合物库板。用无菌 PBS 填充一个槽，用 PBS 溶液中的 0.5% DMSO 填充另一个槽，然后将它们放在机器人桌面上。对于每个库板。
相应地准备和标记。一个稀释板。现在用 398 微升无菌 PBS 填充每个柱孔、2 到 11 个稀释板。
然后用 50 微升 0.5% DMSO 的无菌 PBS 填充第 1 列和第 12 列。接下来加载两个稀释板。机器人台上有两个文库板、两盒 50 μL 无菌吸头和 6 个细胞板。
现在揭开细胞板，从相应稀释板中的两个文库板之一中吸取两微升 10 毫摩尔储备溶液并充分混合。使用同一套提示。将 3 μL 的 50 μmol 稀释液转移到三个带条形码的白色 96 孔板中，该板含有细胞。
更换全套吸头并重复第二个文库板的细胞诱导。覆盖培养物并孵育 24 小时。然后对剩余的文库板重复化合物稀释和细胞诱导过程。
将所选的复溶荧光素酶试剂平衡至室温。将荧光素酶储液槽放在机器人桌面上，并将试剂倒入其中。从培养箱中取出 9 板诱导培养物。
将它们放在机器人桌面上，揭开盖子并平衡至室温。然后在板之间每孔加入 50 μL 荧光素酶试剂。引入等于一个板的发光读数时间的延迟。
孵育 30 分钟后。首先记录印版的条形码，以便将其与相应的数据文件相关联。接下来，将第一块板放入光度计中并测量发光。
短暂的摇动步骤后，重复所有诱导板的发光读数。然后收集剩余的 Lucifer race 试剂并储存在负 20 摄氏度。处理完初步筛选的实验数据后，选择命中以通过反筛选樱桃确认化合物特异性。
选取选定的命中并为新的屏蔽板创建布局，包括控件的位置。然后从储存在单个 2D 条形码管中的等分试样中，创建新的 HIIT 板。遵循相同的方案进行筛选。
每个 hi 板准备 3 个 96 孔板，每种稳定细胞系。第二天，用文库化合物处理细胞。使用每个 hi 板在 24 小时内处理 3 块 CHP 1 34 micken 板、3 块初免 UTR 板和 3 块带有 2 微摩尔工作浓度的对照细胞板。
测量所有 CHP 1 34 板、三个引物未翻译组和对照组中的荧光素酶活性。与初步筛选中的数据分析一样，将处理孔的实验数据标准化为平板载体处理对照的平均值。然后计算每个测试化合物计算的重复的平均值和标准差。
CHP 1 34 McIn 三引物 UTR 与 CHP 1 34 中荧光素酶活性的倍数变化。对照单元格选择大于 1.5 的任意完全变化中断值和小于 0.01 的显著性 P 值。本实验筛选了一个 2000 个化合物库，以查找通过 mic 和癌基因的三个主要 UTR 施加的转录后控制机制的潜在调节剂，25 个代表性文库中单个板的荧光素酶信号结果显示为处理载体的百分比。
对照表明，大多数化合物对三种主要 UTR 没有明显影响。选择命中，其中计算了所有测定值的平均值和标准偏差，化合物将荧光素酶活性降低到 20% 以下很可能表明化合物具有明显的细胞毒性。该图显示了四种选定化合物（命名为 WX、Y 和 Z）的反筛选结果的代表性结果，化合物 W 和 X 都导致癌基因三个主要 UTR 报告基因的荧光素酶表达增加，如倍数变化差异和 T 检验所示请注意，虽然化合物 W 和 X 的作用确实依赖于三个主要 UTR，但化合物 W 对细胞活力没有显着影响。
虽然化合物 X 在 CHP 1 34 对照细胞中显示出一些细胞毒活性，如正常化荧光素酶信号所示，但化合物 Y 和化合物 Z 在 2 微摩尔浓度下均未显示出对荧光素酶水平的 A 三主要 UTR 依赖性效应。用化合物 Y 处理后在初步筛选中检测到的荧光素酶活性降低是细胞毒性的结果。在化合物 Z 的情况下，荧光素酶活性的增加是由于病毒启动子的三个主要 UTR 激活的非特异性。
由于在对照和非翻译组中都观察到等效的上调，因此请记住，验证对照细胞中的初级热对于区分真正通过三个主要非翻译区起作用的化合物与通过启动子起作用的化合物至关重要。
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概述
本文介绍了一种基于细胞的报告基因测定，旨在筛选化学库中通过转录本的3’非翻译区（UTR）调节后转录控制机制的化合物。该方法涉及将3’ UTR克隆到荧光素酶控制报告基因质粒中，并将其整合到相关的细胞系中。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 基因表达
- 药理学
背景
- 后转录控制机制在基因调节中起着至关重要的作用。
- 3’ UTR是影响mRNA稳定性和翻译的关键区域。
- 筛选化学库可以识别影响这些机制的新型化合物。
- 报告基因测定是研究基因调节的有价值工具。
研究目的
- 开发一种用于筛选影响后转录调节的化合物的稳健测定。
- 利用3’ UTR作为调节基因表达的目标。
- 增强对化学物质对基因调节影响的理解。
使用的方法
- 确定目标基因中感兴趣的3’ UTR。
- 将3’ UTR克隆到荧光素酶控制报告基因质粒中。
- 将质粒稳定整合到疾病相关的细胞系中。
- 将细胞接种在96孔板中，并用化合物库进行处理。
主要结果
- 确定显著影响荧光素酶活性的化合物。
- 证明测定在筛选化学库中的有效性。
- 对后转录控制机制调节的洞察。
- 在药物发现和基因调节研究中的潜在应用。
结论
- 开发的测定是筛选化合物的有价值工具。
- 它提供了关于3’ UTR在基因调节中作用的洞察。
- 这种方法可以促进新的治疗剂的发现。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in early drug discovery by enabling the identification of compounds that modulate gene expression through post-transcriptional mechanisms, a regulatory layer often overlooked in transcriptional-focused screens. By linking 3’ UTR activity to luciferase readouts in disease-relevant cells, it provides a mechanistic de-risking step for target validation, helping prioritize compounds with specific modes of action before downstream investment. The approach supports predictive confidence in lead identification by distinguishing UTR-mediated effects from promoter-driven or cytotoxic artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving post-transcriptional regulation by linking 3’ UTR activity to compound treatment.
- Operational Value: Uses a luciferase reporter system to quantitatively assess mRNA fate modulation via the 3’ UTR in a stable, disease-relevant cellular context.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating compounds that specifically affect mRNA stability or translation through defined UTR sequences.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces normalized luminescence readouts that enable dose-dependent assessment of compound effects on 3’ UTR-mediated gene regulation.
- Operational Value: Employs a counter-screening strategy to discriminate true 3’ UTR modulators from compounds acting via promoter elements or general cytotoxicity.
- Scientific Value: Generates fold-change and statistical thresholds (e.g., >1.5 fold change, p<0.01) to define hit criteria for follow-up validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant cell lines (e.g., neuroblastoma) to ensure biological context aligns with pathophysiological mechanisms of interest.
- Operational Value: Requires stable integration of the 3’ UTR-luciferase construct, enabling consistent, long-term assay performance across screening campaigns.
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by validating hits against endogenous target expression, connecting reporter activity to native gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insight into post-transcriptional gene regulation before significant investment in lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of UTR-dependent gene regulation by measuring luciferase activity as a proxy for mRNA stability and translation.
- Screening: Enables high-throughput evaluation of chemical libraries with built-in counterscreening to reduce false positives from non-specific effects.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized luminescence data with statistical cutoffs to prioritize compounds for secondary validation.
- Translational Research: Connects reporter-based findings to endogenous gene expression, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform where different 3’ UTRs can be swapped to screen for regulators of multiple disease-relevant genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming compound effects are mediated through the 3’ UTR rather than transcriptional or cytotoxic mechanisms.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility through stable cell line integration and standardized liquid handling protocols for compound delivery and detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering out promiscuous or toxic compounds early, reducing failure rates in later-stage preclinical studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on mechanism-specific activity, supporting better go/no-go decisions in target-focused programs.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise to clone and validate the 3’ UTR-luciferase reporter construct.
- Depends on access to high-throughput liquid handling robots and luminometers for automated compound delivery and detection.
- Necessitates cross-team standardization between assay developers, screening technologists, and data analysts to ensure consistent hit calling.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell lines or UTR sequences, including validation of stable integration and signal window.
- Includes practical limitations such as the need to distinguish true UTR effects from artifacts via counter-screening in control cells lacking the 3’ UTR insert.
