高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

本实验通过转录本的三端非翻译区（3' UTR），筛选可调节转录后调控机制的化合物文库。首先，在目标基因中鉴定感兴趣的三端非翻译区（3' UTR）。将该3' UTR克隆至El荧光素酶对照报告质粒中，构建El荧光素酶3' UTR嵌合转录本。

然后稳定地将两种质粒整合到与疾病相关的细胞系中，将携带嵌合转录本的细胞接种至96孔板，用化合物文库处理24小时，随后鉴定影响荧光素酶活性的分子。

挑选选定的分子进行进一步的验证筛选，随后用经过精选的化合物子集处理对照细胞和携带荧光素酶3'非翻译区嵌合转录本的细胞。结果将有助于区分化合物的作用是通过3'非翻译区介导的，还是通过其他载体序列介导的。这与大多数基于报告基因的筛选实验不同。

专注于转录调控的检测方法，这些基于细胞的检测方法旨在鉴定通过3'非翻译区和翻译区调节mRNA转录水平的化合物。使用胰蛋白酶消化收获稳定转染的神经母细胞瘤细胞。将细胞稀释至浓度为每毫升2 × 10⁵个细胞。

在含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基中，用于27块板。考虑到液体操作、槽式容器的死体积以及重复移液步骤，至少准备250毫升细胞悬液。然后将细胞悬液倒入无菌储液槽中，并将其放置在机器人工作台上。

在机器人工作台上放置九个带条形码的白色平底96孔板以及一盒200微升无菌移液器吸头。混匀细胞悬液，然后将75微升细胞分别加入九块板的每个孔中。

盖上培养板，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下静置30分钟，使细胞沉降至孔底，以尽量减少边缘效应。随后将全部九块培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育24小时。以相同方式，每次处理剩余的九块培养板。

在室温下解冻化合物文库板。用无菌 PBS 填充一个储液槽，另一个储液槽中加入含 0.5% DMSO 的 PBS 溶液，并将它们放置在机器人工作台上。针对每块文库板。

制备并相应标记。一块稀释板。现在向稀释板的第2至第11列的每个孔中加入398 µL无菌PBS。

然后在第1列和第12列中加入50 µL含0.5% DMSO的无菌PBS。接着加载两个稀释板。将两个文库板、两盒50 µL无菌吸头和六个细胞板放置在机器人工作台上。

现在揭开细胞培养板，从两个文库板之一中吸取2微升10毫摩尔的储备溶液，加入相应的稀释板中，并充分混匀。使用同一套枪头，将3微升50微摩尔的稀释液转移至三个带有条形码的白色96孔细胞培养板中。

更换全套枪头，对第二个文库板重复细胞诱导操作。盖好培养物，于37℃孵育24小时。随后对剩余的文库板重复化合物稀释和细胞诱导过程。

将重组的荧光素酶试剂平衡至室温。将荧光素酶试剂储液槽放置在机器人工作台上，并将试剂倒入其中。从培养箱中取出九块诱导培养物的平板。

将它们放置在机器人工作台上，揭开盖子并平衡至室温。然后在板间每孔加入 50 µL 荧光素酶试剂。引入一个等于单块板发光读数时间的延迟。

孵育30分钟后，首先记录培养板的条形码，以便将其与相应的数据文件关联。然后，将第一块培养板放入发光检测仪中，测定发光值。

短暂振荡后，对所有诱导培养板重复进行发光检测。然后收集剩余的荧光素酶检测试剂，并在负20摄氏度下保存。待初步筛选的实验数据处理完成后，通过反向筛选挑取验证来确认阳性化合物的特异性。

挑选选定的阳性结果，并为新的筛选板创建布局，包括对照的位置。然后从存储在单个二维条码管中的等分试样中制备新的HIIT板。后续操作遵循与筛选相同的实验方案。

每种稳定细胞系准备 3 块 96 孔板，每块 hi 板。次日，用文库化合物处理细胞。每块 hi 板用于处理三块 CHP 1 34 micken 细胞板、三块 prime UTR 板和三块对照细胞板，工作浓度为 2 µM，处理 24 小时。

检测所有CHP 1 34孔板、三个3'非翻译区及对照组的荧光素酶活性。与初筛数据分析相同，将处理孔的实验数据归一化为同板溶剂处理对照组的平均值。然后计算每种测试化合物在重复实验中的均值和标准差。

CHP 1 34 McIn 三端非翻译区（3' UTR）相对于 CHP 1 34 对照细胞中荧光素酶活性的倍数变化，选择大于 1.5 的任意倍数变化阈值以及显著性 P 值小于 0.01 的条件。本实验对一个包含 2000 种化合物的文库进行了筛选，以寻找可能通过 mic 癌基因的三端非翻译区（3' UTR）调控转录后调控机制的潜在调节因子。结果显示了单次实验中 25 个代表性文库孔板的荧光素酶信号，以溶剂处理组的百分比形式展示。

对照实验显示，大多数化合物对3'非翻译区（3' UTR）无明显影响。筛选时根据所有检测值计算各化合物的平均值和标准差，若化合物使荧光素酶活性降低超过20%，则很可能表明该化合物具有显著的细胞毒性。本图展示了针对四种选定化合物（分别标记为W、X、Y和Z）进行反向筛选的代表性结果。化合物W和X均导致癌基因3' UTR报告系统中荧光素酶表达水平升高，如倍数变化差异和T检验结果所示。需要注意的是，尽管化合物W和X的作用均确实依赖于3' UTR，但化合物W对细胞活力无显著影响。

尽管化合物X在CHP134对照细胞中表现出一定的细胞毒性，这由标准化的荧光素酶信号所表明，但化合物Y和化合物Z在两微摩尔浓度下均未显示出对荧光素酶水平的3'非翻译区依赖性效应。化合物Y处理后在初筛中检测到的荧光素酶活性降低，实际上是细胞毒性的结果。而对于化合物Z，荧光素酶活性的升高则是由于对病毒启动子的非特异性3'非翻译区激活所致。

由于在对照组和非翻译区组中均观察到相似的上调现象，在此高通量检测中，务必注意验证对照细胞中主要热效应的存在，这对于区分真正通过3'非翻译区发挥作用的化合物与通过启动子机制起作用的化合物至关重要。