自噬分析 Penicillium chrysogenum 通过使用饥饿垫结合荧光显微镜技术

本实验的目的是在丝状真菌中诱导并观察自噬现象。首先，将含有营养物质的培养基小体积接种孢子或菌丝小片段。第二步，在玻璃显微镜载玻片的凹槽中制备饥饿垫，然后将接种物转移至饥饿垫上。

在最后一步中，将饥饿垫置于湿室中孵育以诱导自噬。最终，可通过荧光显微镜监测目的荧光标记蛋白向液泡的转位来追踪自噬过程。该方法有助于研究细胞生物学领域中的关键问题，例如鉴定能够调节自噬过程的新化合物。

为了准备饥饿实验，如果目标P cresa genum菌株保存在绿色大米上，首先取两到三粒覆盖有菌丝的大米，放入1.5毫升离心管中，并向管中加入500微升酵母提取物葡萄糖生长培养基或wide GG培养基。然后将离心管涡旋振荡30秒，使孢子从大米上脱落，并在室温下孵育一天。次日，若p cryogen保存在琼脂上，则用无菌自来水将孢子悬浮液稀释至1:50浓度，并充分混匀。

使用移液枪枪头将少量菌丝转移至含有 400 微升无菌自来水和约 100 毫克玻璃珠的 1.5 毫升微量离心管中。然后将离心管涡旋振荡两分钟，使菌丝断裂成碎片。若要在饥饿培养垫上培养 PCE genum，首先将加热板预热至约 60 摄氏度。

接着，将2克aros溶于100毫升自来水中，在微波炉中加热，直至溶液完全澄清，同时使aros冷却至约60摄氏度。每个样品准备一支1.5毫升微量离心管，加入400微升无菌自来水或化合物溶液。然后将离心管和载玻片置于加热板上预热至少60秒。

将400微升60摄氏度的aros转移至所有离心管中，使每管总体积达到800微升，短暂涡旋混匀，然后将离心管放回加热板上，以防止过早凝固。现在将140微升相应的aros溶液用移液器加入每张显微镜载玻片的凹槽中。注意避免产生气泡，立即用盖玻片压平aros，随后将载玻片静置约四分钟。

当 aros 垫在室温下凝固后，用拇指或食指小心地将盖玻片滑下，并将载玻片和垫片放入湿室中。接着，用移液器吸取 5 µL 前期制备好的 P er genum，加至饥饿垫的中央，再用塑料袋包裹湿室，以进一步防止干燥，注意不要过度移动盒子或扰动培养物。随后，将接种物在室温下存放至少 20 小时，然后再分析样品。

第二天，将载玻片转移至干燥的纸巾上，然后在每个饥饿培养基上滴加50微升水。用盖玻片挤出多余的水分，并用新的纸巾吸除。随后，对每张载玻片使用20倍物镜获取菌丝生长的总体观察图像。

为了评估GFP在Hy-Fi中的定位，使用63倍或100倍物镜打开图像。每次观察后，将玻片放回湿盒中，直至下一个实验时间点。

在这些图像中，使用 G-F-P-S-K-L-P Creo Genum 菌株评估了在 20 小时培养时间下的过氧化物酶体降解情况。此时在液泡中未观察到 GFP，这些细胞器也未出现增大。然而，在培养 40 小时后，可在部分菌丝中观察到 GFP 标记的液泡，表明自噬已被激活；在 60 小时培养时，GFP 荧光信号更为明显，且液泡进一步增大。

在本实验中，使用 p caressa 基因组的 delta 80 G 一突变体作为阴性对照。需要注意的是，即使在生长 60 小时后，该突变体仍无液泡扩张和 GFP 信号。作为阳性对照，使用自噬诱导药物雷帕霉素处理，与未经处理的 G-F-P-S-K-L 菌株观察结果一致。GFP 标记的液泡在生长 40 小时后开始可见，至 60 小时时，Hy-Fi 中已完全充满含有大量 GFP 的巨大液泡。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在神经菌类真菌中分析自噬作用。