Name: 仪表近期胎羊多元慢性非麻醉的录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 了解非麻醉胎羊模型的长期生理监测技术，通过血管导管和心电图电极实现宫内实时数据采集。该方法为研究胎儿发育及生理扰动反应提供了重要的实验手段。

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作者们衷心感谢Molly Towell围产期研究基金会、加拿大卫生研究院（CIHR）、魁北克健康研究基金会（FRQS）（资助对象：MGF）以及加拿大卫生研究院-魁北克围产期研究培训网络（QTNPR）（资助对象：LDD）提供的经费支持。
作者谨此感谢Esther Simard、Marco Bosa、Carl Bernard和Carmen Movila提供的技术支持。

动物护理遵循加拿大动物护理委员会的指南，并获得蒙特利尔大学动物护理委员会的批准（方案编号 #10-Rech-1560）。表1中提供了所用材料与方法的详细信息。
1. 麻醉
<ol>
	<li>将单腔导管插入颈静脉。</li>
	<li>使用乙酰丙嗪（Atravet 10 mg/mL）2 mg 静脉注射，于操作前约30分钟对母羊进行镇静&#160;在麻醉诱导前进行，以减少与操作相关的应激反应，从而降低皮质醇水平。</li>
	<li>给予地西泮（Diazepam 5 mg/mL）20 mg，氯胺酮（Ketalar 100 mg/mL）&#160;4-5 mg/kg 的丙泊酚（Propofol 10 mg/mL）静脉注射，剂量为 0.5 至 1 mg/kg，以诱导全身麻醉。</li>
	<li>使用喉镜（威斯康星型刀片，超长350 mm左撇子刀片）插入气道交换导管至气管，以辅助插管。将硅胶气管导管（内径9至12 mm）沿气道交换导管滑入气管。该技术有助于简化插管过程。小心充盈气管导管的气囊，以避免压力引起的气管溃疡，并将导管固定于母羊头部。</li>
	<li>将气管插管连接至麻醉机的呼吸回路，并立即开始机械通气。调整呼吸机参数以维持 PaCO2 在35至45 mmHg的正常范围内。</li>
	<li>将导管插入耳动脉（22至20 G；1英寸［0.9 x 25 mm］至1.16英寸［1.1 x 30 mm］），并连接至非顺应性导管，以监测直接动脉血压。</li>
	<li>使用多参数生理监护仪记录心电图、直接动脉血压、血氧饱和度（SpO₂）2），二氧化碳图（PET一氧化碳2），以及每5分钟记录一次体温。通过串行电缆将所有生理数据传输至中央生理数据采集计算机。使用循环水毯维持正常体温。</li>
	<li>以10 mL/kg的剂量在全身麻醉的首小时内输注平衡多离子溶液，随后将输注速率减至5 mL/kg/h。</li>
	<li>在切开皮肤前，对母羊静脉注射甲氧苄啶-磺胺多辛（trimethoprim-sulfadoxine）5 mg/kg，作为抗生素预防。</li>
	<li>对母羊和胎儿的所有外科操作均需采用标准无菌技术。</li>
	<li>始终对母羊实施屏障护理，包括非手术人员。这将最大限度地降低地方性感染的风险 例如，&#160;贝氏柯克斯体 始终佩戴手套和口罩（N-95型）。</li>
</ol>
2. 手术步骤概述
<ol>
	<li>在乳房前方紧邻处沿腹白线做一条20厘米长的正中切口，穿过下腹壁，以尽量减少腹肌损伤。
	<ol>
		<li>将大网膜向上方牵拉，手动触诊子宫角。从子宫体开始沿每个子宫角向其末端触诊，注意胎儿的数量及其大小。若存在多个胎儿，通过手动评估胎头大小及眼眶间距，选择较大的胎儿。</li>
		<li>通过部分外置的子宫牢固握住所选胎儿的头部。使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）在子宫大弯处行10 cm子宫切开术。立即将一个装有无菌生理盐水的无乳胶无菌外科手套套在胎儿头部，如同戴手一般；或者使用浸湿的4×4纱布保持胎儿头部湿润。将子宫固定于腹壁。
		<ol>
			<li>将胎儿的右侧和左侧胸肢外置，并轻柔地将胎儿从子宫中拉出，直至剑突位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采用标准手术暴露技术将聚乙烯导管插入右侧和左侧臂静脉及动脉。将另一根聚乙烯导管插入羊膜腔，并将其末端固定于胎儿胸骨处。
		<ol>
			<li>仅使用无菌导管。建议在标准设施中采用气体灭菌法。将每根导管连接至针头，针头再连接至双向三通阀，以便后续进行采血或压力监测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将不锈钢电极缝合至胸骨柄、剑突以及双肩各点，以监测心电图（ECG）。</li>
		<li>将胎儿放回子宫内。所有导管和电极通过左侧腹壁的一个小穿刺切口引出。</li>
		<li>使用三层缝合技术关闭剖腹切口。用合成可吸收单股缝线（USP 2）连续简单缝合腹壁。用合成可吸收编织缝线（USP 0）连续简单缝合皮下组织。使用外科不锈钢钉合器关闭皮肤切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术步骤的详细描述
	<ol>
		<li>用40号刀片从剑突部位向乳腺方向剃除毛发，并沿两侧 flank 的褶皱处剃净。随后用4%葡萄糖酸氯己定溶液和软毛刷彻底清洗腹侧腹部，持续3分钟。
		<ol>
			<li>使用4%葡萄糖酸氯己定从腹部中心开始进行标准无菌擦洗，以离心方式持续3分钟。将无菌生理盐水倒在腹部以去除消毒皂液。手术准备的最后一步，交替使用2%葡萄糖酸氯己定溶液和70%异丙醇进行三次擦拭。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在切口前确保麻醉深度足够。沿腹白线从脐部至乳房前方稍上方做一标准剖腹手术切口，以尽量减少腹肌损伤。</li>
		<li>沿左侧腹壁将长海绵钳插入腹腔，直至肋缘区域导管预定穿出位置。
		<ol>
			<li>将镊子的尖端抵住壁面，直至助手能够定位并确认合适的位置。将镊子的钳口稍微张开（1 cm），让助手进行一个 2 cm 的全层刺切口。</li>
			<li>将镊子尖端从切口处引出，再次打开，用镊子轻轻夹住导管，并通过腹部腹侧切口将导管最终牵拉出腹腔。需要注意的是，有些研究团队先植入导管再将其引出体外，这种方法的缺点是在手术过程中无法进行胎儿心电图监测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>触诊子宫以确定胎位和胎仔数量。通过耳间距离确定最大的胎仔。在子宫大弯处胎仔头部背侧的宫壁上做切口，避开绒毛膜突起。
		<ol>
			<li>使用剪刀切开胎膜，然后插入钝端套管以获取无出血的羊水样本。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过该切口将胎儿的头侧半部移出体外。将装有37°C无菌生理盐水的无菌非乳胶外科手套覆盖在胎儿头部，以帮助维持正常体温。
		<ol>
			<li>在将胎儿上半身从子宫中取出时，助手应持Babcock钳夹住以防止羊水流失。随后，再次使用Babcock钳夹住胎膜和子宫壁与皮肤，以防止羊水污染腹腔。</li>
			<li>仅暴露需要进行器械操作的胎儿身体部位，其余部分应保留在子宫内或分别用湿润且温热（37 °C）的无菌布覆盖。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将双侧胸肢外展，以充分暴露双侧肱动脉和肱静脉。沿前臂内侧切开，仔细分离肱动脉和肱静脉周围组织。</li>
		<li>采用标准手术切开技术将聚乙烯导管插入右侧和左侧肱动脉以及左侧肱静脉。
		<ol>
			<li>分离待插管血管周围组织，范围超过1厘米。使用编织合成可吸收USP 2-0缝线结扎血管远端。在血管近端预先放置结扎线，但暂不打结。
			<ol>
				<li>使用Castroviejo剪刀将血管横向剪开，切口约为血管直径的30%。通过牵拉近端缝线部分阻断血流。将导管向近端方向插入。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将聚乙烯导管向近端插入约8 cm，或直至遇到阻力，然后稍作回撤。使用血管夹临时固定导管的近端。在导管的近端和远端周围再放置一针缝线。由助手持续抽吸并冲洗导管，以确保导管通畅。</li>
			<li>使用USP 2-0编织合成可吸收缝线，采用连续缝合方式关闭胎儿皮肤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在左右肩部、胸骨柄和剑突处，固定绝缘的不锈钢电极，以利于监测胎儿心电图。</li>
		<li>将羊膜腔压力和取样导管缝合至胸骨。该导管末端带有侧孔。</li>
		<li>使用USP 2-0编织合成可吸收缝合线将所有导管固定于胎儿背部。</li>
		<li>在将胎儿放回子宫之前，缓慢静脉注射30 µg 克仑特罗，持续15分钟&#160;以避免低血压并提供子宫松弛。</li>
		<li>使用USP 4-0编织合成可吸收缝合线，采用连续缝合方式缝合胎膜。每次仅将一根导管或电极纳入缝合口，以确保紧密闭合。使用USP 0编织合成可吸收缝合线，按照Halsted原则采用双层库兴式（Cushing）缝合法关闭子宫肌层。仔细埋藏手术结。</li>
		<li>使用荷包缝合技术，在所有导管和心电图导线穿出左侧肋旁切口处将其固定。</li>
		<li>使用 USP 2&#160;使用单股合成可吸收缝合线以连续缝合方式缝合白线。使用USP 2-0编织合成可吸收缝合线以连续缝合方式闭合皮下组织。以外科缝钉固定皮肤层。</li>
		<li>静脉注射250 mg氨苄青霉素，并通过羊膜腔导管向羊膜腔内再次给药。用温盐水补充流失的羊水。</li>
		<li>将所有外置的导管和心电图电极放入无菌袋中以维持无菌状态。在母羊躯干周围放置一层网状绷带，以固定所有导管和电极，使其紧贴母羊身体。</li>
		<li>停止全身麻醉，待母羊喉部反射恢复正常后拔管。</li>
		<li>将母羊在全身麻醉后恢复稳定时，放回代谢笼中。在整个实验期间，母羊将饲养于代谢笼内。母羊应能够站立、躺卧和进食 随意摄取 在不使母体镇静的情况下监测未麻醉的胎儿。</li>
		<li>接下来的三天内，对母羊预防性给予抗生素（甲氧苄啶磺胺多辛 5 mg/kg），对胎儿静脉注射氨苄西林 250 mg，并通过羊膜腔导管再次给药。</li>
		<li>利用血气分析评估母羊和胎儿的代谢状态。</li>
		<li>以尽可能少的肝素化生理盐水冲洗所有导管。注意——切勿超过胎儿可接受的肝素和液体的日允许剂量。有可能导致胎儿液体负荷过重。在抗生素预防后，每天缓慢冲洗一次，每条管路约5 mL NaCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据记录与分析
	<ol>
		<li>手术期间，可选择性持续记录母体和胎儿的ECG及心率，以及母体动脉血压和气道压力（Paw）图1）。使用生命体征监护仪采集除心电图以外的所有母体数据。将这些数据与胎儿和母体心电信号一同输入模数转换器；传递&#160;将母体和胎儿心电图信号首先输入1901型前置放大器。使用制造商提供的软件记录并显示所有数据。</li>
		<li>在胎儿手术开始时（插入第一根动脉导管后立即进行）和关闭子宫后，同时从母羊和胎儿采集1 mL动脉血样本，用于动脉血气分析，以及乳酸、葡萄糖和血浆碱剩余的测定。</li>
		<li>术后恢复期间，采集3 mL胎儿血样以检测IL-6和TNF-α炎症谱。将血浆于4 °C离心（4分钟，4,000 x g），倾出上清液并储存在-80 °C，用于后续ELISA检测。 
		注意：为了获得本文报告的代表性结果，术后第六天通过静脉注射 20 mL 戊巴比妥钠处死动物。通过检测仔鼠体重、脑重、肝重及母鼠体重评估胎儿生长情况。实验周期的持续时间显然取决于具体研究问题的设计，最长可达约 6 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞因子分析（可选步骤）
	<ol>
		<li>使用绵羊特异性的夹心法测定血浆中细胞因子浓度（IL-6、TNF-α）&#160;ELISA。将小鼠抗绵羊单克隆抗体（IL-6 捕获抗体）或小鼠抗牛单克隆抗体（TNF-α）以 4 µg/ml 的浓度包被于 ELISA 板上，4 °C 过夜孵育。之后用洗涤缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 PBS，PBST）洗涤 3 次。</li>
		<li>用含1% BSA的PBST封闭平板1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次。</li>
		<li>使用重组绵羊蛋白（IL-6、TNF-α）作为ELISA标准品，配制系列稀释液，浓度范围从标准品1的2,000 ng/ml至标准品7的31.25 pg/ml。</li>
		<li>每孔加入50 µl系列稀释的蛋白标准品和样品，室温孵育2小时，洗涤平板3次。所有标准品和样品均设复孔。</li>
		<li>在孔中加入50 µl兔抗绵羊多克隆抗体（检测抗体IL-6）或兔抗牛多克隆抗体（TNF-α），稀释比例为1:250，于室温孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤平板5次。</li>
		<li>加入50 µl 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1:5,000稀释），孵育30分钟。</li>
		<li>每孔加入50 µl TMB底物溶液，孵育。</li>
		<li>在所需时间加入25 µl的2 N硫酸以终止显色反应。</li>
		<li>在酶标仪上以450 nm波长读取吸光度，并以570 nm波长进行校正。 
		注意：在我们的检测中，IL-6 ELISA 的检测灵敏度为 16 pg/ml，TNF-α ELISA 的检测灵敏度为 13.9 pg/ml。所有检测的批内和批间变异系数均为 &#60;5% 和 &#60;10%，分别。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析 
	注意：具体的统计学方法取决于研究问题。此处我们报告用于检验表2中血液气体指标是否存在显著差异的统计方法。
	<ol>
		<li>使用 Kolmogorov-Smirnov 检验测试数据正态分布，随后根据情况选择适当的参数检验或非参数检验，并对多重比较进行校正。</li>
		<li>使用K均值聚类分析识别队列中自发性缺氧的胎儿，并确定各自的pO2 和 O2Sat 值（考虑 pO2 &#60; 20 mmHg 或 O2周六 &#60; 55% 为胎儿缺氧。 44-48</li>
		<li>使用 SPSS 等统计软件进行分析。</li>
		<li>以均值±标准差表示数据，统计学差异显著性设为 p&#60;0.05 被视为具有显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

未作任何披露。

本文介绍了建立用于研究胎儿生理学和病理生理学的动物模型——慢性置入仪器且非麻醉状态下的胎羊模型——所需的麻醉与手术操作。
该方案中有四个关键步骤需要特别强调。第一，将导管和电极穿过母体侧腹：此操作应一次性完成，以避免造成任何内脏器官损伤。第二，在将胎儿移出之前，需固定好子宫切口手术部位：这一点至关重要，可防止或尽量减少羊水流失，并在关闭子宫前对羊膜进行缝合。第三，动脉插管：胎羊动脉直径约为1-2 mm，对于经验丰富的外科医生而言插管并不困难；由两名外科医生组成的团队在此操作中配合最为高效快捷，有助于节省时间，从而缩短整个手术过程的持续时间。第四，在将胎儿放回羊膜腔并关闭子宫之前，需仔细固定并整理好羊膜腔内的所有导管和心电图电极：这有助于避免术后因母体或胎儿活动导致导管被意外牵拉或心电图电极撕裂。
除了本文所介绍的肱血管插管方法外，也可使用颈动脉或股动脉进行插管。具体选择取决于整体的仪器植入策略，而该策略本身又由研究设计决定。我们建议尽量减少胎儿在子宫外停留的时间，并尽量减少胎儿为完成仪器植入所需离开子宫的程度。这些考虑因素促使...

存在多种动物模型可用于研究正常及异常妊娠，包括实验啮齿类动物、非人灵长类动物和家养反刍动物。1,2,3,4,5 慢性植入仪器的妊娠绵羊已被广泛用作人类胎儿发育及对病理生理刺激（如脂多糖（LPS））反应的研究模型，应用历史已达50年。6-10 LPS暴露后产生的病变与早产儿脑室周围白质软化症所见的病变完全相似，这是由于两种物种具有类似的成熟发育特征。11, 12
其他妊娠并发症也已得到深入研究，例如产前糖皮质激素可促进胎儿肺部发育13-15，以及宫内生长受限（IUGR）对胎儿的影响16,17。
胎羊模型被广泛使用，是因为非麻醉状态下的胎羊特别适合进行手术植入和维持导管及电极，从而可重复采集血液样本、记录生物电活动、施加电刺激以及进行体内脑成像。18 尽管遥测技术也可实现，但由于其建立系统更为复杂，且初期投入和维护成本较高，目前应用仍较少。19
此外，胎羊模型具有很高的多功能性，可根据研究需求选择多种不同的仪器配置。例如，可连续数天至数周实时记录多种变量信号，包括胎羊呼吸运动、脑电活动、心血管反应、心电图，以及利用血流探头或微球技术测量多个器官的局部血流量等。得益于这种多功能性，已开展的研究涵盖广泛领域，如心血管系统的发育20,21、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的发育22、脑发育23，尤其是睡眠状态的发育24、缺氧/窒息的影响25、治疗性低温疗法26、炎症反应6-11、炎症与缺氧的联合作用27、糖皮质激素的作用28,29、抗抑郁药物的影响30、支气管肺发育不良（BPD）31,32、胎儿期编程33,34,35,36,37,38,39，以及产前和分娩期间新型胎儿监护技术的开发等研究方向40,41,42,43。
本方法的总体目标是展示这一多功能模型的基本实施方案。该模型可用于建立多种急性和慢性实验方案，从整体、器官、细胞和分子水平上研究胎儿生理学与病理生理学。

<table><tbody><tr><td>ACE 光源</td><td>Schott-Fostec</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>14060 - 11</td><td></td></tr><tr><td>斜头解剖剪刀</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>15006 - 09</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>10003 - 12</td><td>交替使用的解剖工具</td></tr><tr><td>弧形手术刀片 #12</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>10012 - 00</td><td>交替使用的解剖工具</td></tr><tr><td>骨剪</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>16044 - 10</td><td></td></tr><tr><td>S &amp; T 缝合打结镊</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>00272 - 13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS 镊子 - 斜头型</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>11203 - 25&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6-0 规格编织丝线缝合线</td><td>泰利福医疗（Teleflex Medical）</td><td>07 - 30&amp;nbsp; - 10</td><td></td></tr><tr><td>医用胶带</td><td>Transpore</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 100 mg/ml</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409 - 2051 - 05</td><td>最终剂量为 80 mg/kg</td></tr><tr><td>镇静注射液（赛拉嗪 100 mg/ml）</td><td>Vecdo</td><td>NDC 50989 - 234 - 11</td><td>最终剂量为 10 mg/kg</td></tr><tr><td>活性橙 14</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R - 8254</td><td></td></tr><tr><td>林格氏液成分</td><td></td><td></td><td>溶液经含 95% O₂ 和 5% CO₂ 的气体平衡，最终 pH 值为 7.4</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td>最终浓度：118 mM</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>费希尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>P217 - 3</td><td>最终浓度：4.7 mM</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>费希尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>C79 - 500</td><td>最终浓度：2.5 mM</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>费希尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>P -285</td><td>最终浓度：1.2 mM</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>J.T. Baker</td><td>Jan-00</td><td>最终浓度：0.57 mM</td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）</td><td>费希尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>BP 310 - 500</td><td>最终浓度：5.95 g/L</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G8270</td><td>最终浓度：5.5 mM</td></tr><tr><td>LifeWindow</td><td>Digicare 生物医学技术公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED 生物放大器和 ADC 单元</td><td>剑桥电子设计有限公司（Cambridge Electronic Design Limited,&lt;br/&gt; Unit 4, Science Park,&lt;br/&gt; Milton Road,&lt;br/&gt; Cambridge CB4 0FE&lt;br/&gt; ENGLAND）</td><td>生物放大器：1902；ADC：micro1401；数据采集软件：Spike 2，V7.13</td><td></td></tr><tr><td>Neurolog 模拟信号生物放大器</td><td>Digitimer 有限公司（Digitimer Ltd&lt;br/&gt; 37 Hydeway&lt;br/&gt; Welwyn Garden City&lt;br/&gt; Hertfordshire, AL7 3BE, England）</td><td>NL108A</td><td></td></tr><tr><td>ABL800Flex</td><td>Radiometer Canada；200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5804R</td><td>Eppendorf Canada；2810 Argentia Road, #2&lt;br/&gt; Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arrow 颈静脉插管套件</td><td>Arrow International, Inc.，2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atravet</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>地西泮</td><td></td><td></td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Ketalar</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SurgiVeT</td><td>气管内导管；Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cook 气道交换导管（带 RAPI-FIT 接头）</td><td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispomed 呼吸机</td><td>Dispomed Ltd.，745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W</td><td>贝克顿·迪金森公司（Becton Dickinson），输注治疗系统公司（Infusion Therapy Systems Inc.），9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA</td><td></td><td>22 至 20 G；1 英寸 [0.9 x 25 mm] 至 1.16 英寸 [1.1 x 30 mm]</td></tr><tr><td>Edwards Lifesciences 型号：PX272 压力监测套件（含 TruWave 一次性压力传感器）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LifeWindow LW6000</td><td>Digicare 生物医学技术公司，107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaymar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Babcock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>SCI（Scientific Commodities Inc.）</td><td></td><td>2 米</td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>心电图（ECG）</td><td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany</td><td></td><td>单鞘内四铜电极，2 米</td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDS II USP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>复方磺胺甲噁唑（甲氧苄啶-磺胺多辛）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄西林</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>Argon Medical，货号&amp;nbsp;041220001A</td><td></td><td>带阳式鲁尔锁的双四通三通阀</td></tr><tr><td>针头</td><td>Tyco Healthcare 8881202389</td><td></td><td>Monject 铝制针座钝头针，22Gx，0.7mm x 38.1mm：用于胎儿动脉和静脉导管</td></tr><tr><td>针头</td><td>Tyco Healthcare 8881202322</td><td></td><td>Monject 铝制针座钝头针，16Gx，1.6mm x 38.1mm：用于羊膜腔导管</td></tr></tbody></table>

近胎龄绵羊多变量慢性非麻醉状态记录的仪器化

Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

慢性置入仪器的妊娠绵羊已被用作研究人类胎儿发育以及对病理生理刺激（如内毒素、细菌、脐带阻塞、缺氧和各种药物治疗）反应的模型。针对有早产风险胎儿的糖皮质激素治疗以及治疗性低温等挽救生命的临床实践均是在该模型基础上发展而来。这得益于非麻醉状态下胎儿绵羊对手术植入和维持导管及电极的特殊适应性，从而可实现重复采血、物质注射、生物电活动记录、电刺激应用以及器官的体内成像。本文描述了建立稳定的慢性置入仪器且非麻醉胎儿绵羊模型所需施行的手术置入操作，并从术后血气、代谢及炎症等角度对术后恢复情况进行表征分析。

在妊娠128±2天（dGA，约妊娠0.88倍，足月为145 dGA）时，采用无菌技术在全身麻醉下（母羊和胎儿均麻醉）对38只妊娠期确定的母羊进行了手术置入动脉、静脉和羊膜导管以及心电图（ECG）电极。若为双胎妊娠，则根据触诊估计胎儿间颞径选择较大的胎儿； alternatively，也可随机选择胎儿进行置入操作，以避免潜在的偏倚，或对两个胎儿均进行置入。手术总持续时间为124±27分钟。胎儿上半身暴露于子宫外的时间为92±19分钟。大多数接受手术的母羊为F2代动物，其母本为F1代（边境 Leicester × 罗马诺夫），父本为汉普夏公羊；其杂交组合如下：汉普夏（50%）- 边境 Leicester（25%）- 罗马诺夫（25%）= HABLRV。
手术和仪器操作期间具有代表性的母体和胎儿生理特征如图1所示，均处于胎儿相应孕周的生理正常范围，且母体在麻醉期间的行为表现正常。
母体体重平均为 75±11 kg，38 例中有 21 例为双胎妊娠（即，速率为1.6±0.5。在剖检时...

慢性植入仪器的非麻醉胎羊模型可用于研究健康和疾病状态下的人类胎儿发育，因为该模型允许手术植入和维护导管与电极、重复采血、注射物质、记录生物电活动以及进行体内成像。本文描述了建立该模型所需的操作步骤。

长期置入仪器的妊娠绵羊已被用作研究人类胎儿发育及对病理生理刺激（如……）反应的模型

本实验方案的总体目标是描述对OV胎儿进行仪器置入，以实现长期生理监测，从而响应任何生理干扰。该研究模型能够在非麻醉状态下对子宫内胎儿进行血管通路建立以及心电图和其他生物电信号的监测。这使我们能够深入了解在生理干扰（如血管阻塞或注射促炎介质）过程中所发生的变化。该模型在临床上对于理解胎儿在健康与疾病状态下的发育具有重要意义。本文所述的所有动物实验程序均已获得蒙特利尔大学动物使用伦理委员会的批准，并遵循加拿大动物护理委员会制定的指南。本实验为非存活实验。此处描述的麻醉方案对炎症反应的影响最小。给予小剂量的丙泊酚可减轻喉部反射，从而便于插管。在整个麻醉过程中使用多参数生理监测仪。此处可观察到所有监测的母体生理参数。将心电图、直接动脉血压、气道压力、脉搏血氧饱和度、二氧化碳图、呼出麻醉气体浓度、温度以及动脉血气分析连接至母体监护仪，并接入剑桥电子设计数据采集装置。使用定制的接口电缆可实现母体与胎儿生理数据的同步显示。采用标准化的无菌技术对U形腹部进行准备。U形支架略微向右倾斜，以便在手术前及整个手术过程中使插入的血管导管和心电图电缆顺利引出。麻醉深度通过多种神经反射进行评估，例如眼球位置、瞳孔对光反射、下颌张力以及对手术刺激的反应。使用头皮刀沿正中线做切口。本研究中使用的止血技术包括血管结扎或单纯压迫。需结扎腹壁皮下正中静脉。锐性分离皮下脂肪组织，直至清晰暴露腹白线。在脐部小心地做线性切口。然后通过这个小切口插入一根手指，以确认切口下方无粘连或重要结构。在切开过程中，可使用Nason Brown止血钳的柄部保护手术刀片的锋利边缘，从而保护下方的解剖结构。首先通过触诊子宫，确定子宫的两个角，并计数存在的胎兽数量。可能出现三胞胎，而三胞胎情况下成功完成治疗的概率较低，因此我们不推荐使用三胞胎。选择最大的胎儿，通过口腔至腹部的距离进行操作，以便插入血管导管和心电图电缆。将海绵钳从腹壁左侧插入腹腔，并沿腹壁向上推至左侧胁腹部。在钳子所在位置做一小切口，随后将血管导管和心电图电缆经此切口穿过，并从腹部切口引出。在开始后续手术步骤之前，必须确认已备齐所有血管导管和心电图电缆。将胎儿头部娩出，确定子宫上无胎盘附着的区域，并沿大弯侧识别导联连接位置。首先使用手术刀片做一个小切口。然后可用剪刀从小切口处向胎儿头部方向小心延长切口，以尽量降低损伤风险，同时保持羊膜完整。在打开羊膜之前，先用钝端导管采集羊水样本，以尽量减少血液污染。 该样本可用于检测是否存在炎症性改变。将胎膜上的头部移除，并立即置于外科手套内。手套中充满温水，以帮助维持正常体温。使用Babcock钳夹住胎膜、子宫和皮肤，以减少羊水流失以及手术操作对胎盘张力造成的损伤。使用无菌手术单隔离手术区域。胎儿置管操作的第一步是插入动脉导管。沿肱骨内侧纵轴做一切口。在肱骨中点处，钝性分离肌腹间内的肱动脉。随后将一段可吸收缝合材料穿过动脉下方形成环状。接着剪断该环，将两段缝合材料分别拉向动脉的两端。结扎动脉的远端。在近端绕成一个环，用于对动脉施加牵引力，从而更易于使用显微剪刀在动脉上制作一个小切口。使用镊子将一根微小的医用级乙烯基导管插入动脉中。替代镊子的方法是使用血管扩张器。可将血管扩张器的尖端插入切口，以辅助导管的置入。导管上的刻度标记有助于确保插入足够长度的导管。在近端结扎处与插入部位之间的导管上放置血管夹，以防止血液泄漏。然后将近端结扎线固定在血管和导管周围。此时可移除血管夹。在近端位置放置第二根结扎线。将远端结扎线的自由端固定在导管周围。在此过程中，需由助手持续抽吸并冲洗导管，以确保导管通畅，且结扎线在导管周围不过紧。应尽量减少注入的生理盐水量，以避免胎儿液体负荷过重。现在可进行胎儿血气分析，以评估胎儿的健康状况。静脉导管可采用完全相同的技术置入。 头静脉可定位在切口近端位置。使用两条结扎线固定静脉，近端的结扎线在导管插入静脉前暂不打结。再次使用剪刀，在容器上开一个小孔。将导管插入，并在插入点的近端和远端均予以固定。这些血管导管的具体放置位置将取决于研究模型的需求以及所要研究的目标器官。静脉和动脉导管均从同一处切口引出。随后使用单层连续缝合方式关闭皮肤切口。导管在多个位置固定于前臂，以便肢体能够屈曲。在正常位置，导管连接于肩部，然后置于肩胛骨之间。在对侧放置第二根动脉导管，作为备用，以便在术后期间获取动脉血压和动脉血样。使用16号针头连接四根心电图导联线，针头经皮下穿过。注意裸露的导线部分，该部分最终将置于皮下，导线通过针的斜面插入。拔出针头，使导线留置于皮下。使用两个方结固定导线。随后，将氰基丙烯酸酯胶水涂抹于每个结上。在每个肩关节、胸骨柄和剑突处放置缆线。将一根带侧孔的导管连接至胸骨，以测量宫内压力，并在将胎儿放回子宫前进行羊水的反复取样。静脉缓慢注射30微克的克仑特罗。作为一种β2受体激动剂，克仑特罗可提供子宫松弛作用，同时还能减少因子宫操作引起的潜在腹部不适。将四条腿小心地重新放回子宫内，或将血管导管和心电图电缆引至背部颈部区域，并在整个手术过程中用缝线固定于皮肤上。用温盐水浸润胎儿非常重要，以防止暴露的组织干燥并保持胎儿体温。在最后时刻移除外科手套，并将胎儿头部重新放回子宫内。现在开始关闭子宫。首先，从子宫切口处移除Babcock钳。使用4-0号合成多股可吸收缝合线，采用单纯连续缝合方式缝合胎膜。每根导管和心电图电缆需分别单独进行封闭。这样可实现更紧密的闭合，从而防止任何泄漏。使用0号合成多股可吸收缝线材料，采用库兴（Cushing）缝合法对筋膜肌层进行双层缝合闭合。这种内翻缝合方式有助于最大限度地减少粘连形成和渗漏。再次强调，导管和心电图电缆需单独纳入缝合关闭过程中。子宫关闭后，通过羊膜腔导管向子宫内注入生理盐水，以补充丢失的羊水。手术过程中，子宫关闭后用大网膜覆盖。使用一根聚二氧酮缝线材料缝合腹壁切口。采用一种简单的连续缝合模式。重要的是要确保每次进针时都将腹直肌鞘纳入，如图所示。此处，外科医生选择分两个阶段关闭线性切口。采用简单的连续缝合方式闭合皮下组织。在此阶段，助手医生将在血管导管和心电图导线从左侧腹侧穿出的位置周围放置荷包缝线。皮肤切口使用皮肤缝钉闭合，以缩短缝合时间。手术伤口被清理干净，并在伤口处覆盖非封闭性敷料。在U的躯干部分覆盖网状弹力绷带。术后一小时内，U即可起身走动，并以平静而好奇的方式开始再次进食。在此期间，整个手术阶段均给予布托啡诺和镇痛治疗。使用多参数生理监护仪记录母体的生理参数。母体心电图和气道压力通过定制电缆与剑桥电子设计监护仪连接，并与胎儿生理数据同步。可从这些数据中提取胎儿和母体的心率变异性。此处展示了一例所采集的生理学数据。在手术期及术后特定预设时间点，采集配对的母体和胎儿动脉血气样本，以监测其健康状况。根据这些检测结果，调整呼吸机参数、液体治疗方案及多巴酚丁胺输注速率，以确保母体和胎儿充分的通气与灌注，并实施了鼻导管氧疗。一旦拔除气管插管，继续进行液体治疗。如果发现任何酸碱或电解质紊乱，我们推测胎儿出现短暂性轻度代谢性酸中毒的原因可能与使用温和麻醉所致的子宫灌注减少有关。有关结果的更多信息，请参阅书面文章。总之，本模型描述了两种动脉导管、一条静脉导管、心电图导线以及羊膜腔导管的基本外科植入手术。这些装置可用于心电图监测、动脉和静脉血液的血压采样，以及子宫内静水压的监测。我们谨向以下个人致以诚挚谢意，感谢他们在本项高强度研究项目中提供的宝贵协助。同时，我们感谢加拿大卫生研究院、拉丰在魁北克对桑蒂的研究以及特维尔围产期研究基金会对本项目的资金支持。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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