Name: 新型原子力显微镜基于生物淘选的形态特殊试剂对TDP-43变型肌萎缩侧索硬化症隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 学习利用原子力显微镜和生物淘选技术分离针对肌萎缩侧索硬化症TDP-43蛋白变体的特异性抗体。该方法通过负淘选和正淘选相结合，可从复杂生物样本中有效识别低浓度的疾病特异性蛋白变体。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助：R21AG042066。我们感谢 Philip Schulz 在制作屏幕录制视频过程中的贡献。

1. 噬菌体的制备
<ol>
	<li>所有噬菌体的制备和生物筛选过程均在生物安全柜中进行。根据制造商提供的说明（http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf），使用不同的文库（Tomlinson I 和 J 文库以及 Sheets 文库21）制备用于生物筛选的噬菌体颗粒。 
	注意：我们在筛选过程中使用多个文库，以增加可获得抗体的多样性。</li>
	<li>简要而言，在含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的200 ml 2xYT培养基中，于37 °C摇床培养三种文库的细菌菌种，直至OD600达到0.4。</li>
	<li>向200 ml Tomlinson I 和 J 文库中加入8 × 1011个KM13辅助噬菌体，向200 ml Sheets文库中加入8 × 1011个VCSM13辅助噬菌体。将文库样品与辅助噬菌体在37 °C孵育30分钟，期间不振荡。</li>
	<li>在3,000 × g条件下离心培养物10分钟，将菌体沉淀重悬于200 ml含0.1%葡萄糖、100 μg/ml氨苄青霉素和50 μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中。</li>
	<li>将培养物在30 °C振荡过夜孵育，次日以3,300 × g离心30分钟。</li>
	<li>向各文库的200 ml上清液中加入50 ml含2.5 M NaCl的聚乙二醇（PEG）8000，冰上孵育1小时。PEG沉淀后，再次以3,300 × g离心30分钟。</li>
	<li>根据沉淀大小，向菌体沉淀中加入1–2 ml磷酸盐缓冲液（PBS），并转移至微量离心管中。</li>
	<li>将噬菌体颗粒在冰上孵育1小时（37 °C，期间偶尔混匀），然后以11,600 × g离心10分钟。收集上清液并储存在-80 °C。</li>
	<li>在冷冻前，从三个文库中各取少量噬菌体颗粒转移至另一微量离心管中，并使用TG1细胞对每个文库单独进行滴度测定以确定浓度。以下为一个文库的滴度测定步骤：
	<ol>
		<li>将TG1细胞培养至OD600为0.4。向6个微量离心管中各加入990 μl PBS。</li>
		<li>向第一个管中加入10 μl噬菌体颗粒。混匀后，从第一管中取出10 μl加入第二管。对剩余4个管重复此步骤。</li>
		<li>向6个管中各加入200 μl TG1细胞，并向这些管中分别加入10 μl六种不同稀释度的噬菌体溶液。在37 °C无振荡条件下孵育30分钟，使噬菌体颗粒感染细胞。</li>
		<li>取100 μl细胞液涂布于含100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板（LBA）上。37 °C过夜培养后，根据可见菌落数量计算pfu/ml。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 阴性生物筛选过程
注意：在整个生物筛选过程中，应避免噬菌体经历过多的冻融循环。理想情况下，最好在一天内尽可能多地完成阴性筛选步骤。在完成针对每个靶标的阴性或阳性筛选轮次后，重要的是保存部分噬菌体，以防后续任何步骤中发生污染。
<ol>
	<li>12轮针对牛血清白蛋白（BSA）的阴性筛选
	<ol>
		<li>向12个免疫管中各加入4 ml PBS中的1 mg/ml BSA溶液，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>将 1 × 1012 从三个文库中分别取出噬菌体颗粒（留出少量该噬菌体混合物，用于后续验证阴性筛选过程）。</li>
		<li>弃去第一根试管中的BSA溶液，用PBS洗涤试管2-3次，以去除未结合的BSA。</li>
		<li>将合并的噬菌体文库加入第一个管中，在旋转仪上室温孵育30分钟，收集未结合的噬菌体。</li>
		<li>用第二个免疫管重复步骤 2.1.3，并将步骤 2.1.4 中收集的噬菌体加入此免疫管中。重复步骤 2.1.4。</li>
		<li>用剩余的10管BSA溶液以及每次孵育后收集的未结合噬菌体重复步骤2.1.3–2.1.4。</li>
		<li>为验证所有BSA噬菌体结合物是否已被完全去除，使用原子力显微镜（AFM）进行检测。分别取2.1.2步骤中的噬菌体10 μl，以及2.1.7步骤后剩余的噬菌体10 μl，加入至吸附有10 μg/ml BSA的裂解云母表面。AFM操作流程的简要说明见第8节。</li>
		<li>在完成针对每个靶标的多轮负筛选后，保留少量噬菌体以验证筛选过程的成功至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10轮针对α-突触核蛋白不同形式的阴性筛选 注意：在本项目中，我们希望去除能够结合其他蛋白聚集形式（如α-synuclein单体、二聚体、三聚体）的噬菌体 等等。）因此我们将消除这些噬菌体（目标是尽可能消除所有交叉反应性噬菌体）。让纯化的α-突触核蛋白聚集至少7天，以确保单体和寡聚体形式均存在，用于负向筛选。
	<ol>
		<li>准备8个免疫管，其中4个加入含500 μg/ml聚集态α-synuclein的PBS溶液，另4个加入含100 μg/ml聚集态α-synuclein的PBS溶液，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>弃去其中一支含有500 μg/ml聚集态α-synuclein的试管中的溶液，用PBS洗涤，加入经12轮BSA阴性筛选后收集的噬菌体文库。</li>
		<li>将试管在旋转仪上室温孵育30分钟，收集未结合的噬菌体。</li>
		<li>重复步骤 2.2.3 和 2.2.4，依次对含有 500 μg/ml 聚集态 alpha-synuclein 的剩余试管，以及含有 100 μg/ml 聚集态 alpha-synuclein 的试管进行操作，每次使用步骤 2.2.4 后收集的未结合噬菌体。</li>
		<li>使用经500 μg/ml聚集态α-突触核蛋白第一轮阴性筛选后的噬菌体，以及经100 μg/ml α-突触核蛋白第八轮阴性筛选后的噬菌体，重复步骤2.1.8。</li>
		<li>为消除所有针对α-突触核蛋白的阴性结合物，另准备两支免疫管，每管加入500 μg/ml的聚集态α-突触核蛋白，并重复步骤2.2.2–2.2.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10轮针对健康人脑组织匀浆的阴性筛选
	<ol>
		<li>加入1× STEN缓冲液（50 mM Tris（pH 7.6）、150 mM NaCl、2 mM EDTA、0.2% NP-40、0.2% BSA、20 mM PMSF及蛋白酶抑制剂混合物）至人脑组织中28以24,000 rpm匀浆1分钟，样品在3,000 rpm下离心，收集上清液。</li>
		<li>准备2个免疫管，每管加入2 ml含50 μg/ml人脑组织的PBS溶液，另准备8个免疫管，每管加入含10 μg/ml人脑组织的PBS溶液，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>使用经α-突触核蛋白阴性筛选后收集的未结合噬菌体，首先对含有50 μg/ml人脑组织的试管重复步骤2.2.3-2.2.5，然后对含有10 μg/ml人脑组织的试管重复相同步骤。</li>
		<li>使用经过第一轮针对50 μg/ml人脑组织阴性筛选后的噬菌体，以及经过第十轮针对人脑组织阴性筛选后的噬菌体，重复步骤2.1.8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8轮针对健康免疫沉淀TDP-43的阴性筛选
	<ol>
		<li>从健康人脑组织中使用第9节所述方案免疫沉淀健康的TDP-43蛋白。由于免疫沉淀蛋白量较少，使用云母进行这些轮次的阴性筛选。</li>
		<li>切割八片云母表面。</li>
		<li>在第一片云母上加入约100 μl浓度为5 μg/ml的免疫沉淀蛋白，室温孵育5–10分钟。</li>
		<li>用含0.1% Tween 20的PBS（PBST）洗涤云母片5次。</li>
		<li>在对健康脑组织进行阴性筛选后，加入约100 μl噬菌体，并在室温下孵育5–10分钟。</li>
		<li>在步骤 2.4.5 的孵育中途，使用第二片云母执行步骤 2.4.3。</li>
		<li>收集步骤 2.4.5 中的噬菌体，并用 0.1% PBST 将云母片洗涤 5 次。</li>
		<li>清洗步骤 2.4.6 中的云母片，并加入步骤 2.4.7 中的噬菌体。</li>
		<li>重复步骤 2.4.4 至 2.4.9，直至噬菌体完成针对八块载有免疫沉淀蛋白的云母片的负向筛选。在完成第一轮和第八轮负向筛选后，分别使用噬菌体重复步骤 2.1.7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 轮针对FTD免疫沉淀TDP-43的阴性筛选
	<ol>
		<li>从额颞叶变性（FTD）患者脑组织中免疫沉淀TDP-43蛋白。</li>
		<li>劈开2个云母表面。</li>
		<li>向一片云母上加入50 μl浓度为10 μg/ml的FTD TDP-43，室温孵育5分钟。</li>
		<li>用 0.1% PBST 洗涤云母片 5 次。</li>
		<li>加入50 μl经针对健康TDP-43进行阴性淘选后收集的噬菌体，孵育5分钟。</li>
		<li>收集未结合的噬菌体。</li>
		<li>重复步骤 2.5.3 至 2.5.6，使用第二次的云母片以及在步骤 2.5.6 中收集的未结合噬菌体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 针对肌萎缩侧索硬化症患者免疫沉淀TDP-43的阳性筛选
<ol>
	<li>从肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者脑组织中免疫沉淀TDP-43蛋白。将3片云母表面切割分开。向其中一片云母上加入50 μl浓度为10 μg/ml的ALS TDP-43蛋白溶液，在室温下孵育5分钟。用0.1% PBST洗涤云母5次。</li>
	<li>向云母上加入50 μl经健康TDP-43蛋白负向筛选后收集的噬菌体。孵育5分钟。</li>
	<li>收集未结合的噬菌体。同时采用三种洗脱方法收集已结合的噬菌体。在这些筛选步骤中，必须将所有收集到的噬菌体分别保存，避免混合。
	<ol>
		<li>首先，向每片云母加入50 μl胰蛋白酶（1 mg/ml溶于PBS），孵育时间不超过10分钟。收集溶液并保存。接着，向每片云母加入50 μl 100 mM三乙胺（TEA），孵育时间不超过10分钟。收集溶液，加入等体积的1 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），并保存。</li>
		<li>第三，直接向云母中加入50 μl OD600为0.4的TG1菌液，在37 °C孵育30分钟。同时，将3.3.1步骤中两种洗脱方法收集的噬菌体分别加入100 μl OD600为0.4的TG1菌液中，在37 °C孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用第二片云母重复步骤3.1。</li>
	<li>取第一片ALS TDP-43云母在3.3.2步骤中收集的未结合噬菌体，加入至第二片ALS TDP-43云母上。孵育5分钟。</li>
	<li>对第二组云母重复步骤3.3中的全部操作。</li>
	<li>将两片ALS TDP-43云母经胰蛋白酶洗脱后感染的TG1细胞合并，并涂布于LBA平板上。对经TEA和TG1洗脱的噬菌体感染的TG1细胞同样进行合并涂板，共获得三个平板。 
	注：由于TDP-43同时参与ALS和额颞叶变性（FTD）的病理过程，经过两轮针对ALS TDP-43的正向筛选所获得的部分克隆可能特异性靶向该蛋白，但也可能与FTD相关表位结合。为更有效地分离出仅针对ALS的特异性克隆，可取经过两轮针对FTD TDP-43负向筛选后收集的未结合噬菌体（因这两轮负筛应已去除所有与FTD TDP-43反应的靶点），将其用于在云母表面进行新一轮针对ALS TDP-43抗原的正向筛选（云母上ALS TDP-43的制备方法如前3.3和3.4所述）。</li>
	<li>使用第三片ALS云母重复步骤3.3的全部操作，将感染后的TG1细胞涂布于三个LBA平板中，于37 °C过夜培养。次日计数6个LBA平板上潜在ALS特异性克隆的菌落数量。经过第三轮正向筛选后，三个LBA平板上的潜在ALS克隆菌落数量应少于前两轮正向筛选后的三个LBA平板。</li>
</ol>
4. 针对肌萎缩侧索硬化特异性TDP-43的潜在阳性克隆的培养与噬菌体生产
<ol>
	<li>将6个平板上的每个菌落分别接种于含有100 μl添加1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基的96孔板中，在37 °C摇床中过夜培养。</li>
	<li>次日，从第三轮与ALS TDP-43蛋白进行阳性淘选后的3个LBA平板上挑选克隆，取10 μl转移至含有1 ml添加1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基的微量离心管中。</li>
	<li>向96孔板中的所有培养物加入甘油，使其终浓度为15%，并将96孔板于-80 °C冷冻保存。将1 ml的培养物在37 °C摇床中继续培养2–3小时。</li>
	<li>向各培养物中加入109个KM13辅助噬菌体，37 °C振荡孵育1小时以允许噬菌体感染。随后以3,000 × g离心10分钟，弃去上清液，每管加入1 ml含0.1%葡萄糖、100 μg/ml氨苄青霉素和50 μg/ml卡那霉素的2xYT培养基。</li>
	<li>将细胞在30 °C摇床中过夜培养。以3,300 × g离心30分钟，将上清液转移至新的微量离心管中，每管加入250 μl PEG/NaCl溶液。</li>
	<li>将离心管置于冰上孵育1小时。再次以3,300 × g离心30分钟，弃去上清液，每管加入100 μl PBS缓冲液。</li>
	<li>将离心管置于冰上孵育1小时。以11,600 × g离心10分钟，将上清液转移至新管中。将获得的噬菌体储存于-80 °C。</li>
</ol>
5. 潜在ALS克隆的测序
<ol>
	<li>重复步骤 4.2，于 37 °C 摇床培养过夜。次日，根据试剂盒说明书提取克隆质粒 DNA，并使用相应的正向和反向引物对克隆进行测序。</li>
</ol>
6. 使用间接ELISA筛选针对ALS特异性TDP-43的潜在阳性克隆
<ol>
	<li>向高结合力ELISA板的每个孔中加入100 μl浓度为2.5 μg/ml的ALS、FTD及健康人脑组织样本，用于每种潜在的ALS克隆。在37 °C下缓慢振荡孵育1小时。</li>
	<li>用0.1% PBST洗涤平板3次。每孔加入200 μl含2%脱脂奶粉的PBS溶液，在37 °C下缓慢振荡孵育1小时。</li>
	<li>重复洗涤步骤，然后向各孔加入100 μl以PBS至少1/100稀释的噬菌体溶液。完成孵育和洗涤步骤后，每孔加入100 μl 1/1,000稀释的抗M13 HRP抗体。洗涤平板后，使用ELISA femto化学发光底物试剂盒进行显色检测。</li>
</ol>
7. 使用间接 ELISA 进行 scFv 的生产与筛选
<ol>
	<li>将 HB 2151 菌液培养至 OD600 为 0.4。向 20 μl 的 HB 2151 菌液中加入 5 μl 不同的噬菌体，37 °C 静置孵育 30 分钟，使噬菌体完成感染。将 LBA 平板划分为网格，使每个平板可点种约 20 个克隆。</li>
	<li>将 5–10 μl 经噬菌体感染的菌液点种到平板上，37 °C 过夜培养。次日，挑取单菌落加入含 0.1% 葡萄糖和 100 μg/ml 氨苄青霉素的 1 ml 2xYT 培养基中，37 °C 摇菌 3–4 小时，至 OD600 达到 0.6。</li>
	<li>每管加入 1 μl 的 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30 °C 摇床过夜培养。将菌液以 11,600 × g 离心 10 分钟，收集上清用于 ELISA 检测。</li>
	<li>进行 ELISA 检测时，按照第 6 节中的相同步骤操作，但第 6.5 步中不加噬菌体，改为加入未稀释的 scFv；第 6.6 步中加入 100 μl 1/1,000 稀释的 9e10 HRP。</li>
</ol>
8. 原子力显微镜（AFM）过程
<ol>
	<li>向裂解的云母片上加入 10–20 μl 目标抗原，孵育 5–10 分钟。用去离子水清洗云母片 5 次，然后加入 10–20 μl 噬菌体，继续孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>再次用去离子水清洗云母片 5 次，使其自然风干。利用原子力显微镜（AFM）1 观察噬菌体结合情况。在室温（RT）29 下，使用 Nanoscope IIIa 控制器以轻敲模式（tapping mode）进行 AFM 成像。所用硅探针的共振频率为 300 kHz，弹性常数为 40 N/m。扫描速率为 3.05 Hz，扫描分辨率为 512 点/行。</li>
	<li>对图像进行基础的背景平整处理，以确保同一图像内所有颗粒尺寸具有可比性。由于其他颗粒尺寸和扫描区域的差异，噬菌体的宽度（而非长度）可能在不同图像间有所变化，但这不会影响判断噬菌体是否结合抗原的准确性。</li>
	<li>若在 AFM 验证过程中，每轮阴性淘选所用的噬菌体仍可见于云母片上，则需追加淘选轮次，直至检测不到噬菌体后，再进入下一轮阴性淘选。</li>
</ol>
9. 目标抗原的免疫沉淀
<ol>
	<li>为了分离目标抗原（TDP-43），在离心管中加入 250 μg 脑组织匀浆液（来自运动皮层）、100 μl 抗 TDP-43 多克隆抗体（1:100 稀释）以及 1× STEN 缓冲液，总体积定容至 700 μl28。</li>
	<li>在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育过夜。用 1× STEN 缓冲液洗涤 A/G 琼脂糖微珠 2–3 次，取 25 μl 加入组织混合液中。在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 1.5 小时，随后以 2,000–4,000 rpm 离心 1 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，沉淀物先用 1× STEN 缓冲液洗涤一次，再用 PBS 洗涤五次。向沉淀中加入 40–60 μl 1× STEN 缓冲液，煮沸 5 分钟。待样品冷却后，离心并收集上清液。通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹法验证免疫沉淀过程是否成功30。</li>
</ol>
10. 点印迹分析
<ol>
	<li>将硝酸纤维素膜剪成若干小矩形，每个待测克隆对应一块。分别点加 2 μl ALS、FTD 和健康人脑组织样本至硝酸纤维素膜上，室温完全干燥。</li>
	<li>加入 1–2 ml 含 5% 脱脂奶粉的 PBS 溶液，室温摇床孵育 1 小时。加入 1 ml 每种噬菌体的 1/100 稀释液，4 °C 摇床孵育过夜。用 0.5% PBST 溶液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入 1 ml 抗 M13 HRP 抗体（1/1,000 稀释），室温摇床孵育 1 小时。重复洗涤步骤，然后使用 Western 化学发光检测试剂显影。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

蛋白质变体已被证实参与多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆）的进展1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。分离能够选择性识别这些不同蛋白质变体靶标的抗体，可为研究、诊断乃至潜在治疗此类疾病提供有效的试剂。为获得此类变体特异性抗体，我们开发了一种新颖的生物筛选方法，该方法利用原子力显微镜监测每一步骤的进展。此前采用类似的阴性与阳性生物筛选联用策略，已成功获得可结合寡聚态β-淀粉样蛋白的克隆5。本文进一步拓展该研究，证明我们能够高效地生成选择性结合人脑组织样本中疾病特异性蛋白质变体的试剂。我们已分离出可特异性识别TDP-43变体的形态学特异性试剂，这些变体仅存在于人肌萎缩侧索硬化症脑组织中13,14。未来的研究需进一步表征所靶向的TDP-43变体的性质（如是否发生聚集或修饰）。
在阳性筛选阶段，确保获得针对任意蛋白质变体靶标的噬菌体的关键步骤是确认阴性筛选过程已去除所有可能交叉反应的噬菌体克隆。我们利用原子力显微镜（AFM）成像验证了在每轮阴性筛选过程中，几乎所有结合非靶标抗...

蛋白质变体的存在已被认为是多种疾病进展的因素，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。β-淀粉样蛋白和α-突触核蛋白的寡聚形式分别被认为是导致阿尔茨海默病和帕金森病的毒性物质2,3,4,5。TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的聚集物已被证实与ALS和FTD相关12,13,14。因此，能够选择性靶向不同蛋白质变体的试剂（如抗体）可作为诊断标志物和潜在治疗手段的有力工具。在本研究中，我们专注于开发可选择性结合与ALS相关的TDP-43蛋白变体的试剂，但本文所述技术应适用于分离针对多种蛋白质变体的试剂。
TDP-43 的细胞质聚集已被确定为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理特征15,16,17,18,19。在正常个体的所有细胞中，TDP-43 通常位于细胞核内，尽管其在细胞质与细胞核之间具有一定的穿梭倾向15,17。然而，在 ALS 患者中，可在特定神经元和胶质细胞的细胞质中检测到聚集形式的 TDP-43，同时细胞核内的浓度降低，提示在疾病进展过程中 TDP-43 从细胞核向细胞质转移16,20。尽管大多数 ALS 病例中均存在 TDP-43 的聚集现象，但并非所有病例均由此引起，因为约 1%–2% 的 ALS 总病例（或约 15%–20% 的家族性 ALS 病例）与超氧化物歧化酶 1（SOD1）基因的突变相关15,17。鉴于 TDP-43 在绝大多数 ALS 病例中的重要作用，本文重点开发基于抗体的试剂，旨在利用我们创新的基于原子力显微镜（AFM）的生物淘选技术，选择性结合存在于人类 ALS 脑组织中的 TDP-43 变体。
最初，我们需要一个多样化的抗体结合域文库。我们整合了三个不同的噬菌体展示单链可变区抗体片段（scFv）文库（Tomlinson I、J 和 Sheets 文库21）。筛选过程分为阴性筛选和阳性筛选两个阶段。首先对文库中的噬菌体进行阴性筛选，以去除对多种非靶标抗原有反应性的噬菌体。每轮针对一种非靶标抗原的阴性筛选完成后，通过原子力显微镜（AFM）成像监测该过程，以确保所有与非靶标抗原结合的噬菌体均已被清除。只有在通过AFM成像确认所有反应性噬菌体已被去除后，才进入下一个靶标的筛选。为了筛选出针对与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的TDP-43变异体的试剂，我们采用了以下阴性筛选抗原：1）牛血清白蛋白（BSA），用于去除对蛋白质弱结合或非特异性结合的噬菌体；2）聚集态α-突触核蛋白，用于去除识别聚集蛋白通用结构元件的噬菌体；3）人脑组织匀浆物，用于去除结合于健康人脑尸检样本中任何蛋白质或其他成分的噬菌体；4）从健康人脑组织中免疫沉淀获得的TDP-43，用于去除结合所有与健康人脑相关的TDP-43形式的噬菌体；以及5）从额颞叶变性（FTD）脑匀浆物中免疫沉淀获得的TDP-43，用于去除结合与非ALS病理相关的TDP-43变异体的噬菌体。在彻底去除所有对非靶标抗原有反应性的噬菌体后，我们进入阳性筛选阶段，分离能够结合目标抗原的抗体片段，此处的目标抗原为从人ALS脑组织中免疫沉淀获得的TDP-43。这些分离得到的抗体可能识别TDP-43的聚集态或修饰态形式。
传统的噬菌体生物淘选主要关注正向淘选阶段22,23。通常将感兴趣的靶标固定，加入噬菌体文库并洗脱结合的噬菌体。随后扩增这些噬菌体并再次加入靶标中。该扩增与孵育过程通常重复数次，以提高阳性结合噬菌体的比例。尽管该方法的多种变体已被广泛用于筛选针对多种靶抗原的抗体试剂，但通常需要大量纯化的靶抗原24,25,26,27，而我们的方法仅需痕量的靶抗原。本文所述的方案可用于筛选出选择性结合极低浓度靶抗原的试剂，无需对抗原进行纯化，且淘选可直接针对复杂组织样本中存在的抗原进行。通过原子力显微镜（AFM）验证的彻底的负向淘选方案可确保所筛选出的克隆即使在靶抗原未纯化或未富集的情况下，也能实现选择性结合。
Kasturirangan 及其同事（2003 年）曾采用类似的阴性和阳性生物筛选方法，利用纳克浓度的目标蛋白分离出可与寡聚态 β-淀粉样蛋白发生反应的抗体5。本文在此基础上进行了拓展，以实现直接从人类组织样本中生成可选择性结合疾病特异性蛋白变体的试剂。在后续研究中，我们不仅计划进一步探究所分离试剂的诊断价值，还将评估其在治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）方面的治疗相关性。
总体而言，我们这种新型的基于原子力显微镜（AFM）的生物筛选技术，无需蛋白质纯化或修饰，即可适用于从任何生物材料中分离特定疾病的蛋白质变体，即使目标抗原的浓度极低也能实现。

<table><tbody><tr><td>汤姆林森 I 型和 J 型文库</td><td>MRC（剑桥，英格兰）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>希茨文库</td><td>MRC（剑桥，英格兰）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Amresco</td><td>0188-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>KM13 辅助噬菌体</td><td>MRC（剑桥，英格兰）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Macron</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Amresco</td><td>0404-1KG</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>EMD</td><td>PX1405-1</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Amresco</td><td>0781-500G</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>TG1 细胞</td><td>MRC（剑桥，英格兰）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂培养基</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>STEN 缓冲液</td><td>Crystalgen 公司</td><td>33429775</td><td></td></tr><tr><td>免疫管</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>云母</td><td>Spruce Pine Mica</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T-0303</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma</td><td>T-0886</td><td>易燃物</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>质粒 DNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔高结合 ELISA 板</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>抗 M13 HRP 抗体</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 化学发光底物试剂盒（Femto）</td><td>Thermo Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>抗 TDP-43 多克隆抗体</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>蛋白 A/G 琼脂糖微珠</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 细胞</td><td>MRC（剑桥，英格兰）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙基硫代半乳糖苷</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>易燃物</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope IIIa 原子力显微镜</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜探针</td><td>VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

基于新型原子力显微镜生物筛选技术分离肌萎缩侧索硬化中tdp-43变异体形态特异性试剂

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

由于蛋白质变体在多种疾病中发挥关键作用，例如TDP-43在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中、α-突触核蛋白在帕金森病中，以及β-淀粉样蛋白和tau蛋白在阿尔茨海默病中，因此开发能够选择性靶向这些疾病特异性蛋白质变体的形态特异性试剂至关重要，可用于研究这些变体在疾病病理中的作用，并具有潜在的诊断和治疗应用价值。我们已开发出基于原子力显微镜（AFM）的新型生物筛选技术，可分离出选择性识别疾病特异性蛋白质变体的试剂。该过程包含两个关键阶段：阴性筛选和阳性筛选阶段。在阴性筛选阶段，通过多轮减法筛选，利用一系列精心选择的非靶标抗原去除与非靶标抗原发生反应的噬菌体。阴性筛选阶段的一个关键特征是利用AFM成像对筛选过程进行监测，并确认所有非期望的噬菌体颗粒均已被清除。在阳性筛选阶段，将目标抗原固定在云母表面，洗脱并筛选结合的噬菌体，以鉴定能够选择性结合目标抗原的噬菌体。只要使用了适当的阴性筛选对照，目标蛋白质变体无需预先纯化。即使在复杂生物材料中仅以极低浓度存在的目标蛋白质变体，也可用于阳性筛选步骤。通过该技术的应用，我们已获得针对TDP-43蛋白质变体的抗体，这些变体选择性地存在于人类ALS脑组织中。我们预计，本方案适用于生成可选择性结合多种不同生物过程和疾病中蛋白质变体的试剂。

在 图1示意图展示了我们利用免疫管通过负向筛选去除文库中与脱靶抗原结合的噬菌体的过程。我们首先使用牛血清白蛋白（BSA）进行筛选，因为BSA是一种常用的封闭剂，任何会非特异性结合该靶标的噬菌体在后续的免疫检测中均可能造成干扰。随后，我们去除了与聚集态α-突触核蛋白结合的噬菌体，以消除那些对聚集蛋白的通用结构具有反应性的噬菌体即， 一种可与聚集态α-突触核蛋白、TDP-43、Aβ发生交叉反应的抗体 等等。）。原子力显微镜结果表明，在针对聚集态α-突触核蛋白进行一轮负向筛选后，噬菌体发生了结合图2A）且经过8轮后无结合图2B随后，我们使用健康人脑组织进行阴性淘选，以去除能够结合健康人脑匀浆中多种抗原的噬菌体。 图2C 显示噬菌体在经过1轮负向筛选后仍结合健康组织，而在经过10轮负向筛选后无噬菌体残留结合（图 2D）。由于可用于筛选的健康对照和额颞叶变性（FTD）免疫沉淀TDP-43蛋白的量较少，使用云母片而非免疫管可减少反应体积，从而降低...

通过结合原子力显微镜与生物淘选技术，我们建立了一套针对任意生物样本中疾病特异性蛋白质变体（即使浓度较低）的阴性和阳性生物淘选系统，成功获得了针对肌萎缩侧索硬化症相关TDP-43蛋白变体的抗体。

基于新型原子力显微镜生物筛选技术分离肌萎缩侧索硬化中TDP-43变异体形态特异性试剂

由于蛋白质变体在多种疾病中发挥关键作用，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）中的TDP-43、帕金森病中的α-突触核蛋白……

本实验的总体目标是利用基于两相放射性淘选技术，针对存在于LS系统中的43种tar DNA结合蛋白变体，分离出具有形态特异性的试剂。该过程首先通过免疫管对一个多样化的噬菌体文库进行多轮针对非靶标抗原的负向淘选。依次针对牛血清白蛋白、聚集态α-突触核蛋白和健康人脑组织进行阴性淘选。第二步是在每轮阴性淘选后完成荧光显微镜验证，以确保所有非目标噬菌体被成功去除。在此阴性淘选示例中，使用聚集态α-突触核蛋白时，经过一轮淘选后仍可见噬菌体，但在第10轮后已无噬菌体存在。接下来，由于样本量有限，剩余的负向筛选轮次在 MICA 上进行。依次去除与来自健康组织和额颞叶痴呆（FTD）组织的免疫沉淀 TDP 43 发生反应的噬菌体。最后一步是分离能够结合 a LS 免疫沉淀物的噬菌体。使用结合云母的噬菌体展示TDP-43，通过胰蛋白酶、三乙胺和TG1细胞进行筛选。最终，通过间接ELISA和点印迹法验证这些潜在ALS克隆的特异性，其中将ALS-FTD和健康人脑组织匀浆分别固定于两种检测体系中。通常检测到对ALS组织的反应性高于其他测试组。与传统的噬菌体生物淘选技术相比，该方法的主要优势在于采用了全面的阴性淘选流程，并通过荧光显微镜（FM）验证，从而确保能够直接从复杂的生物样本中分离出选择性识别疾病特异性蛋白质变体的试剂，即使这些变体的浓度很低也能实现。尽管荧光显微镜（FM）可用于研究生物分子特征及其相互作用，但它也可应用于其他系统，例如监测生物淘选过程的进展以及确认单个CLO的特异性。本实验首先按照文本方案进行噬菌体的制备，随后针对BSA进行阴性淘选，加入四毫升浓度为一毫克每毫升的溶液。将牛血清白蛋白（BSA）溶液用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后加入12个免疫管中，于4摄氏度孵育过夜。接下来，混合来自三个文库的噬菌体颗粒，并保留少量该噬菌体混合物，用于后续验证阴性筛选过程。然后弃去第一管中的BSA溶液，用PBS洗涤2至3次以去除未结合的BSA，向第一管中加入合并的噬菌体文库，在旋转摇床上室温孵育30分钟，随后收集未结合的噬菌体。请注意，在完成针对每个靶标的多轮负向筛选后，务必保存少量噬菌体，以验证筛选过程是否成功；若发生污染，可使用剩余的BSA溶液管重复进行负向筛选。每次使用前一管孵育后收集的未结合噬菌体。随后，利用视频下一节中详细介绍的AFM方法，验证是否已完全去除所有能与BSA结合的噬菌体。 为了使用荧光显微镜（FM）观察噬菌体结合情况，将10至20微升的目标抗原加入到裂解的云母片上，孵育5至10分钟。用去离子水清洗云母片五次，然后加入10至20微升的噬菌体溶液至云母片上，继续孵育5至10分钟。再次用去离子水清洗云母片五次，随后在空气中自然干燥。 在室温空气中，使用纳米扫描仪三号控制器，以轻敲模式执行原子力显微成像。硅基原子力显微镜探针的共振频率为300千赫兹，弹性系数为40牛顿每米。将原子力显微镜针尖插入针尖装载器中。将探针装载器连接到原子力显微镜（AFM）上。将样品置于原子力显微镜（AFM）下。使用调节旋钮将激光对准原子力显微镜（AFM）探针。将扫描速率设置为 3.05 赫兹，扫描分辨率为每线 512 个采样点。自动调谐仪器以优化二氧化硅振动。启动探针频率，开始样品扫描。探针将扫描MICA表面，测量结合的噬菌体的高度。噬菌体在图像中呈现为长的白色条带，通过基本的背景平整化处理图像，以确保每张图像内的所有颗粒大小具有可比性。由于其他颗粒的大小和扫描区域的不同，噬菌体的宽度可能在不同图像间有所变化，但这不会影响判断噬菌体是否与抗原结合的准确性。将图像展平为二维图像，并标出因聚乙二醇（PEG）污染导致成像质量较差的区域，以便在后续数据分析中予以剔除。根据文本方案所述，从健康人脑组织中免疫沉淀出足量的健康TDP-43蛋白，但由于免疫沉淀蛋白的产量较低，需进行后续操作。首先使用MICA进行多轮阴性筛选：将八个MICA表面与第一个MICA结合，加入约100微升（µL）免疫沉淀蛋白溶液，在室温下孵育5至10分钟。孵育结束后继续后续步骤。用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗云母片五次。然后，在对健康人脑组织进行阴性筛选后，向云母片中加入约100微升噬菌体，并在室温下孵育5至10分钟。在孵育中途，将免疫沉淀的蛋白质加入第二片云母片中。在用 0.1% PBST 清洗 MICA 五次之前，先收集第一次的噬菌体。清洗第二块云母片后，加入先前收集的噬菌体。重复整个过程，直至噬菌体针对所有八块带有免疫沉淀蛋白的云母片完成负相筛选。使用噬菌体在完成第一轮和第八轮阴性淘选后，通过 FM 验证淘选过程的成功，并按照文本方案所述，从肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的脑组织中开始免疫沉淀 TDP-43 蛋白，裂解三块 MICA 表面。随后，在室温孵育 5 分钟后，向第一块 MICA 表面加入 50 微升 ALS TDP-43。用 0.1% PBST 清洗 MICA 表面五次。接下来，将阴性筛选健康TDP 43后收集的50微升噬菌体加入MICA中，孵育5分钟。收集未结合的噬菌体。在这些筛选步骤中，必须将所有收集的噬菌体分别保存。接下来，使用三种洗脱方法收集结合的噬菌体。首先，向每个 MICA 中加入 50 微升胰蛋白酶，孵育时间不超过 10 分钟。收集溶液并保存。接下来，向每个 MICA 中加入 50 微升 100 毫摩尔的三乙胺，并孵育不超过 10 分钟。用等体积的 1 摩尔 Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）收集溶液。第三步，向 MICA 中直接加入 50 微升 TG1 细胞，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。同时，将前两种洗脱方法收集的噬菌体以相同浓度加入 100 微升 TG1 细胞中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。接着，用第二片MICA重复此过程。取用第一片带有A-L-S-T-D-P 43的MICA收集到的未结合噬菌体，加入到第二片带有A-A-L-S-T-D-P 43的MICA中，孵育5分钟。将感染了噬菌体的TG1细胞从每片A-L-S-T-D-P 43 MICA中用胰蛋白酶消化后收集，并涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板（LBA平板）上。对两组 A LS TDP 43 MICA 中的三乙胺和 TG one 全长噬菌体重复上述过程，共制备三块平板。使用第三块 A LS 云母片重复所有步骤，但在本情况下，使用经过两轮针对额颞叶痴呆的阴性淘选后收集的噬菌体。将感染的 TG one 细胞接种至三块 LBA 平板上，并在 37 摄氏度下过夜培养。第二天，对六块 LBA 培养板上潜在的 a LS 克隆菌落数量进行计数。经过三轮 A LS MICA 筛选的三块 LBA 培养板上的菌落数量应少于经过两轮阳性筛选（利用噬菌体进行）后的三块 LBA 培养板。在对健康 TDP 43 进行阴性筛选后，从这些克隆中产生噬菌体以及可溶性单链可变区抗体片段（s cvs），并通过不同的免疫检测方法进行分析，以验证其对 a LS 组织的特异性。采用FM成像技术监测针对不同靶标的负向筛选步骤，以确保去除所有具有反应性的噬菌体。FM结果显示，在针对聚集态α-突触核蛋白进行一轮负向筛选后出现噬菌体结合信号，而经过八轮筛选后则无结合信号。通过针对健康人脑组织进行负向筛选，以去除可结合健康人脑匀浆中多种抗原的噬菌体。图中显示，经过一轮负向筛选后，噬菌体仍结合健康组织，而经过十轮负向筛选后，已无噬菌体结合。在制备出潜在克隆的噬菌体和可溶性SCFE后，通过间接ELISA检测其对LS组织的特异性。几乎所有噬菌体均表现出对LS组织的偏好性，而非健康组织。在比较噬菌体与额颞叶变性（FTD）组织中a LS的结合时，获得了类似的结果。对SCFV在健康组织和FTD组织中a LS结合的比较再次显示，几乎所有克隆均表现出对a LS组织的选择性结合。采用点印迹免疫测定法进一步验证了对a LS组织的结合，并确定哪些克隆在其他免疫学应用中具有反应性。此处展示的是一个结合物与LS组织的结合。观看本视频后，您应能充分理解如何应用基于FM的生物淘选技术来分离针对疾病特异性目标靶点的试剂，这些试剂可能作为潜在的诊断和/或治疗工具。

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科研

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Bioengineering

生物工程

新型原子力显微镜基于生物淘选的形态特殊试剂对TDP-43变型肌萎缩侧索硬化症隔离

来源：Williams, S. M. et al. 利用新型基于原子力显微镜的生物淘选技术分离肌萎缩侧索硬化症中TDP-43变体的形态特异性试剂。J. Vis. Exp.

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