新型原子力显微镜基于生物淘选的形态特殊试剂对TDP-43变型肌萎缩侧索硬化症隔离

该程序的总体目标是分离针对 tar DNA 结合蛋白的形态特异性试剂。LS 中存在 43 个变体，利用基于两阶段 A FM 的无线电平移技术。这是通过首先使用免疫管对不同的噬菌体文库进行针对脱靶抗原的多轮阴性淘选来实现的。

依次对牛血清白蛋白、聚集的 α 突触核蛋白和健康人脑组织进行阴性淘选。第二步是在每组阴性淘选后完成 FM 验证，以确保成功去除所有不需要的噬菌体。在这个阴性平移示例中，使用聚集的 α 突触核蛋白噬菌体在一轮后可见，但在第 10 轮后消失。

接下来，由于样品可用性有限，其余的负选区将在 MICA 上执行。依次去除来自健康和额颞叶痴呆或 FTD 组织的免疫沉淀 TDP 43 的噬菌体。最后一步是分离与沉淀的 LS 免疫结合的噬菌体。

使用云母结合噬菌体的 TDP 43 是指使用胰蛋白酶、三乙基、胺和 TG one 细胞。最终，这些潜在的 A LS 克隆的特异性使用间接 fa eliza's 和斑点印迹验证，匀浆 A-L-S-F-T-D 和健康的人脑组织在两种测定中都被固定。与其他测试组相比，通常会检测到对 LS 组织更大的反应性。

与传统噬菌体生物淘选相比，该技术的主要优点是使用经 FM 验证的详尽的阴性淘选方案，以确保直接从复杂生物样品中分离出能够选择性识别疾病特异性蛋白质变体的试剂，即使以低浓度存在。虽然 FM 可以提供研究生物分子特征和相互作用的见解，但它也可以应用于其他系统，例如监测生物填充的进度和确认单个 CLO 的特异性。按照文本方案中的详细说明，从噬菌体生产开始此过程，首先对 BSA 进行负平移，每毫升添加 4 毫升 1 毫克。

将磷酸盐缓冲盐水或 PBS 中的 BSA 溶液加入 12 个免疫管中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。接下来，合并来自三个文库中每个文库的噬菌体颗粒，留出少量这种噬菌体混合物，以备将来验证阴性淘选过程。然后丢弃第一管中的 BSA 溶液，用 PBS 洗涤试管 2 到 3 次以去除任何未结合的 BSA，将组合的噬菌体文库添加到第一管中，在室温下在旋转器上孵育 30 分钟，然后收集未结合的噬菌体。

请记住，在完成针对每个靶标的多轮负向淘选后，保存少量噬菌体以验证淘选过程是否成功，并且在发生污染的情况下，每次使用剩余的 BSA 溶液试管重复负向淘选过程。使用前一个试管孵育后收集的未结合的噬菌体。然后使用视频下一节中详述的 A FM 程序验证去除所有 BSA 噬菌体结合物。

要使用 FM 观察噬菌体结合，将 10 至 20 μL 靶抗原添加到裂解的云母中，并孵育 5 至 10 分钟。用水洗涤 MICA 五次，然后向 MICA 中加入 10 至 20 微升噬菌体，孵育 5 至 10 分钟。用水再清洗云母五次，然后风干。

使用 FM 轻敲模式和纳米内窥镜三、控制器在室温下在空气中执行 FM 成像过程。硅 A FM 探头的谐振频率为 300 kHz，弹簧常数为每米 40 牛顿。将 a FM 吸头插入吸头加载器。

将吸头装载器连接到 A FM 显微镜。将样品置于 A FM 显微镜下。使用旋钮将激光器对准 A FM 尖端。

将扫描速率设置为 3.05 赫兹，将扫描分辨率设置为每行 512 个样本。自动调整机器以优化二氧化硅振动。提示的频率，启动样品扫描。

尖端将扫描 MICA 的表面，测量结合噬菌体的高度。噬菌体是采集后的长白线，通过基本展平背景来处理图像，以确保每个图像中的所有颗粒大小都可比。由于其他粒径和扫描区域，噬菌体宽度可能因图像而异，但它绝不会影响噬菌体是否与抗原结合的准确性。

图像被展平为 A 2D 图像，并突出显示由 PEG 污染引起的成像不良区域，以便从未来的数据分析中删除。由于免疫沉淀蛋白的数量较低，如文本方案中所述，免疫从健康人脑组织中沉淀健康的 TDP 43 蛋白。首先使用 MICA 进行这些轮次阴性淘选：在大约 100 μL 的免疫沉淀蛋白中将八个 MICA 表面切割到第一个 MICA，并在孵育后在室温下孵育 5 至 10 分钟。

用 0.1% 磷酸盐缓冲盐水和 tween 20 缩写 PBST 洗涤 MICA 五次。然后在对健康人脑组织进行阴性淘选后加入大约 100 微升噬菌体，并在室温下孵育 5 至 10 分钟。在孵育中途，将免疫沉淀蛋白添加到第二个云母中。

从第一个 MICA 中收集噬菌体，然后用 0.1% PBST 洗涤 MICA 五次。洗涤第二个云母后，加入先前收集的噬菌体。重复整个过程，直到噬菌体与免疫沉淀蛋白对所有八个云母进行阴性淘选。

在第一轮和第八轮阴性淘选后，使用 FM 验证使用噬菌体的淘选过程是否成功，以开始免疫沉淀 TDP 43 蛋白来自 LS 个体的大脑，如文本方案中所述，切割三个 MICA 表面。然后在室温下孵育 5 分钟后，向第一个 MICA 中加入 50 μL A LS TDP 43。用 0.1% PBST 洗涤 MICA 五次。

接下来，将 50 微升针对健康 TDP 43 进行阴性淘选后收集的噬菌体添加到 MICA 中，并孵育 5 分钟。收集未结合的噬菌体。重要的是将这些淘选步骤中收集的所有噬菌体分开保存。

接下来，使用三种 Elucian 方法收集结合的噬菌体。首先，向每个 MICA 中加入 50 μL 胰蛋白酶，孵育不超过 10 分钟。收集解决方案并保存。

接下来，向每个 MICA 中加入 50 微升 100 毫摩尔三乙胺，孵育不超过 10 分钟。收集等体积的 1 摩尔 tris HCL 缓冲液 pH 7.4 并保存第三个，将 50 微升 TG one 细胞直接添加到 MICA 中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。此外，将从前两种 Elucian 方法收集的噬菌体加入 100 微升相同浓度的 TG one 细胞中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

接下来，使用第二个 mica 重复此过程。使用含 A LST DP 43 的第一个 MICA 取收集的未结合噬菌体，并将其加入含 A-A-L-S-T-D-P 43 的第二个 MICA 中，孵育 5 分钟。将用噬菌体感染的 TG one 细胞混合，与来自每个 A LST DP 43 MICA 的胰蛋白酶和板一起放在所有带有氨苄青霉素或 LBA 板的 luria burani 螺旋板上。

对来自两组 A LS TDP 43 MICA 的三乙胺和 TG 一指噬菌体重复相同的过程，总共三个板。用第三个 A LS 云母重复所有步骤，但是，在这种情况下，使用在针对额颞叶痴呆的两轮负平移后收集的噬菌体。T DP 43 将感染的 TG 1 细胞铺在三个 LBA 板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天。计算具有潜在 a LS 克隆的六个 LBA 平板上的菌落数。与三个 LBA 板相比，来自第三个 A LS、MICA 的三个 LBA 板上的菌落应该更少，在两轮阳性淘金后利用噬菌体对健康的 TDP 43 进行阴性淘选，从这些克隆中产生噬菌体和可溶性单链可变结构域抗体片段或 s cvs，并使用不同的免疫测定进行分析以验证对 LS 组织的特异性。

FM 成像用于监测针对各种靶标的阴性淘选步骤，以确保去除所有反应性噬菌体。A FM 结果显示，在对聚集的 α 突触核蛋白进行一轮阴性淘选后，噬菌体结合，八轮后没有结合。对健康人脑组织进行阴性淘选，以去除与健康人脑匀浆中存在的许多抗原结合的噬菌体。

此处显示的是 1 轮阴性淘选后噬菌体与健康组织的结合，10 轮阴性淘选后没有噬菌体留下结合。从潜在克隆中制备噬菌体和可溶性 SCFE 后，在间接 Eliza 中测试它们对 LS 组织的特异性。几乎所有噬菌体都表现出对 LS 组织而不是健康组织的偏好。

当比较噬菌体与 LS 与额颞叶痴呆或 FTD 组织的结合时，可以获得类似的结果。健康和 FTD 组织中 SCFV 与 LS 组织结合的比较再次显示，几乎所有克隆都选择性地结合 LS 组织。斑点印迹免疫测定用于进一步验证与 LS 组织的结合，并确定哪些克隆在其他免疫学应用中具有反应性。

此处显示了克隆两个与 LS 组织的结合。观看此视频后，您应该对如何应用基于 FM 的生物平移来分离针对疾病、特定目标靶标的试剂、试剂有很好的了解，这些试剂可能用作潜在的诊断和/或治疗工具。