基于探针的实时PCR方法用于microRNA的定量检测

以下实验的总体目标是演示三种基于探针的实时PCR方法，用于定量血浆和血清样品中的微小RNA。基于探针的实时PCR通过水解并检测带有荧光标记的探针来实现，该探针包含一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当下游DNA聚合酶从上游引物延伸并到达探针的5'端时，会导致荧光发射基团与淬灭基团发生物理分离。

随后，会释放出一个荧光分子Four，该信号被检测器记录，并表现为该反应荧光信号的逐步增加。最终，可通过荧光信号的增加量来测定PCR产物的生成量，从而实现对目标扩增片段的精确定量。该方法正逐渐成为发现多种癌症及其他疾病（如糖尿病）新型生物标志物的有前景的技术。

尽管该方法可用于研究血清和血浆中microRNA的丰度，但也适用于其他样本，如外周细胞和组织。本方案的可视化演示至关重要，因为封合纳米流控芯片载玻片的某些步骤仅通过阅读方案难以掌握。对于基于探针的实时定量PCR成熟microRNA检测，需将4.2微升的单个QPCR试剂混合液加入光学96孔板的每个孔中，随后加入0.8微升适当的新鲜配制的cDNA反应液。用相应的光学封板膜密封反应板，然后在实时PCR系统上启动QPCR反应。

为制备起始投入量为1至1000纳克总RNA的微流控阵列芯片，首先将池A和池B引物缓冲液、脱氧核苷三磷酸、氯化镁以及RNA抑制剂置于冰上解冻。随后进行逆转录反应，将每种RNA样本各100纳克分装至池A或池B的离心管中，再加入适量无核酸酶水，使每管总体积达到3微升。接下来，向相应的对应管中分别分装4.5微升适当的逆转录试剂混合液。

然后将样品放入热循环仪中，开始反转录。在反转录进行的同时，当样品准备就绪后，将预先定义的预扩增引物混合物在冰上解冻，用于总RNA样品输入量在1至350纳克之间的情况，并分装22.5微升相应的预扩增试剂。

将池A和池B管中的试剂混合，然后向每个管中加入2.5 µL反转录得到的cDNA样品。接着将样品加入热循环仪，开始预扩增循环。循环结束后，向预扩增的cDNA中加入75 µL 0.1× Tris-EDTA缓冲液，用于加载微流控芯片。

接下来，向9微升稀释后的PREPL扩增cDNA（使用引物池A制备）中加入450微升QPCR试剂混合液，用于卡片A，并加入441微升无核酸酶水，最终体积为900微升。待其达到室温后，从包装中取出TaqMan低密度阵列卡，将铝箔面朝下放置于洁净区域。加入100微升PCR反应液。

将液体分别加入芯片上的八个加样口。在室温下以331 ×g离心1分钟。然后以缓慢、稳定且连续均匀的动作，将推杆沿芯片推至封膜仪终点位置。

取出密封的阵列卡并剪掉储液池。然后确认微流控阵列实时 PCR 系统中已安装正确的加热盖块和样品载体。为加载纳米流控阵列，需将稀释后的 prepl、扩增的 cDNA 以及 TaqMan 实时 QPCR 试剂解冻。

轻轻旋转混匀QPCR试剂瓶。随后，将22.5 µL QPCR试剂混合液加入22.5 µL稀释后的预扩增cDNA中。然后，将每个样本5 µL分别加入纳米流体阵列工作流程384孔样本板的八个孔中，注意将每个样本的Pool A和Pool B分别置于指定位置。

当所有样品均转移至相邻的八孔板后，用开放式阵列样品板封膜将板的每个区域覆盖。随后，将第一张纳米流体阵列芯片在室温下解冻约15分钟。确认纳米流体阵列系统中已安装正确的模块编辑盖和样品载体，然后轻轻拉动浸没液注射器的推杆以松开活塞。

取下盖子，安装好吸头，并将吸头中的空气排净。然后将加样系统吸头放入加样系统中。打开盖子，将样本板放入加样系统内。

现在戴上一副贴合紧密的手套。小心打开载玻片包装，缓慢将载玻片从包装中倾倒出来，切勿触碰其上表面。将载玻片放入加载系统中，确保条形码位于左侧。

然后移除样本板上用于加样区域的封条，并使用加样系统软件输入载玻片条形码、载玻片位置、样本位置和吸头配置。在载玻片加样过程中，取下载玻片盖底部的透明和红色塑料片。加样过程结束后，需在90秒内小心取出载玻片并进行密封。

将载玻片放入板卡夹中，并将盖板盖在载玻片上保持30秒，确保盖板位置正确，条形码可清晰显示。然后将浸没液注射器置于载玻片内，使针头轻抵盖板，缓慢注入浸没液，注意使液体沿盖板流下。待载玻片充满后，用塞子密封，并旋转螺钉直至手柄断裂脱落。

最后，取下盖板顶部的塑料覆盖膜，小心地将载片放入实时 PCR 系统的载片架中。放置时应支撑载片底部，避免触碰载片顶部。随后启动 PCR 系统，并在加样后一小时内开始定量 PCR 程序。

采用该方法，5 微升的反应体系可获得与 20 微升体系相似的结果，且具有高度相关性。在最多 39 个循环内，对同一份样本使用微流控阵列卡片检测全部 754 种微小 RNA（microRNA）时，如上所述，两条实验路径中 CT 值介于 0 至 19.99 之间的微小 RNA 也表现出相似的表达水平，其决定系数达 98%。此外，当选择 CT 值在 30 至 40 范围内的微小 RNA 时，两条实验路径间存在显著差异的微小 RNA 数量增加。在该图中，展示了纳米流控阵列平台对全部 754 种微小 RNA 的检测数据。

必须分析扩增曲线，以确保结果能够反映真实的扩增情况。还应检测内参微小RNA（如U six）是否存在变异。例如，在本图中，U six重复样本呈现出典型的聚集模式，标准差较低，表明数据具有可靠性。

最后，这些数据表明在第二个样本中，U six 重复实验的变异性增加。基于探针的高通量技术，例如微流控和纳流控芯片阵列，能够在极短时间内对大量样本中的多种 microRNA 表达丰度进行可重复且高效的检测。每种工作流程均根据待分析的 microRNA 靶标数量和样本数量，设计用于满足不同的通量需求。

观看本视频后，您应能充分理解如何开展基于探针的不同实时荧光定量 PCR 技术，以检测主要的微小核糖核酸（microRNA）丰度。