Name: 基于探针实时荧光定量PCR途径的小分子RNA定量检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学习基于探针的实时荧光定量PCR方法，用于血浆和血清样本中微小RNA的精确定量检测。该技术为癌症、糖尿病等疾病的新型生物标志物发现提供了高效可靠的研究工具。

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所有作者均感谢澳大利亚国家健康与医学研究委员会临床试验中心（NHMRC CTC）、悉尼大学、澳大利亚青少年糖尿病研究基金会（JDRF）以及澳大利亚Rebecca Cooper基金会提供的基础设施支持。本研究由澳大利亚研究理事会（FT110100254）和澳大利亚JDRF（CRN201314）提供的资助支持。WW和RJF、MVJ完成了全部湿实验工作，ASJ进行了数据分析。WW撰写了初稿。AAH负责研究设计和数据分析。所有作者均阅读并同意提交发表的论文终稿、图表及工作表内容。

可以使用我们实验室建立的方案30或其他市售试剂盒从血清中分离总RNA。
注意：提供了用于计算每个实验中反应体积的补充交互式电子表格（已包含移液时计入的5%过量体积）。
1. 使用标准96孔板平台进行基于探针的实时定量PCR
<ol>
	<li>miRNA 的 cDNA 合成（逆转录）操作（针对血清/血浆 RNA 样本）
	<ol>
		<li>计算并取出每个 cDNA 合成反应所需的 10 ng RNA。加入无核酸酶水，使 10 ng RNA 的终体积达到 1.67 µl（用于 5 µl 反应体系）。将样本置于冰上保存。</li>
		<li>选择目标 miRNA 并解冻其逆转录（RT）引物。</li>
		<li>解冻 RT 试剂混合液的各组分：RT 缓冲液（10X）、dNTPs（100 mM）、RNase 抑制剂（20 U/µl）。切勿将酶（重组莫洛尼鼠白血病病毒（rMoMuLV）逆转录酶（50 U/µl））置于冰上。应将其保存在 -20 °C 或冷冻块中，直至使用时取出。</li>
		<li>按照 表 1A 所述，在冰上配制 RT 试剂混合液。建议额外多配制至少 5% 的体积，以补偿移液误差。</li>
		<li>向每根 0.2 ml PCR 管或孔板中加入 2.33 µl RT 试剂混合液。</li>
		<li>涡旋混匀 RT 引物管，然后在 10,000 x g 下短暂离心 10 秒。向对应的 PCR 管或&#160;孔板中加入 1 µl 特异性 miRNA RT 引物。向对应的 PCR 管或&#160;孔板孔中加入 1.67 µl 稀释后的 RNA。所有加样操作均需在冰上进行。</li>
		<li>将反应管或孔板在 4 °C 下以 1,950 x g 离心 5 分钟&#160;。</li>
		<li>在热循环仪上设置 miRNA cDNA 合成程序，条件如下：16 °C 反应 30 分钟，42 °C 反应 30 分钟，85 °C 反应 5 分钟&#160;，然后 4 °C 保存。</li>
		<li>设定反应体积为 10 µl。将反应管或孔板放入热循环仪中，启动 RT 程序。若不立即进行实时 PCR 扩增，则将 cDNA（RT）反应产物保存于 -20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于探针的实时定量 PCR（qPCR）检测成熟 miRNA
	<ol>
		<li>解冻针对相应 RT 产物的选定探针型 qPCR 检测试剂（20X）。</li>
		<li>通过轻轻旋转瓶身混匀专有的实时 PCR 溶液（qPCR 试剂混合液）。</li>
		<li>为每种待分析的 miRNA 配制 qPCR 试剂混合液。配制时，为每种 miRNA 样本取一个无菌的 1.5 ml 微量离心管，并按照 表 1B 所述向各管中加入相应组分。建议额外多配制至少 5% 的体积，以补偿移液误差。</li>
		<li>向光学 96 孔板（或 PCR 管）的每个孔中加入 4.2 µl 对应的 qPCR 试剂混合液。向每个孔中加入 0.8 µl 对应的 cDNA 反应产物（即步骤 1.1 中合成的各 miRNA cDNA）。</li>
		<li>使用合适的光学密封膜封板。将板（或管）在 4 °C 下以 1,950 x g 离心 5 分钟&#160;。</li>
		<li>开启计算机、96 孔板/微流控芯片读取仪，然后启动软件。确保仪器正确连接，并确认使用了正确的反应模块和加热盖（适用于快速 96 孔板）。</li>
		<li>选择实验类型为“快速 96 孔板模块（0.1 ml）”、“标准曲线”、“TaqMan 试剂”和“快速模式”。在实时 PCR 系统上设置 qPCR 程序，循环条件如下：95 °C 预变性 20 秒，进行 50 个循环（95 °C 变性 1 秒，60 °C 退火延伸 30 秒）。</li>
		<li>设定反应体积为 10 µl。将反应管或板放入仪器中，点击“开始运行”。程序运行时间约为 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基于探针的微流控阵列芯片（芯片A和B）
注意：基于探针的 miRNA 检测面板包含两块 384 孔微流控芯片（芯片 A 和芯片 B）。每块芯片上含有针对多达 380 种 miRNA 及对照的干燥引物和探针。针对芯片 A 或芯片 B 的 cDNA 产物（无论是否经过预扩增）需分别加载至对应的芯片中进行实时 PCR 检测。
<ol>
	<li>逆转录（RT）
	<ol>
		<li>本方案适用于总RNA输入量为1-1,000 ng的情况。若输入量在1-350 ng之间，需进行预扩增（pre-amp）步骤；若输入量超过350 ng，则可将cDNA直接上样至阵列卡片，无需预扩增。 
		注意：进行血清miRNA谱型分析时，起始总RNA量为100 ng。如需完整的miRNA谱型，每个样本需运行两组预定义的RT引物池（Pool A和Pool B）的逆转录反应。</li>
		<li>将以下试剂在冰上解冻：RT引物（10倍浓度）：Pool A和Pool B、含dTTP的dNTPs（100 mM）、RT缓冲液（10倍浓度）、MgCl2（25 mM）、RNase抑制剂（20 U/µl）。酶（重组莫洛尼鼠白血病病毒（rMoMuLV）逆转录酶（50 U/µl））不得置于冰上，应保存在-20 °C直至使用。</li>
		<li>除酶以外的所有试剂轻轻涡旋混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。</li>
		<li>按照表2A所述，将试剂分别加入两个离心管中：一管用于Pool A，另一管用于Pool B。每管仅包含一组预定义的RT引物池（Pool A或Pool B）。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。</li>
		<li>颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。取100 ng各RNA样本分装至新管中，再加入适量无核酸酶水，使总体积为3 µl。</li>
		<li>向相应管中加入4.5 µl适当的RT试剂混合液，颠倒混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。</li>
		<li>将样本放入热循环仪中，按以下条件启动逆转录程序：40个循环（16 °C 2分钟，42 °C 1分钟，50 °C 1秒），85 °C 5分钟，4 °C保存。使用这些预定义引物池生成的cDNA应储存于-15至-25 °C，或立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预扩增
	<ol>
		<li>将预定义的预扩增引物池在冰上解冻。轻轻涡旋引物，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。通过轻弹使TaqMan PreAmp试剂混合液（2倍浓度）充分混匀。</li>
		<li>按照表2B所述，将试剂分别加入两个离心管中：一管用于Pool A，另一管用于Pool B。 
		注意：如上所述，Pool A的预扩增引物加入A管，Pool B引物加入B管。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。</li>
		<li>颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。向新管中分装22.5 µl相应的PreAmp试剂混合液。向对应管中加入2.5 µl cDNA样本（由RT步骤制备）。</li>
		<li>颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。将样本放入热循环仪中，启动预扩增循环。循环条件：95 °C 10分钟，55 °C 2分钟，72 °C 2分钟，12个循环（95 °C 15秒，60 °C 4分钟），99.9 °C 10分钟，4 °C保存。</li>
		<li>颠倒预扩增后的cDNA以混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。向预扩增cDNA中加入75 µl 0.1倍TE缓冲液（pH 8.0）（1:4稀释）。颠倒稀释后的预扩增样本以混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。稀释后的预扩增cDNA可在-15至-25 °C保存最多一周，或立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微流控芯片上样及qPCR操作
	<ol>
		<li>将微流控miRNA芯片置于室温下至少半小时，使其恢复至室温。将稀释后的预扩增cDNA在冰上解冻，通过颠倒混匀后短暂离心。通过旋转混匀qPCR试剂混合液。</li>
		<li>在新管中加入450 µl qPCR试剂混合液和9 µl稀释后的预扩增cDNA。对于A芯片，使用由引物Pool A制备的预扩增产物。加入441 µl无核酸酶水，使最终体积达到900 µl。颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。</li>
		<li>待芯片恢复至室温后，从包装中取出，放置于洁净区域，铝箔面朝下。向芯片上的8个加样口各加入100 µl PCR反应混合液。每个储液池有2个加样口（每张芯片共8个储液池）。 
		注意：加样口为较大的孔，用于加入反应混合液；通气孔为较小的孔。每张miRNA TLDA芯片包含8个储液池，每个储液池通向48个孔（每列24孔 × 2列），从而将相同的PCR反应混合液加载至芯片全部384个孔中。确保每个样本的Pool A和Pool B分别加载至对应的TLDA芯片。将阵列芯片放入离心机专用的微流控阵列芯片支架桶中。</li>
		<li>微流控阵列芯片需使用合适的离心机（如Heraeus Multifuge 3SR，230V离心机）及专用支架桶（如“TaqMan Array Card”支架）。每个支架桶最多可容纳3张芯片（已加载或空置）。始终确保每个支架桶的3个插槽均被占用，并通过在离心机对侧位置放置相同支架桶（该桶也应包含3张芯片，无论空置或已加载）实现平衡。将芯片放入支架桶时，确保8个储液池朝上，反应孔朝向离心机外壁。
		<ol>
			<li>在室温下以331 × g离心1分钟。第一次离心后，打开离心机，目视确认反应混合液已分配至全部384个孔中。以相同条件再重复离心一次。从支架桶中取出芯片，检查8个储液池中反应混合液的液面是否一致。若储液池中液体体积存在不一致，则该芯片不可继续使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>微流控阵列芯片需使用专用封膜仪，其配备精密的压头组件（滑架），用于密封芯片内的流体分布通道，并将反应混合液均匀分配至所有孔中（每孔总反应体积为1 µl）。</li>
		<li>将压头移至起始位置，将已加载的芯片插入封膜仪，铝箔面朝上，并与封膜仪上的压针对齐。以缓慢、稳定且连续的单次动作，将压头推至封膜仪末端。取出已密封的阵列芯片，用剪刀剪除芯片上的储液池部分。</li>
		<li>确保微流控阵列实时PCR系统/仪器中已正确安装相应的模块、加热盖和样本载体。</li>
		<li>开启计算机，然后启动微流控阵列系统，最后打开软件。确保设备正确连接。选择实验类型为阵列芯片、标准曲线、TaqMan试剂和标准模式。导入A芯片或B芯片的设置文件，保存文件。</li>
		<li>将密封后的芯片放入仪器托盘中，使A1孔位于左上角，条形码朝向仪器前方。点击“开始运行”。程序运行时间约为2小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 基于探针的纳米流体人 miRNA 检测面板
<ol>
	<li>逆转录（RT）
	<ol>
		<li>本方案适用于总RNA输入量为50–200 ng的样本，其中100 ng对大多数样本而言最为理想。若需获得完整的miRNA表达谱，每个样本应分别进行两组预定义的RT引物池（池A和池B）的逆转录反应。</li>
		<li>将试剂在冰上解冻：预定义的RT引物池（10X）、含dTTP的dNTP混合物（100 mM）、RT缓冲液（10x）、MgCl2（25 mM）、RNase抑制剂（20 U/µl）。酶（重组莫洛尼鼠白血病病毒（rMoMuLV）逆转录酶（50 U/µl））不得置于冰上保存，应储存在-20 °C直至使用。除酶外，其余试剂轻轻涡旋混匀，并在10,000 x g下短暂离心10秒。</li>
		<li>按照表3A所述，将试剂分别加入两个离心管中；一管用于池A，另一管用于池B。每管仅包含一个预定义的RT引物池，即池A或池B中的一种。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。</li>
		<li>用移液器吹打混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。将每种RNA样本各100 ng分装至新管中，并加入无核酸酶水调整总体积至3 µl。向相应管中加入4.5 µl适当的RT试剂混合物。</li>
		<li>轻柔颠倒混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。将样本放入热循环仪并启动RT程序。循环条件：40个循环（16 °C 2分钟，42 °C 1分钟，50 °C 1秒），85 °C 5分钟，4 °C保存。使用这些预定义RT引物池生成的cDNA应储存于-15至-25 °C，或&#160;立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预扩增（pre-amp）
	<ol>
		<li>将预定义的预扩增引物池在冰上解冻。轻轻涡旋混匀引物，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。轻柔旋转TaqMan PreAmp试剂混合物（2X）以混匀。</li>
		<li>按照表3B所述，将试剂分别加入两个离心管中；一管用于池A，另一管用于池B。每管仅包含一个预定义的RT引物池（池A或池B）。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。</li>
		<li>用移液器吹打混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。将22.5 µl适当的PreAmp试剂混合物分装至新管中。向相应管中加入2.5 µl cDNA样本。轻柔颠倒混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。</li>
		<li>将样本放入热循环仪进行预扩增。设定反应体积为25 µl。循环条件：95 °C 10分钟，55 °C 2分钟，72 °C 2分钟，12个循环（95 °C 15秒，60 °C 4分钟），99.9 °C 10分钟，4 °C保存。</li>
		<li>轻柔颠倒预扩增后的cDNA以混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。在新管中，将4 µl预扩增cDNA加入156 µl 0.1x TE缓冲液（pH 8.0）中（1:40稀释）。轻柔颠倒稀释后的预扩增样本以混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。稀释或未稀释的预扩增cDNA可在-15至-25 °C保存最多一周，或&#160;立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载纳米流体芯片并进行qPCR
	<ol>
		<li>使用纳米流体芯片载玻片的序列号，从网站31&#160;下载相应的板文件（.tpf）。该文件包含特定纳米流体芯片载玻片的运行信息。</li>
		<li>将稀释后的预扩增cDNA和TaqMan实时qPCR试剂混合物（如首次使用）在冰上解冻。通过旋转瓶身混匀qPCR试剂混合物。在新管中，将22.5 µl qPCR试剂混合物与22.5 µl稀释后的预扩增cDNA混合。轻轻涡旋混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。</li>
		<li>将每种样本各5 µl分装至纳米流体芯片工作流程384孔样本板的8个孔中（2列，4行）。确保每个样本的池A和池B位于相邻的8孔区块内（参见图1&#160;或补充Excel表格中的布局）。
		<ol>
			<li>每块样本板最多可容纳相当于八张芯片的样本量。然而，纳米流体芯片系统单次运行仅能处理4张芯片。若在一块样本板上加载超过四张芯片的样本，请确保其余区域已密封。使用OpenArray样本板密封膜进行密封。 
			注：建议预先将密封膜裁剪成所需区域，以便单独密封/揭开，减少蒸发。或者，也可先用完整密封膜封板，之后在加载时逐个区域切开。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在4 °C、490 x g下离心1分钟。应在1小时内完成纳米流体芯片载玻片的加载。由于密封载玻片的时间有限，请一次仅加载一张载玻片。从冷冻保存中取出纳米流体芯片载玻片，使其恢复至室温（约15分钟）。</li>
		<li>确认纳米流体芯片系统中已安装正确的模块、加热盖和样本载体。打开计算机、实时PCR系统和加载系统。进入相应软件界面，并确认各设备已连接。从包装中取出加载系统的耗材（芯片载玻片盖、塞子和浸没液）。</li>
		<li>轻轻拉动浸没液注射器的活塞以松动。取下帽盖，安装尖端并排出尖端中的空气。将加载系统尖端放入机器内并取下盖子。将样本板放入PCR系统中。</li>
		<li>戴上手套。确保手套贴合紧密，以尽量减少意外触碰或污染载玻片盖的风险。小心打开载玻片包装。缓慢将载玻片滑入手掌中。切勿触碰载玻片顶部。</li>
		<li>将载玻片放入PCR系统中，条形码朝左。移除样本板上拟加载区域的密封膜。使用加载系统软件输入载玻片条形码、载玻片位置、样本位置和尖端配置。</li>
		<li>完成所有相关检查后，按下“加载载玻片”按钮。当PCR系统正在加载载玻片时，取下载玻片盖底部的透明和红色塑料片。加载完成后，须在90秒内小心取下并密封载玻片。
		<ol>
			<li>将载玻片放入板夹中。将载玻片盖盖在载玻片上。夹紧30秒。确保盖子方向正确，使条形码清晰可见。从板夹中取出组装好的载玻片组件。</li>
			<li>将浸没液注射器插入载玻片中，使尖端紧贴盖子。缓慢注入浸没液，确保液体沿盖子表面流动。注满后，用塞子密封载玻片，旋转螺丝直至手柄断裂脱落。</li>
			<li>取下载玻片盖顶部的塑料保护盖，然后小心地将其放入实时PCR系统的载玻片载体中。在降低载玻片时，确保底部有支撑，防止突然掉落，且切勿触碰载玻片顶部。允许触碰载玻片/盒的侧面。启动PCR系统，并在1小时内开始qPCR程序。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在PCR系统软件中选择“OpenArray”。点击“查找载玻片ID”。此过程需数分钟。若软件无法识别板ID，将提示手动输入。</li>
		<li>点击“确认板中心”。此过程同样需要数分钟。检查红色圆点是否位于中心，并确认载玻片顶部无指纹或污迹。为每张载玻片加载相应的.tpf文件，并指定结果文件名及存储位置。点击“开始运行”。程序运行时间约为2小时&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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本文的出版处理/发表费用由Life Technologies在稿件被接受发表后承担。

为了获得准确且可重复的结果，在基于探针的qPCR实验方案中，关键步骤包括：1）确保每个qPCR反应中加入的逆转录产物（RT产物）体积和浓度相同；2）正确配制qPCR反应所需各组分的比例和体积，并充分混匀；3）向每个qPCR反应中加入正确且一致的体积；4）在尽可能短的时间内完成每个样品和反应混合物的制备与加样，同时始终注意前述各项关键步骤。
微流控阵列芯片需要使用合适的离心机和专用转子桶。每个转子桶最多可容纳3张芯片（已加载或空置）。使用时务必确保转子桶的全部3个卡槽均被占用，并通过在离心机相对位置放置另一个相同的转子桶（该桶也应包含3张芯片，无论为空或满）来保持平衡。将芯片放入转子桶支架时，应确保8个储液池朝上，反应孔面向离心机外壁。在室温下以331 × g离心1分钟。第一次离心后，打开离心机，目视确认反应混合液已通过384个孔均匀分配。在相同条件下重复离心1次。从转子桶中取出芯片，检查8个储液池中的反应混合液体积是否一致。若储液池中残留液体体积存在任何不一致，则该芯片不宜继续使用。
为了使反转录产物（RT-产物）的浓度一致，每个反转录反应中加入相同浓度的RNA起始量。总RNA浓度使用微量分光光度计进行测定。从血浆或血清中提取的RNA，其260/280比值可低至1.3；但这似乎不会影响后续qPCR相关流程或所产生的数据30。同样，本文所检测的RNA样本的260/280比值在1.3–1.7之间，qPCR中未观察到异常影响。
当使用低RNA含量的样本（如来自体液的样本）时，在处理前可能难以对RNA进行准确定量。我们建议在RNA提取以及逆转录阶段均使用合成的外参 spike-in。根据我们的经验， 拟南芥 候选miRNA（ath-miR-159a和ath-miR-172a）优于 秀丽隐杆线虫 miRNA（例如 cel-miR-39 或 cel-miR-54），根据我们的经验，其同源性可能高于那些来自 A. thaliana使用此类特定阶段的外参 spike-in 可以校正不同时期检测的多个样品间 miRNA 数据的归一化。同样建议在 cDNA 合成反应中使用固定的 RNA 加样体积。32,33.
本文所述的三种基于探针的miRNA定量方法所需的总RNA投入量、实验流程和成本各不相同。每种实验流程的设计均针对不同通量需求，具体取决于待分析的miRNA靶标数量和样本数量。随着通量的提高（96反应→384反应→3072反应），单位时间内获得的数据量增加，每反应的成本随之降低。由于所有这些平台均采用TaqMan化学原理，因此所获得数据的质量可预期相似。TaqMan qPCR是一种成熟的方法，用于检测血清/血浆样本中miRNA的丰度9,11,27。尽管此处讨论的三种平台使用相同的化学原理，但反应体系体积的减小会导致转录本检测的动态范围缩小（Farr RJ et al.，未发表数据）。96孔qPCR平台通量较低，但灵敏度高，我们认为是所有基于探针（或染料）的PCR平台中的“金标准”。然而，若需检测数百至数千个样本且涉及多个microRNA时，该平台可能并非最经济或高效的选项。微流控（TLDA）和纳流控（OA）平台属于高通量/高含量平台，旨在更短时间内获取更大规模的数据。尽管在TLDA芯片中观察到批次间差异，但可通过申请同一批次的TLDA芯片来尽量减少该问题。我们发现，当使用同一样本在不同批次的TLDA芯片上进行检测时，TLDA平台（图3）在17%的中–低丰度miRNA中表现出显著变异。因此，我们建议在使用TLDA芯片进行分析时采用相同批次编号的产品。这种变异也可能源于技术性差异，包括潜在的加样和移液误差。然而，我们仍建议订购或申请同一批次的TLDA芯片。在OA平台上未观察到显著的批次间变异。尽管如此，基于TaqMan的实验性qPCR方法仍能简便地测定血浆/血清样本中miRNA的丰度。本文讨论的低、中、高通量方法提供了灵活性，可利用高效、可重复且背景噪声低的化学体系，对多种样本和miRNA进行分析。

microRNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA（ncRNA），在基因表达调控中发挥重要作用1-3。动物中的大多数miRNA通过与mRNA的3’非翻译区（UTR）进行序列特异性的碱基配对，从而实现对基因表达的负向调控2-4。这种调控通常通过抑制mRNA的翻译过程或导致核糖体脱落来实现。循环中的miRNA已被证明在多种疾病（如糖尿病5-7、卵巢癌8、前列腺癌9和乳腺癌10,11、乙型肝炎12以及其他自身免疫性疾病13）的研究和临床领域中具有作为新型生物标志物的潜力。已有研究致力于鉴定不同细胞或组织中丰度较高的miRNA，以及在人血浆和血清样本中更易获取且侵入性更小的循环miRNA9,11-15。
已采用多种平台建立了不同的miRNA定量方法，例如标准96孔板平台4,12,16-18、微流控卡片平台12,18-23以及纳流控阵列平台17,24。定量实时PCR（qPCR）能够利用多种化学体系（染料法或探针法）来测定转录本的相对或绝对数量。基于探针的实时PCR技术具有背景荧光低、灵敏度高的优点，可检测单个转录本拷贝。该方法相对成本较低、操作简便且高度可重复，因此成为定量和分析miRNA表达的首选方法25。基于探针的qPCR方法通常包括两个步骤：逆转录（RT）和qPCR4,26,27。在逆转录过程中，茎环结构的RT引物与成熟或初级miRNA分子杂交，并被逆转录为互补DNA（cDNA）。随后使用miRNA特异性的PCR引物对cDNA产物进行定量26-28。基于探针的qPCR原理依赖于对互补链实时延伸过程的检测，该过程涉及荧光标记探针的水解。这些探针设计为包含一个荧光报告基团和一个淬灭基团，二者间距足够近以允许发生FRET（荧光共振能量转移）。由于淬灭分子与荧光报告基团（发射体）距离极近，其荧光信号被屏蔽。当Taq DNA聚合酶（pol）从上游引物延伸至分支点（探针的5’端）时，Taq聚合酶的外切核酸酶活性会水解探针，导致荧光发射体与淬灭基团发生物理性解离/分离。单个荧光发射体分子的释放被检测器记录，并表现为该孔/反应中荧光信号的逐步增加。荧光信号的增加与生成的PCR产物量成正比，从而实现对扩增靶标的精确定量26,28。
随着对miRNA定量需求的不断增加，中高通量技术已被开发出来，以实现在较短时间内处理大量样本。TaqMan低密度阵列（TLDA）是一种基于探针法qPCR化学原理的中通量创新微流控设计，可提高单块板上分析的miRNA数量。TLDA采用一组预先定义的逆转录引物池来合成cDNA，随后将这些cDNA加入定制的384孔微流控卡片中，通过qPCR技术检测多种miRNA的表达水平22,26,29。卡片的每个孔中均含有冻干的引物和探针，用于扩增特定的miRNA，因此单张TLDA卡片可同时运行多达384个反应26。
纳米流体芯片阵列是一种高通量平台，利用相同的基于探针的化学方法用于检测基因转录本24。该技术采用一种专有的基质，通过疏水-亲水相互作用，便于将33纳升的反应混合物轻松加载至不锈钢载片上包含3072个通孔的阵列中24。本文重点演示如何在血清/血浆中定量miRNA，介绍实验操作的关键因素，以及在数据生成和解读过程中必须考虑的重要事项。同时，本文还将讨论这些方法各自的优点与局限性。

<table><tbody><tr><td>96 孔板平台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆转录反应</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975&lt;br/&gt; 该试剂盒包含逆转录引物和 PCR 引物。</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4366597 或 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 或 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596&lt;br/&gt; TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒在所有三种 TaqMan 平台（96 孔板、TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应中均使用相同的试剂。</td></tr><tr><td>在 96 孔板平台上进行 qPCR 扩增</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix，不含 AmpErase UNG&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846&lt;br/&gt; 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 用于两种 TaqMan 平台（96 孔板和 TLDA）的 qPCR 扩增。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性封膜</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板，0.1 ml&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>微流控平台（TLDA）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆转录反应</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>参见上述 96 孔板平台使用的 TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（4366597 或 4366596）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT 引物，人源 Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966&lt;br/&gt; Megaplex RT 引物，人源 Pool A v2.1 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Megaplex RT 引物，人源 Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281&lt;br/&gt; Megaplex RT 引物，人源 Pool B v3.0 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>或</td><td></td><td></td><td>或</td></tr><tr><td>Megaplex 引物池，人源 Pool Set v3.0</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750&lt;br/&gt; Megaplex 引物池，人源 Pool Set v3.0 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>预扩增反应</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 预扩增主混合液</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4391128 或 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 或 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593&lt;br/&gt; TaqMan 预扩增主混合液用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Megaplex 预扩增引物，人源 Pool B v3.0&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303&lt;br/&gt; Megaplex 预扩增引物，人源 Pool B v3.0 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Megaplex 预扩增引物，人源 Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233&lt;br/&gt; Megaplex 预扩增引物，人源 Pool A v2.1 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x TE 缓冲液（100 ml）</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product&lt;br/&gt; 1x TE 缓冲液用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加载并运行 384 孔微流控（TLDA）芯片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Array 人源 microRNA A+B 芯片组 v3.0&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>纳流控平台（OpenArray）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆转录反应</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>参见上述 96 孔板平台使用的 TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（4366597 或 4366596）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>预扩增反应</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>参见上述 TLDA 预扩增试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加载并运行芯片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray 人源 microRNA 面板，QuantStudio 12K Flex（1 个面板）</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex OpenArray 配件试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>OpenArray 384 孔样本板&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray 实时 PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>OpenArray AccuFill 系统吸头&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>其他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

基于探针的实时pcr方法用于microrna的定量检测

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

基于探针的定量PCR（qPCR）是测量转录本丰度的常用方法，因为它是灵敏度最高的检测方法之一，可提供准确且可重复的分析结果。与其他基于染料的化学方法相比，基于探针的化学方法具有最低的背景荧光。目前已有多种采用探针化学法来定量转录本丰度的平台。96孔板qPCR是最常规使用的方法，但在单次运行中最多只能检测96个样本或miRNA。如果需要分析大量样本或miRNA，则该方法耗时且繁琐。高通量的基于探针的平台，例如微流控（例如 TaqMan阵列卡）和纳流控阵列（例如 OpenArray），可在短时间内对大量样本中的多种miRNA丰度进行高效、可重复的检测。本文中，我们展示了利用基于探针的化学方法及三种不同平台（96孔板、微流控和纳流控阵列）从血清或EDTA血浆样本中进行miRNA定量的实验设置与操作流程，这些平台的通量依次提高。

基于miRNA探针的qPCR反应推荐体积为20 µl。注意：我们已证实，5 µl反应体积能够产生与20 µl体积相当的结果4,7,30。将反应体积降低至5 µl可在不影响检测灵敏度的前提下，使试剂成本降低75%。如图2所示，20 µl与5 µl反应体积在扩增至39个循环前表现出高度一致性（r2 = 0.92，p = 0.0002）。
微流控芯片阵列提供了一种工具，可在约5小时内（针对A卡和B卡）获取样本中表达的754种miRNA的数据，相较于传统的96孔板PCR，该方法在分析多个样本时效率更高。我们对同一样本（样本A及样本A重复）的miRNA微流控芯片阵列卡片进行了比较。 图3A-B 显示Bland-Altman图（3A）以及相关性图（3B) 针对这些样本检测的全部 754 个 miRNA。两种卡片（卡片 A 和卡片 B）上均在多个不同位置随机设置了 3 种不同的对照 miRNA（U6、RNU44 和 RNU48）。当比较两次运行之间的 U6 循环阈值（Ct）值时，我们未观察到数值之间存在显著差异。表 4）。还需注意的是，所检测样本中 U6 的表达丰度更高（Ct 值更低）。随后，我们比较了两次运行中 Ct 值均介于 0–19.99 之间的所有 miRNA（n = 150），总体 miRNA 表达水平相似，决定系数为 98%（图 3C–D）。在两次运行中 Ct 值均介于 20 至 29.99 的全部 277 个 miRNA 中，有 16 个 miRNA 在原始运行与重复运行之间存在显著差异（图 3E-F). 当两次运行的Ct值均选择在30-40之间时，两次运行间存在显著差异的miRNA数量增加（89个/327个） （图3G）-H) 
纳米流体芯片平台可从每个血清/血浆样本中提供754种miRNA的数据，如图4A所示。与所有qPCR实验一样，必须仔细检查这些扩增曲线，以确保结果反映的是真实的扩增信号。每个48个子阵列（图1）均包含针对三种最常用的“看家”非编码RNA（ncRNA）——U6、RNU44和RNU48的检测。图4B展示了一个样本中U6重复检测的典型聚类情况。这些重复检测显示出较低的标准差（SD &lt;0.5），因此可作为结果可靠性的指标。相比之下，图4C展示了另一个样本中U6重复检测的变异性增加（SD &gt;0.5）。这并不否定其余检测的有效性，但确实需要进行更深入的评估。与大多数存在于生物体液中的“看家”miRNA一样，U6的表达水平可能存在变异。值得注意的是，图4C中所示的一个样本，其U6含量比图4B中所示样本低4倍。由于图4C样本中U6的初始水平已比图4B面板中的样本低75%，因此由于转录本的泊松分布特性，在微小反应体积下技术变异性会进一步加剧17。
另一个有用的工具是质量控制（QC）图像，在运行完成后可导出。其中部分图像利用了qPCR试剂混合液中含有的被动染料ROX的荧光信号，以确认每个通孔是否已正确加样（图5）。通孔甚至整个子阵列未能加样，可能由以下原因导致：样本体积不足、蒸发、384孔样本板孔内存在气泡、未完全去除样本板封膜，或Accufill系统及其移液尖端存在缺陷。必须识别所有未加样的通孔，以避免将miRNA错误判读为“不可检测”，而实际上该检测位点并未加载任何反应体系。若遇到此类问题，请确认每个384孔板孔中至少加入5 µl样本/主混合液，样本板在加载前已正确离心，铝箔封膜已完全移除，且已加载的OpenArray芯片须在规定时间内密封并完成后续运行。若加样问题仍然存在，则更可能与特定批次的芯片或相关耗材有关，应联系制造商寻求进一步技术支持。
<img alt="AccuFill系统加载和OpenArray芯片的384孔板示意图，显示样品布局。" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：纳米流体芯片工作流程的样品布局：（A）每块384孔样品板最多可容纳8块纳米流体芯片所需的样品。（B）稀释并预扩增的cDNA被加入8个孔中（2列×4行），Pool A和Pool B分别位于相邻的8孔组中。每个圆圈代表一个孔。（C）样品板中的每个孔将被加载至纳米流体芯片的一个子阵列中。每个小方格代表一个子阵列。
<img alt="线性回归图，显示5-20 µl反应体积在实验结果中的数据相关性。" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：传统96孔PCR平台的相关性分析： 使用标准96孔板平台进行TaqMan实时qPCR检测时，20 µl与5 µl反应体系在CT值（39个循环）上的相关性。我们在4种不同的人血清和血浆样本中比较了4种不同的微小RNA（miR-375、miR-30c、miR-30d和miR-7）。由于部分数据无法检测到，仅绘制了11个数据点。R2 = 0.92，p = 0.0002。
<img alt="miRNA analysis; Ct value repeatability graphs, regression analysis, correlation study, statistical chart" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3： 使用微流控阵列芯片进行循环miRNA谱型分析。 使用2张微流控芯片（芯片-A和芯片-B），可生成754种miRNA的表达谱（A-B）。如图所示，我们使用同一样本进行了两次微流控芯片阵列检测，以验证微流控芯片结果的可重复性。总体上观察到miRNA表达水平相似，Ct值介于0-19.99之间。C-D）。仅有少数 miRNA（277 个中有 16 个）的 Ct 值介于 20–29.99 之间，且在重复实验中存在显著差异（E-F）。在327个Ct值较高（30-40）的microRNA中，有89个在两次运行之间表现出显著差异（G-H). 采用配对t检验对数据进行分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="PCR扩增，ΔRn与循环数的线性图谱，显示各循环中荧光信号的变化。" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：PCR产物扩增曲线的代表性图谱：为一个人类血浆样本中所有miRNA靶标的合并（A）扩增曲线的代表性图示。每个亚阵列中均设置了U6（一种常见的对照非编码RNA）检测。图（B）中的样本显示U6重复间的变异度较低（标准差 SD &lt;0.5），而图（C）则显示U6重复间标准差较高（SD &gt;0.5）。两个样本均为从人类血浆中提取的总RNA。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="微阵列分析；DNA杂交结果；网格模式中的荧光检测；科研用途。" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：纳米流控芯片的质量控制分析：正确加载的纳米流控芯片（左）与错误加载的纳米流控芯片（右）的质量控制（QC）图像。被动染料ROX（存在于qPCR试剂混合液中）产生荧光，以指示通孔是否正确加载。右侧芯片存在多个未加载qPCR试剂混合液的子阵列/通孔，这些应被识别为假阴性PCR反应。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每 5 µl 反应体系的体积 (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT 缓冲液 (10x)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (100 mM)</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>1.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>逆转录酶</td>
			<td>0.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>2.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1A： 使用标准96孔板平台进行TaqMan实时qPCR时，5 µl反转录反应体系中反转录试剂混合液的组分。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每 5 µl 反应体系的体积 (µl)</td>
			<td>每 20 µl 反应体系的体积 (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PCR 预混液 (2x)</td>
			<td>2.5</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan qPCR 引物探针组合 (20x) *</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>1.45</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积：</td>
			<td>4.2</td>
			<td>16.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*基于所选测试 miRNA 的检测组分。
表1B：使用标准96孔板平台进行TaqMan实时qPCR时，5 µl或20 µl qPCR反应体系中qPCR试剂混合液的组分。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT 引物（10x）</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 dTTp 的 dNTPs（100 mM）</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiscribe逆转录酶（50 U/µl)</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X RT缓冲液</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2 (25 mM)</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂     (20 U/µl)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2A： 用于 TLDA miRNA 面板的 5 µl RT 反应体系中 RT 试剂混合液的组分。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积 (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Mastermix (2x)</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers (10x)</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>22.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2B： 用于 TLDA miRNA 面板的 25 µl 预扩增反应体系中的 PreAmp 试剂混合组分。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT 引物（10x）</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 dTTp 的 dNTPs（100 mM）</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多转录酶（50 U/µl)</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X RT缓冲液</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂     (20 U/µl)</td>
			<td>0.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 3A： 基于探针的纳米流体 miRNA 检测面板中，5 µl 逆转录反应体系的逆转录试剂混合液组分。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积 (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Mastermix (2x)</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers (10x)</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>22.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3B： 基于探针的纳米流体miRNA检测面板中25 µl预扩增反应体系的PreAmp试剂混合组成。 注意：为三种平台提供的交互式补充Excel电子表格已包含5%的额外添加量，以补偿移液误差。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样本 A</td>
			<td>样本 A 重复</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.535</td>
			<td>16.156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.471</td>
			<td>15.652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.623</td>
			<td>16.063</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.963</td>
			<td>15.889</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.006</td>
			<td>13.993</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.502</td>
			<td>14.623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.907</td>
			<td>14.384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.732</td>
			<td>14.946</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4： 使用微流控芯片阵列对循环miRNA U6进行表达谱分析。采用两张微流控芯片阵列（A 和 B）。来自样本A的U6内参miRNA的Ct值（总计 = 8）。两次运行之间观察到U6内参miRNA丰度一致。

循环microRNA最近已成为多种癌症及其他疾病的有前景的新型生物标志物。本文旨在讨论三种不同的基于探针的实时PCR平台和方法，这些平台和方法可用于定量并确定循环microRNA的丰度。

基于探针的实时PCR方法用于microRNA的定量检测

基于探针的定量PCR（qPCR）是检测转录本丰度的常用方法，因为它是灵敏度最高的检测方法之一，……

以下实验的总体目标是演示三种基于探针的实时PCR方法，用于定量血浆和血清样品中的微小RNA。基于探针的实时PCR通过水解并检测带有荧光标记的探针来实现，该探针包含一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当下游DNA聚合酶从上游引物延伸并到达探针的5'端时，会导致荧光发射基团与淬灭基团发生物理分离。随后，会释放出一个荧光分子Four，该信号被检测器记录，并表现为该反应荧光信号的逐步增加。最终，可通过荧光信号的增加量来测定PCR产物的生成量，从而实现对目标扩增片段的精确定量。该方法正逐渐成为发现多种癌症及其他疾病（如糖尿病）新型生物标志物的有前景的技术。尽管该方法可用于研究血清和血浆中microRNA的丰度，但也适用于其他样本，如外周细胞和组织。本方案的可视化演示至关重要，因为封合纳米流控芯片载玻片的某些步骤仅通过阅读方案难以掌握。对于基于探针的实时定量PCR成熟microRNA检测，需将4.2微升的单个QPCR试剂混合液加入光学96孔板的每个孔中，随后加入0.8微升适当的新鲜配制的cDNA反应液。用相应的光学封板膜密封反应板，然后在实时PCR系统上启动QPCR反应。为制备起始投入量为1至1000纳克总RNA的微流控阵列芯片，首先将池A和池B引物缓冲液、脱氧核苷三磷酸、氯化镁以及RNA抑制剂置于冰上解冻。随后进行逆转录反应，将每种RNA样本各100纳克分装至池A或池B的离心管中，再加入适量无核酸酶水，使每管总体积达到3微升。接下来，向相应的对应管中分别分装4.5微升适当的逆转录试剂混合液。然后将样品放入热循环仪中，开始反转录。在反转录进行的同时，当样品准备就绪后，将预先定义的预扩增引物混合物在冰上解冻，用于总RNA样品输入量在1至350纳克之间的情况，并分装22.5微升相应的预扩增试剂。将池A和池B管中的试剂混合，然后向每个管中加入2.5 µL反转录得到的cDNA样品。接着将样品加入热循环仪，开始预扩增循环。循环结束后，向预扩增的cDNA中加入75 µL 0.1× Tris-EDTA缓冲液，用于加载微流控芯片。接下来，向9微升稀释后的PREPL扩增cDNA（使用引物池A制备）中加入450微升QPCR试剂混合液，用于卡片A，并加入441微升无核酸酶水，最终体积为900微升。待其达到室温后，从包装中取出TaqMan低密度阵列卡，将铝箔面朝下放置于洁净区域。加入100微升PCR反应液。将液体分别加入芯片上的八个加样口。在室温下以331 ×g离心1分钟。然后以缓慢、稳定且连续均匀的动作，将推杆沿芯片推至封膜仪终点位置。取出密封的阵列卡并剪掉储液池。然后确认微流控阵列实时 PCR 系统中已安装正确的加热盖块和样品载体。为加载纳米流控阵列，需将稀释后的 prepl、扩增的 cDNA 以及 TaqMan 实时 QPCR 试剂解冻。轻轻旋转混匀QPCR试剂瓶。随后，将22.5 µL QPCR试剂混合液加入22.5 µL稀释后的预扩增cDNA中。然后，将每个样本5 µL分别加入纳米流体阵列工作流程384孔样本板的八个孔中，注意将每个样本的Pool A和Pool B分别置于指定位置。当所有样品均转移至相邻的八孔板后，用开放式阵列样品板封膜将板的每个区域覆盖。随后，将第一张纳米流体阵列芯片在室温下解冻约15分钟。确认纳米流体阵列系统中已安装正确的模块编辑盖和样品载体，然后轻轻拉动浸没液注射器的推杆以松开活塞。取下盖子，安装好吸头，并将吸头中的空气排净。然后将加样系统吸头放入加样系统中。打开盖子，将样本板放入加样系统内。现在戴上一副贴合紧密的手套。小心打开载玻片包装，缓慢将载玻片从包装中倾倒出来，切勿触碰其上表面。将载玻片放入加载系统中，确保条形码位于左侧。然后移除样本板上用于加样区域的封条，并使用加样系统软件输入载玻片条形码、载玻片位置、样本位置和吸头配置。在载玻片加样过程中，取下载玻片盖底部的透明和红色塑料片。加样过程结束后，需在90秒内小心取出载玻片并进行密封。将载玻片放入板卡夹中，并将盖板盖在载玻片上保持30秒，确保盖板位置正确，条形码可清晰显示。然后将浸没液注射器置于载玻片内，使针头轻抵盖板，缓慢注入浸没液，注意使液体沿盖板流下。待载玻片充满后，用塞子密封，并旋转螺钉直至手柄断裂脱落。最后，取下盖板顶部的塑料覆盖膜，小心地将载片放入实时 PCR 系统的载片架中。放置时应支撑载片底部，避免触碰载片顶部。随后启动 PCR 系统，并在加样后一小时内开始定量 PCR 程序。采用该方法，5 微升的反应体系可获得与 20 微升体系相似的结果，且具有高度相关性。在最多 39 个循环内，对同一份样本使用微流控阵列卡片检测全部 754 种微小 RNA（microRNA）时，如上所述，两条实验路径中 CT 值介于 0 至 19.99 之间的微小 RNA 也表现出相似的表达水平，其决定系数达 98%。此外，当选择 CT 值在 30 至 40 范围内的微小 RNA 时，两条实验路径间存在显著差异的微小 RNA 数量增加。在该图中，展示了纳米流控阵列平台对全部 754 种微小 RNA 的检测数据。必须分析扩增曲线，以确保结果能够反映真实的扩增情况。还应检测内参微小RNA（如U six）是否存在变异。例如，在本图中，U six重复样本呈现出典型的聚集模式，标准差较低，表明数据具有可靠性。最后，这些数据表明在第二个样本中，U six 重复实验的变异性增加。基于探针的高通量技术，例如微流控和纳流控芯片阵列，能够在极短时间内对大量样本中的多种 microRNA 表达丰度进行可重复且高效的检测。每种工作流程均根据待分析的 microRNA 靶标数量和样本数量，设计用于满足不同的通量需求。观看本视频后，您应能充分理解如何开展基于探针的不同实时荧光定量 PCR 技术，以检测主要的微小核糖核酸（microRNA）丰度。

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