成像小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中的 Ca²⁺ 动态变化

本实验的总体目标是利用荧光生物传感器，记录小鼠视网膜视锥光感受器中由光刺激诱发的钙信号。该目标通过分离表达基因编码钙传感器的转基因小鼠品系的视网膜来实现，该传感器仅在视锥光感受器中特异性表达。第二步是将视网膜组织切成垂直切片。

接下来，将视网膜切片固定在盖玻片上，并置于双光子显微镜下观察。最后一步是记录视锥光感受器单个突触终末在光刺激下的钙信号。最终，所记录的钙信号将进行离线分析。

利用该方法，我们能够以亚细胞分辨率同时记录多种玉米食物受体的活性。这是相较于现有技术（如电生理单细胞记录）的主要优势，后者操作更为困难且耗时。因此，我们希望探讨的问题是：钙离子是否参与光感受器变性过程，以及其参与机制如何。

该方法可帮助我们确定钙离子内流是视细胞变性的驱动因素，还是细胞死亡过程中的继发结果。通常，初次操作该方法的研究者主要困难在于，视网膜对光极为敏感，必须始终加以保护，因此包括视网膜分离和切片制备在内的所有精细操作均需在红绿光环境下进行。开始该实验时，将小鼠眼球转移至含有新鲜碳酸氧合细胞外液的培养皿中。

使用锋利的注射针在角膜与巩膜交界处的任意位置刺穿眼球。接着，用镊子夹住巩膜并固定眼球，将一把剪刀的一个刀片轻轻插入孔中。沿锯齿缘剪开，以分离眼球的前部与眼杯。

随后在笔标记的位置沿径向切开眼杯，以指示视网膜上的背侧位置。然后将眼杯放置成背侧切口朝外。用镊子尖端插入视网膜与巩膜之间，夹住眼杯左右两侧的巩膜。

随后，轻轻翻转iica的巩膜部分，使视网膜脱离。最后，剪断视神经，使视网膜完全脱离巩膜。用一对镊子夹住视网膜边缘，用另一对镊子轻轻清除视网膜表面的碎片和玻璃体。

当视网膜表面清洁后，再制作三个较短的放射状切口。现在将载玻片缓慢浸入靠近组织的细胞外溶液中。用镊子夹住边缘，轻柔地将视网膜（节细胞面朝上）拉至载玻片上，以减少对组织的机械损伤和折叠。

接下来，使用弯头手术刀从选定的视网膜区域切下一小块约1毫米×2毫米的矩形组织，并擦去组织周围多余的溶液。然后将预先准备好的硝酸纤维素纤维膜覆盖在视网膜组织上，使节细胞侧贴附于膜上。立即在膜上滴加一滴细胞外液，以使组织牢固地附着于膜上。

将固定在膜上的视网膜组织转移至含有新鲜细胞外液的切片室中，然后将视网膜切成200微米厚的纵向切片。使用组织切片胶，将单个固定在膜上的切片粘附到预先涂有高真空油脂的玻璃盖玻片上。

保持视网膜下方的玻璃表面清洁且无油脂。随后，在室温下向保存室中每个已安装的盖玻片切片上添加一滴细胞外溶液。通过向一个小的水储液池中通入碳合气（carbogen）气泡，将碳合气引入保存室，以维持保存室内的湿润气体环境。

将切片在孵育室中静置10至15分钟，然后逐个转移至记录室。将切片从孵育室转移至记录室后，立即开始用碳酸化细胞外溶液灌注。维持灌注流速为每分钟2毫升，温度为37摄氏度。

在记录浴槽中。使用20倍、数值孔径（NA）为0.95的水浸物镜，结合位于记录浴槽下方的红外LED和CCD相机。为定位视网膜切片，按照制造商说明启动双光子成像系统。

接下来，打开激光器并将其设置为 860 纳米。开启两个检测通道，用于 ECFP 和柠檬黄荧光蛋白的荧光成像。随后，使用图像采集软件控制双光子显微镜进行扫描，并选择一排视锥细胞终末用于记录；将图像采集设置为 128 × 16 像素的图像或类似配置，限制扫描区域仅覆盖视锥细胞终末，以避免外段中感光色素的漂白。

打开激光器。在施加光刺激或药理学试剂之前，让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光 20 至 30 秒。现在开始呈现任意刺激。

通过使用由定制软件控制的微处理器板，随时间调节两个LED的强度来生成刺激。然后使用相应的图像采集软件同时开始记录两个荧光通道。记录聚焦于视网膜切片中视锥光感受器的突触终末。

这是包含七个独立终末的记录区域示例。荧光使用两个通道记录，一个用于游离的Scepter Citrine，另一个用于FRET供体ECFP。此处显示的是在单个感兴趣区域内记录的Citrine和ECFP荧光的光诱发变化。

此处显示的是视锥细胞终末在5秒间隔下对一系列持续1秒的强光闪光刺激所呈现的钙反应。该图展示了光诱发视锥细胞钙反应的典型定量分析结果。此处为单个视锥细胞终末的光诱发钙反应。

该图展示了平均钙反应的确定方法。静息钙水平代表光刺激前的基线，反应幅度为 ra，即静息钙水平与峰值幅度之间、反应起始与终止动力学之间的面积。该方法可进一步扩展。

例如，在多种药理学条件和强刺激条件下，光感受器的钙信号可能发挥重要作用，可用于深入研究光转导的不同步骤或适应机制。该技术可用于在正常生理条件下研究视锥光感受器中的钙动力学，这对于理解人类致盲疾病（如全色盲或视网膜色素变性）中的原发性和继发性视锥光感受器退化具有重要意义。