Name: 成像钙 2+在小鼠视网膜锥光感受器轴突终末动态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解利用双光子显微镜成像小鼠视网膜视锥细胞轴突末梢钙离子动态的方法。该技术可在亚细胞分辨率下同时记录多个视锥细胞的光诱发钙信号，为研究光感受器变性和视网膜信号机制提供可靠手段。

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本工作由德国研究基金会（DFG）（维尔纳·赖夏特神经科学整合中心图宾根，EXC 307 项目资助 T.E. 和 T.S.；KFO 134 项目资助 B.W. 和 F.P.D.）、德国联邦教育与研究部（BMBF）（图宾根脑状态计算网络中心，项目编号 FKZ 01GQ1002 资助 T.E. 和 T.B.）以及欧盟（DRUGSFORD 项目，HEALTH-F2-2012-304963 资助 M.K. 和 F.P.D.）提供支持。

所有动物实验均遵循德国联邦政府制定的动物保护指南和法律法规，并经图宾根大学机构动物福利委员会批准。
1. 动物模型
<ol>
	<li>HR2.1:TN-XL Ca2+ 生物传感器小鼠
	<ol>
		<li>使用转基因 HR2.1:TN-XL 小鼠品系，该品系在视锥光感受器中特异性表达 Ca2+ 生物传感器 TN-XL10。选用 3 至 6 周龄、任一性别的小鼠，饲养于标准的 12 小时明/暗循环环境中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视网膜分离
<ol>
	<li>生理溶液
	<ol>
		<li>新鲜配制 2 L 细胞外液，其中含有 125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、25 mM NaHCO₃、1.25 mM NaH₂PO₄ 和 25 mM 葡萄糖2，1.25 mM NaH2PO4，26 mM NaHCO₃3，0.5 mM L-谷氨酰胺和20 mM (+)葡萄糖。混合至所有成分溶解。</li>
		<li>用碳酰氧（95% O₂-5% CO₂）气体饱和“冒泡”细胞外液2，5% CO₂2）5 - 10 分钟。加入 CaCl2 达到 2 mM 的浓度。</li>
		<li>在向细胞外液通气后，测量其pH值。pH值应为7.4，否则可能在溶液配制过程中出现错误。实验过程中应保持通气速率和溶液温度恒定，以确保pH值稳定。</li>
		<li>将储备液分装至两个烧瓶中，一个用于视网膜解剖，另一个用于记录装置（灌流）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>眼球摘除与视网膜分离（5 - 10 分钟）
	<ol>
		<li>在去核操作区域保持暗红色照明。使用峰值波长为650 nm或更长的LED，以避免在解剖过程中视锥细胞感光色素被漂白。</li>
		<li>将小鼠置于通风良好且避光的盒子中暗适应2小时，以确保记录时视锥细胞完全敏化。</li>
		<li>在通风橱中使用异氟烷（5%）通过蒸发器和可密闭的容器对小鼠进行麻醉，容器内放置标准小鼠笼。操作蒸发器时需严格遵循制造商的说明。佩戴手套和口罩以减少过敏原暴露。</li>
		<li>使用放大倍数为10–40倍的双目显微镜进行解剖。</li>
		<li>通过断头法处死麻醉后的小鼠。</li>
		<li>为确定方位，使用防水笔在每只眼睛的上方（= 背侧）做标记。注意区分使用的是左眼还是右眼。</li>
		<li>使用弯头剪刀小心剪断眼球后方的视神经，以摘除眼球。进行解剖时，将眼球转移至含有新鲜碳氧合细胞外液的培养皿中。转移眼球时，应捏住视神经残端进行操作。</li>
		<li>在角膜与巩膜交界处的任意位置刺穿眼球即， 在 锯齿缘）使用锋利的注射针头。</li>
		<li>用镊子夹住巩膜，轻轻将剪刀的一侧刀片插入前一步骤中制作的孔洞中，沿边缘剪开 锯齿缘 将眼球前部（角膜、晶状体、玻璃体）与后部（眼杯）分离。在标记笔标记的位置沿放射方向（朝向视盘）切割眼杯，以指示视网膜的背侧位置。 
		注意：以这种方式制备的视杯可保存在持续通入碳酰化气体的溶液中，以备后续使用。</li>
		<li>将培养皿中的眼球杯旋转，使背侧切口朝向远离操作者的方向。用两把镊子分别夹住眼球杯左侧和右侧的巩膜，镊子尖端插入视网膜与巩膜之间。</li>
		<li>轻轻翻转眼杯的巩膜部分以分离视网膜。最后用显微解剖剪剪断视神经，使视网膜完全脱离巩膜。 
		注意：此步骤至关重要。避免损伤视网膜（例如， 用镊子触碰并用力挤压。</li>
		<li>用一对镊子夹住视网膜的一侧边缘，用另一对镊子轻轻清除视网膜表面的碎屑和玻璃体。当视网膜表面清洁后，使用显微解剖剪在表面再做三个较短的放射状切口（大约每隔 90°）。这些切口可使视网膜被仔细展平，感光细胞面朝下置于培养皿中（图1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片制备（10 - 15 分钟）
	<ol>
		<li>预先准备好用于视网膜切片的硝酸纤维素滤膜以及用于贴片和转移切片至记录室的玻璃盖玻片。使用剪刀将硝酸纤维素滤膜剪成约10 × 5 mm大小的矩形片。使用玻璃切割刀将盖玻片切割成约10 × 5 mm大小的矩形片。</li>
		<li>将载玻片缓慢浸入靠近组织的细胞外溶液中。用镊子夹住视网膜边缘，轻柔地将视网膜（节细胞层朝上）拉至载玻片上。此操作可减少组织的机械损伤和折叠。</li>
		<li>选择与相应研究问题相关的视网膜区域（另见讨论部分）。请记住，步骤 2.2.9 中所做的长切口标记的是背侧视网膜半区图1A）。使用弯头手术刀片从选定的视网膜区域切下一小块约1 × 2 mm的矩形组织。擦去组织周围多余的溶液。</li>
		<li>将滤膜置于视网膜组织上，使节细胞侧贴附于膜上。立即在膜上滴加一滴细胞外液，以牢固地将组织固定于滤膜上。</li>
		<li>将带有膜支撑的视网膜组织转移至含有新鲜细胞外液的切片室中。</li>
		<li>将视网膜切成垂直切片 200 µm 厚度（图1B使用连接在组织切片机上的新剃须刀片进行操作23每次处理视网膜组织时均需更换刀片。 
		注意：刀片必须与切片室底部表面完全对齐，以确保膜在整个表面上同时裂开，切割时会发出“咔哒”声；否则刀片可能发生弯曲，从而损坏切片。</li>
		<li>仅将高真空润滑脂涂抹于膜片两端，将一片带膜的切片粘附到玻璃盖玻片上（图1C）。保持视网膜下方的玻璃表面无油脂。</li>
		<li>将载玻片固定的脑片置于孵育槽（一个密闭且避光的容器）中，并用一滴细胞外液覆盖，保持湿润。 例如， 一个培养皿，皿盖覆盖铝箔，在室温下置于含二氧化碳的气体环境中。通过向一个小的水储 reservoir 中通入二氧化碳气体以保持孵育 chamber 内环境湿润，防止脑片干燥。</li>
		<li>让切片在孵育 chamber 中静置 10 - 15 分钟，然后将其（逐个）转移至记录 chamber。切片可在室温（~21 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 双光子 Ca2+ 成像
<ol>
	<li>双光子显微镜
	<ol>
		<li>使用可移动物镜显微镜（MOM）型双光子显微镜。MOM设计及成像步骤此前已有描述24，详情请参见10,21,25 （来源与公司信息，见下文） 表1). 
		注意：任何满足以下最低要求的直立式双光子显微镜均可使用：必须配备（a可调谐至约860 nm的脉冲激光器，b至少两个同时采集的荧光通道，(c）eCFP 和黄色荧光蛋白（citrine）荧光滤光片，（d) 一个光刺激器（有关可能的设计，参见24,26），以及（e) 软件，该软件能够以足够高的帧率记录延时图像序列，从而分辨出 Ca2+ 感兴趣信号</li>
		<li>按照制造商的说明启动双光子成像系统。严格遵守设施的激光安全指南。启动激光器，并将其调谐至约860 nm。</li>
		<li>将切片从储存室转移至记录室，并立即开始用含碳酰胺的细胞外溶液灌流。维持灌流速度为2 ml/min，温度为 37 °C 在记录室中。</li>
		<li>使用20倍、数值孔径（NA）0.95的水浸物镜。如有条件，可结合使用CCD相机与记录室下方的红外LED光源以定位视网膜切片图2）。否则使用双光子成像定位切片（参见3.1.5）。</li>
		<li>切换至双光子成像以观察生物传感器表达。开启两个检测通道，用于eCFP和citrine的荧光成像。</li>
		<li>使用控制双光子显微镜的图像采集软件扫描并选择一排视锥细胞终末用于记录（图3A）。将图像采集设置为 128 × 16 像素图像（31.25 Hz）或类似配置。将扫描区域限制在视锥细胞终末，以避免外段光敏色素的漂白。 
		注意：对于TN-XL钙传感器（Ca的τ ≈ 0.6秒）2+ 结合，τ ≈ 0.2 秒，对应 Ca2+ 解离；参见16建议最低帧率为约 8 Hz。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光刺激与记录
	<ol>
		<li>使用如其他文献所述的全视野视网膜下刺激光源10,21,26 执行以下步骤。 
		注意：一种实现全视野光刺激器的简单方案是使用两个带通滤光的LED（例如， “蓝色”：360 BP 12，“绿色”：578 BP 10）与小鼠视锥细胞的波长敏感性相匹配，同时又不与荧光检测所用的滤光片产生重叠cf3.2.4）。LED 光源发出的光经聚光镜聚焦后，穿过记录室的底部（图2）。有关该刺激器设计、校准方法、所用光强及诱发的视锥细胞光异构化速率的详细信息，请参见10,21,26.</li>
		<li>打开激光器，让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光（20–30 秒，参见注意事项），然后再呈现光刺激（见 3.2.3）或施加药理学试剂。</li>
		<li>开始呈现任意刺激例如， 光闪烁，如图所示 图3B,C）。对于步骤3.2.1中所述的刺激器，通过使用由定制软件控制的微处理器板随时间调节两个LED的强度来生成刺激信号（详见10,21,26).</li>
		<li>开始记录两个荧光通道（例如，483 nm 处用于“蓝色”FRET 供体 eCFP，535 nm 处用于“黄色”FRET 受体；具体参数见 表1) 同时使用相应的图像采集软件（另见 3.1.6）。例如，在光闪刺激的情况下（图3B,C），记录至少8到10次刺激呈现（试验）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>“切片内”钙成像2+ 校准
	<ol>
		<li>记录 Ca2+ 视锥细胞终末中的信号（如3.1.6和3.2.4节所述）并提取基础钙水平2+ 一组锥体细胞中的水平（如3.4所述）。</li>
		<li>切换至“Ca2+ 无细胞的细胞外培养基 5 µM 离子霉素（溶于DMSO）和10 mM EGTA（或替代使用BAPTA）加入后，每5分钟再次记录视锥细胞终末的荧光比值，以确定最小荧光比值（R分钟), 即， 细胞内钙几乎不存在时的比值2+这可能需要15至30分钟。 
		注意：需要一个允许在不同储液器之间切换的灌流系统。</li>
		<li>更换为细胞外培养基 5 µM 离子霉素（溶于DMSO）和2.5 mM Ca2+孵育5分钟后，每隔5分钟再次记录视锥细胞，以测量最大荧光比值（R）最大), 即， 存在饱和浓度胞内 Ca 时的比值2+离子霉素处理后，可能需要 3 - 15 分钟才能观察到 Ca2+ 比值趋于稳定。 
		注意：将切片暴露于高 Ca2+ 且长时间使用离子霉素最终会损伤细胞。分析时仅包括保持正常形态的细胞。浓度（即， EGTA、ionomycin）可能需要进行调整。有关 Ca 的更多细节2+ 校准方案，参见13,17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析 
	 注意：使用与相应显微镜软件兼容且能够运行自定义分析脚本的图像处理和数据分析软件包。
	<ol>
		<li>载入成像数据文件，并在每个视锥细胞终末周围绘制感兴趣区域（ROIs）图3A）。对每帧图像，先计算ROI内的平均荧光强度并减去背景荧光，然后计算FRET受体（citrine）与供体（eCFP）荧光强度的比值（R=FA/D; 图3B,C）。该比值通常用作细胞内相对钙离子浓度的替代指标2+ 浓度，但在校准后（见3.3），也可估算绝对浓度（见3.4.3）。 
		注意：可通过其在外界网状层中的位置和形态来识别节细胞突起（形态略呈扁平的“斑点状”，小于视锥细胞胞体，位于视锥细胞轴突末端）。</li>
		<li>平均刺激试验（图 4A）。从平均迹线中提取响应参数（图4B），例如 Ca2+ 基线水平（R基础) 光刺激前的峰值幅度（R安培）以及曲线下面积（RA) 作为反应幅度的衡量指标。同时，从平均迹线中提取反应动力学参数，例如反应上升时间（t上升) 和衰减时间（t衰变)（= R 的 20% 到 80% 之间对应的时间间隔）安培；见示意图 图4B）。有关如何确定这些参数的更多细节，请参见10.</li>
		<li>计算绝对视锥细胞Ca的估计值2+ 根据步骤 3.3.1–3.3.3 的测量结果计算浓度。使用最小和最大 Ca 的比值2+ 浓度，R分钟 和 R最大，分别对应于Ca中供体荧光2+-结合（FD,Ca-结合）和未结合（FD，无钙）状态，以及 体内 解离常数（Kd = 0.77，参见16) 用于TN-XL，采用以下公式（类比于27):</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="钙离子浓度方程、比率计算、荧光、分析公式、科学研究。" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">

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<li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+interactions+in+the+outer+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li>
<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death & Disease. 4, e488(2013).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495(2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

现有的使用电生理单细胞记录或合成荧光指示剂进行 Ca2+ 成像的方案，由于多种技术原因，难以记录小鼠视锥感光细胞中的 Ca2+ 动态（见引言）。本文所述的方案能够以一种高效且相对简单的方式，对单个、明确识别的小鼠视锥细胞终末中的 Ca2+ 信号甚至绝对 Ca2+ 水平进行测量。
该实验方案已成功应用于三项研究，分别探讨了健康小鼠视网膜视锥细胞功能的不同方面。在第一项研究10中，通过免疫组织化学、视网膜电图（ERG）记录、双光子Ca2+成像和药理学方法对HR2.1:TN-XL小鼠进行了表征，结果表明视锥细胞特异性表达的Ca2+生物传感器不会影响视锥细胞的结构与功能。在第二项研究21中，研究人员系统绘制了小鼠视网膜上视锥细胞的色觉与非色觉反应特性，揭示了“绿色”视蛋白主导的背部视网膜与“蓝色”视蛋白主导的腹侧视网膜之间在视锥细胞功能上的显著差异。这些区域性功能差异与自然环境中不同的对比度分布（即天空与地面）相匹配，提示小鼠不同类型视锥细胞可能实现了对非色觉对比度的（接近）最优采样，从而具有进化上的优势。在第三项研究22中，研究了水平细胞对视锥细胞轴突终末的反馈调节机制。由于所有已提出的水平细胞反馈机制均作用于视锥细胞轴突终末上的电压门控Ca2+通道28，因此视锥细胞终末的Ca2+信号可作为水平细胞-视锥细胞相互作用的间接指标。Kemmler及其同事的研究22支持了如下观点：水平细胞采用包含多种机制的复杂反馈系统来调控感光细胞的谷氨酸释放。
这些研究展示了所述方案的多功能性，并表明其可适用于一系列有关视锥细胞功能及其突触环路的问题。此外，该方案能够用于研究视锥细胞不同区室中的局部 Ca2+ 信号传导，从而更深入地理解视锥细胞的生理特性。此类知识对于理解视锥细胞变性过程中的病理生理机制至关重要，最终有助于合理设计潜在的治疗策略，特别是针对影响视锥细胞的变性疾病。
在HR2.1:TN-XL小鼠品系中，Ca2+ 生物传感器在整个视锥细胞中均有表达，但外节除外。这为直接进行钙离子的比率测定提供了机会2+ 不同视锥细胞区室中的动力学变化。由于Ca2+ 外段的电流反映在终末部位 通过 膜电位及由此引发的电压门控钙通道的激活2+ 通道，可间接观察外段中的过程。
潜在问题：
视网膜的分离是一个关键步骤：在小鼠中，视网膜通常在感光细胞外节与色素上皮之间从眼球壁分离。因此，分离后的视网膜其感光细胞外节暴露在外，对机械损伤极为敏感。操作时必须格外小心，避免用工具触碰感光细胞侧，或在粘附表面（例如，滤膜）上横向移动组织而造成损伤。
高质量的视网膜切片在显微镜下可通过其平整的切面以及具有清晰外段结构的有序排列的感光细胞层来识别。切片质量的功能性评估可通过施加强光刺激并测定有反应的视锥细胞百分比快速完成（例如， 在包含10至20个视锥细胞的视野范围内。此处应通过计算信噪比（S/N）来评估反应质量（即光刺激前基线噪声的幅度） 与 光反应的幅度）；信噪比达到2-3应视为最低阈值。通常，我们会剔除响应锥细胞比例低于50%的切片。此外，对于表现出过度自发性放电行为的锥细胞的切片（参见 图&#160;4&#160;在10应丢弃。
在记录室中符合上述解剖和功能标准的视网膜切片可维持稳定反应达1至2小时（有关反应一致性的详细信息，参见10）。由于切片在孵育室中可存活数小时，因此一次成功的实验最长可持续达6小时。值得注意的是，在研究视锥细胞与水平细胞之间的长距离空间相互作用时存在一定的局限性，因为切片过程不可避免地会切断视网膜网络中的侧向连接。然而，将视网膜切片厚度增加至300 µm 可在一定程度上缓解这一问题22。
使用垂直视网膜切片可避免激发激光扫描对光敏感的视锥细胞外段，从而在很大程度上防止视蛋白漂白（详见文献10,21）。然而，所记录的Ca2+信号不仅依赖于光刺激，还会受到扫描激发激光所产生的背景光照成分的影响。事实上，此类双光子成像实验中的有效背景光照是由散射的激光、记录细胞自身发出的荧光以及任何LED刺激的背景成分共同组成的。因此，在开始记录前，应让视锥细胞在激光扫描条件下（同时开启光刺激的背景成分）适应至少20至30秒。
优点与应用：
尽管上文已描述了该视锥细胞Ca2+成像方案的一些应用10,21,22，但仍可设想其他用途：将药理学研究与视锥细胞Ca2+成像相结合，可用于验证视锥细胞中的Ca2+信号通路，并评估靶向Ca2+信号通路中不同组分的药物的有效性和效力10。然而，一个关键的应用可能是研究影响视锥细胞功能的疾病。目前已存在多种模拟人类疾病的视网膜变性小鼠模型。例如，视锥细胞光感受器丢失1（cpfl1）小鼠是一种由Pde6c基因突变引起的原发性视锥细胞变性模型29。相反，视杆细胞变性1（rd1）小鼠则携带Pde6b基因突变，导致原发性视杆细胞光感受器变性30；然而，当rd1小鼠的视杆细胞完全丧失后，会继发出现视锥细胞变性1。将这些动物与HR2.1:TN-XL小鼠杂交，将有助于研究和比较原发性与继发性视锥细胞变性过程中的Ca2+动态变化，有望深入揭示Ca2+在视锥细胞死亡过程中的作用。此外，通过药物诱导的视锥细胞变性（例如使用选择性PDE6抑制剂）也可用于识别视锥细胞变性的下游机制10,29,31。
综上所述，本文所述方案可用于测量小鼠视锥光感受器亚细胞区室中的 Ca2+ ，并为揭示视锥细胞在多种生理及病理生理条件下的生理特性提供了重要机会。此外，该方案还可用于筛选旨在干预视锥细胞 Ca2+ 信号通路的药理学试剂，从而有助于建立针对视锥细胞疾病的新型治疗方法。

视觉始于视网膜感光细胞中光诱导的光转导级联反应的激活。视杆感光细胞介导弱光环境下的视觉，而视锥感光细胞则负责颜色感知和高分辨率的日间视觉。许多感光细胞特异性基因易发生突变，导致这些细胞退化。目前已鉴定出多个与感光细胞丢失相关的分子标志物1，但具体的分子机制及事件发生的时序仍不明确。人们推测钙离子（Ca2+）稳态失衡可能是感光细胞死亡的触发因素，这一假说得到了退变过程中Ca2+依赖性钙蛋白酶（calpain-type proteases）活性上调的支持2,3。然而，迄今为止，该假说尚缺乏对Ca2+水平的生理学直接测量证据。多项关于Ca2+通道阻滞剂在视网膜疾病中作用的研究结果存在不一致，进一步质疑了Ca2+在细胞死亡中的作用4-6，因此亟需能够直接评估哺乳动物视锥感光细胞中Ca2+水平的方法。
以往，大多数电生理记录和Ca2+成像研究均在两栖类和爬行类模型中进行，原因是视锥细胞更易于接近7-9。然而，哺乳动物感光细胞的生理特性可能与非哺乳动物存在差异10，尤其是在人类遗传性视网膜变性的研究背景下，深入理解哺乳动物感光细胞的生理机制是开发创新疗法的关键。目前已有多种模拟人类视网膜疾病的鼠类模型，但关于小鼠视锥细胞内Ca2+动态变化的研究仍十分有限11。电生理技术不适用于对视锥细胞进行高通量记录，特别是在小鼠中，视杆细胞数量（约97%）远超视锥细胞（约3%）12。此外，诸如全细胞膜片钳等高灵敏度电生理技术会干扰细胞内环境，仅能提供Ca2+电流信息，而无法测定细胞内Ca2+的绝对浓度。因此，尽管成像技术的时间分辨率相对较低，但在研究视锥细胞Ca2+动态变化时仍是首选方法。成像技术的关键问题在于如何选择性地将荧光Ca2+指示剂染料标记到视锥细胞上。通过“批量负载”方式将合成Ca2+指示剂染料引入组织，难以实现良好的区室化和细胞特异性。因此，标记后的视锥细胞、视杆细胞13,14以及Müller胶质细胞难以可靠区分。此外，合成染料容易从细胞中泄漏，导致无法在稳定条件下进行长时间记录。同时，以AM酯形式加载合成Ca2+指示剂也存在问题，因其需要使用去垢剂（例如 DMSO），并会产生甲醛15。对于绝对Ca2+浓度的测定，必须使用比率型指示剂。然而，目前最常用的合成比率型指示剂Fura-2需要700至760 nm范围内的激发光（用于双光子激发），该激发光本身可能刺激视锥细胞，从而妨碍在生理光照条件下对视锥细胞Ca2+动态变化的研究。
与合成染料不同，基因编码的 Ca2+ 指示剂可在特定细胞类型中选择性表达。它们不会从细胞中泄漏，因此，只要避免光漂白，即可实现长时间且可靠的比率测量。Ca²⁺指示剂的细胞类型选择性表达2+ 生物传感器与双光子显微镜结合，是评估和研究亚细胞钙信号的有力工具2+ 在大体生理条件下13,16,17. 本文介绍了一种研究光刺激诱发的视锥细胞Ca2+ 转基因 Ca 的动力学2+ 生物传感器小鼠品系（HR2.1:TN-XL），表达基于FRET的Ca2+ 生物传感器 TN-XL18 在人类红视蛋白启动子HR2.1驱动下，特异性地在视锥细胞中表达19. 为接触视锥细胞终末，需进行以下操作 离体 切片制备20 已采用该方案。该方案此前已在三项关于健康小鼠视锥细胞功能的研究中成功应用10,21,22此外，该方案还允许研究视锥细胞的Ca2+ 特定遗传条件下的信号传导， 例如， 通过将遗传性视网膜变性小鼠模型与HR2.1:TN-XL小鼠杂交育种。

<table><tbody><tr><td>高真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>76 x 26 mm; 
&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>组织切片机刀片</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX No. 1044</td><td>0.25 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.martor.de">http://www.martor.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>定制构建</td><td></td><td>基于 F. Werblin&lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt; 的设计，由 T. Schubert 改进</td></tr><tr><td>带网格的硝酸纤维素滤膜</td><td>Merck Millipore</td><td>AABG01300</td><td>滤膜类型：0.8 &amp;micro;m;

&lt;a href=&quot;http://www.emdmillipore.com">http://www.emdmillipore.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>异氟烷 CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>基于紫外/绿光 LED 的全视野刺激器</td><td>定制构建</td><td></td><td>详细信息见&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>开源微处理器板</td><td>Arduino</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>成像软件 CfNT</td><td>自主编写</td><td></td><td>由德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所 Michael M&amp;uuml;ller 开发</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>VC3-4 系统局部灌流系统</td><td>ALA Scientific Instrument</td><td></td><td>配备 100 &amp;mu;m 直径喷口的分流管； 

&lt;a href=&quot;http://www.alascience.com/">http://www.alascience.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee（钛宝石激光器）</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>可移动物镜显微镜（MOM），&lt;br/&gt; 由德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所 W. Denk 设计</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w 物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>100 系列麻醉蒸发器</td><td>Surgivet</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>钙离子霉素，钙盐</td><td>Life technologies</td><td>I24222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101191250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>leica microsystems</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

成像小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中的 ca2+ 动态变化

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

视网膜视锥光感受器（视锥细胞）负责明视觉，并是颜色分辨的基础。视锥细胞易发生退行性变，常导致多种视网膜疾病中的失明。钙离子（Ca2+）作为光感受器信号转导和代谢中的关键第二信使，已在多种动物模型中被推测与光感受器退变间接相关。然而，由于视锥细胞体积微小，尤其是小鼠视网膜以视杆细胞为主，难以对其进行电生理记录，这严重阻碍了对视锥细胞生理学及病理生理学特征的系统研究。为克服这一难题，我们建立了一种双光子 Ca2+ 成像方案，利用一种转基因小鼠品系，该品系仅在视锥细胞中特异性表达基因编码的 Ca2+ 生物传感器 TN-XL，且可与光感受器退变的小鼠模型进行杂交。本方案包括制备小鼠视网膜的垂直切片（“切片”），以及对光刺激诱发的视锥细胞 Ca2+ 水平变化进行光学成像。该方案还允许对切片内 Ca2+ 的绝对浓度进行“切片内测量”，因为记录后可进行校准。本方法可用于研究视锥细胞的功能特性，有望增进对视锥细胞 Ca2+ 信号通路以及 Ca2+ 在光感受器死亡和视网膜退变中潜在作用的理解。

通过结合来自HR2.1:TN-XL小鼠视网膜的垂直切片（图1）与双光子成像技术（图2），我们能够对视锥光感受器轴突末梢中由光刺激诱发的Ca2+信号进行比率测量。该方法相较于使用合成Ca2+指示剂的传统光学成像技术，在获取和可视化小鼠视锥细胞方面具有显著改进。例如，遗传编码的比率型Ca2+生物传感器TN-XL在视锥细胞中的特异性表达极大地方便了视锥轴突末梢的识别（见图3A中的感兴趣区域）。因此，本实验方案避免了记录来源不明确信号的风险，例如同时包含视锥和视杆细胞轴突末梢贡献的“混合”信号。
我们的方法能够在单个视锥细胞轴突末梢水平上解析单次试验的反应。光刺激引起的视锥细胞末梢钙离子（Ca2+）外排表现为供体荧光增强和受体荧光减弱（图3B）。荧光比值（R）的下降对应于视锥细胞末梢钙离子（Ca2+）的外排（图3C），这是由于光诱导视锥细胞超极化，进而导致电压门控钙离子（Ca2+）通道关闭所致。由于可同时监测多个视锥细胞轴突末梢（图3A），数据采集效率非常高，单次实验即可收集数百个视锥细胞钙离子（Ca2+）反应。通过定量评估这些反应（图4），可在多种条件下比较和评价视锥细胞钙离子（Ca2+）信号（见讨论部分）。
通常，使用FRET受体（citrine）与供体（eCFP）荧光强度的比值（FA/FD；详见3.4节）作为细胞内Ca2+水平的相对度量已足够。然而，在必要时，该比值可进行校准，以获得绝对的细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]）（图5）。在本实验方案所用的背景光照条件下（详见10及图3图注），校准得出“野生型”HR2.1:TN-XL小鼠视锥细胞终末的静息[Ca2+]绝对浓度为243 ± 159 nM（均值 ± 标准差），该数值处于文献报道的小鼠相关数值范围内11。
<img alt="视网膜切片示意图；用于显微镜观察的视网膜切片制备；解剖标记。" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 垂直视网膜切片的制备。（A） 已分离并展平的视网膜，准备进行切片。（B） 切片后的一块矩形视网膜组织（见A图中红框），固定在滤纸膜（深灰色）上。（C） 将膜支撑的视网膜切片用封固剂固定在玻璃盖玻片上的俯视图。（D） 视网膜切片局部的示意图（见C图中红框）。视锥光感受器以绿色标示。V，腹侧；D，背侧；N，鼻侧；T，颞侧；OS，外段；ONL，外核层；OPL，外丛状层；INL，内核层；IPL，内丛状层；GCL，节细胞层。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="激发激光和视网膜切片在灌流室中的荧光显微镜装置示意图。" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 视网膜切片的双光子成像：记录配置示意图。顶部：浸水物镜将扫描激光束（红色向下的箭头）聚焦至视网膜内，并收集发射的荧光信号（向上的箭头）。当使用CCD相机对切片进行成像时，该物镜还收集来自聚光镜下方安装的照明LED透射的红外光。中部：置于记录室中并用细胞外溶液灌流的视网膜切片。底部：聚光镜将刺激LED（以及用于CCD相机成像的红外LED）发出的光通过记录室的透明底部聚焦到视网膜组织中。IR LED，红外发光二极管；CCD，电荷耦合器件；BP，带通滤光片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="钙成像荧光信号图；eCFP、citrine、ROI 分析、光强度响应。" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 小鼠视锥光感受器轴突末梢中由光诱导的 Ca2+ 反应。(A) 左图：记录聚焦于视网膜切片中视锥光感受器（绿色）的突触末梢（红色框）。右图：一个包含 7 个独立末梢的记录区域示例。荧光信号通过两个通道记录：一个用于 FRET 受体 citrine（上方；535 BP 50），另一个用于 FRET 供体 eCFP（下方；480 BP 32）。(B) 单个 ROI 中 citrine（FA）和 eCFP（FD）荧光强度的光诱导变化。(C) 视锥末梢对一系列持续 1 秒的强光闪光（间隔 5 秒）所呈现的 Ca2+ 反应（以 FA/FD 比值表示）。ROI，感兴趣区域；BP，带通滤光片；F，荧光强度；a.u.，任意单位；FRET，福斯特共振能量转移；eCFP，增强型青色荧光蛋白。刺激强度（以每视锥细胞的光异构化速率表示，单位为 103·P·s-1）：M-视蛋白和 S-视蛋白分别为 13.0 和 12.8，叠加在背景水平（= LED 关闭，激发激光扫描）约 10 的基础上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="闪光反应分析；显示光学信号 ΔR 动力学及时间参数的图表。" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 光诱导视锥细胞 Ca2+ 反应的典型定量分析。 (A) 单个视锥细胞终末记录的光诱导 Ca2+ 反应（以 ΔR 表示，单次试验：灰色迹线，n=16；平均值：黑色迹线）。(B) 基于平均 Ca2+ 反应确定的参数：静息 Ca2+ 水平（Rbase），代表光刺激前的基线；反应幅度以曲线下面积表示（RA）以及峰值振幅（Ramp）；反应起始动力学（trise，从 Ramp 的 20% 上升至 80% 所需时间）和反应衰减动力学（tdecay，从 Ramp 的 80% 下降至 20% 所需时间）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示在EGTA和离子霉素处理下静息钙浓度比值的图表。" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 绝对Ca2+浓度的估算。 在TN-XL小鼠的8个视锥细胞轴突末梢中记录的静息Ca2+浓度（[Ca2+]，以FA/FD比值表示）（圆圈，均值±标准差），在不同细胞外液条件下的结果：先在标准细胞外液中记录两次（Ctrl 1和2），随后在极低（“零”）[Ca2+]（含10 mM EGTA）和高[Ca2+]（2.5 mM）条件下记录，后两种条件均含有5 µM离子霉素，以平衡细胞内外Ca2+浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了一种利用小鼠视网膜的ex-vivo&#160;离体切片制备方法，监测视锥感光细胞轴突末梢中 Ca2+ 动态的实验方案。该方案可在小鼠这一重要的哺乳动物模型系统中，对视锥细胞的 Ca2+ 信号传导进行系统性研究。

成像小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中的 Ca2+ 动态变化

视网膜视锥光感受器（视锥细胞）负责明视觉，并是色觉分辨的基础。视锥细胞易发生退行性病变，常导致……

本实验的总体目标是利用荧光生物传感器，记录小鼠视网膜视锥光感受器中由光刺激诱发的钙信号。该目标通过分离表达基因编码钙传感器的转基因小鼠品系的视网膜来实现，该传感器仅在视锥光感受器中特异性表达。第二步是将视网膜组织切成垂直切片。接下来，将视网膜切片固定在盖玻片上，并置于双光子显微镜下观察。最后一步是记录视锥光感受器单个突触终末在光刺激下的钙信号。最终，所记录的钙信号将进行离线分析。利用该方法，我们能够以亚细胞分辨率同时记录多种玉米食物受体的活性。这是相较于现有技术（如电生理单细胞记录）的主要优势，后者操作更为困难且耗时。因此，我们希望探讨的问题是：钙离子是否参与光感受器变性过程，以及其参与机制如何。该方法可帮助我们确定钙离子内流是视细胞变性的驱动因素，还是细胞死亡过程中的继发结果。通常，初次操作该方法的研究者主要困难在于，视网膜对光极为敏感，必须始终加以保护，因此包括视网膜分离和切片制备在内的所有精细操作均需在红绿光环境下进行。开始该实验时，将小鼠眼球转移至含有新鲜碳酸氧合细胞外液的培养皿中。使用锋利的注射针在角膜与巩膜交界处的任意位置刺穿眼球。接着，用镊子夹住巩膜并固定眼球，将一把剪刀的一个刀片轻轻插入孔中。沿锯齿缘剪开，以分离眼球的前部与眼杯。随后在笔标记的位置沿径向切开眼杯，以指示视网膜上的背侧位置。然后将眼杯放置成背侧切口朝外。用镊子尖端插入视网膜与巩膜之间，夹住眼杯左右两侧的巩膜。随后，轻轻翻转iica的巩膜部分，使视网膜脱离。最后，剪断视神经，使视网膜完全脱离巩膜。用一对镊子夹住视网膜边缘，用另一对镊子轻轻清除视网膜表面的碎片和玻璃体。当视网膜表面清洁后，再制作三个较短的放射状切口。现在将载玻片缓慢浸入靠近组织的细胞外溶液中。用镊子夹住边缘，轻柔地将视网膜（节细胞面朝上）拉至载玻片上，以减少对组织的机械损伤和折叠。接下来，使用弯头手术刀从选定的视网膜区域切下一小块约1毫米×2毫米的矩形组织，并擦去组织周围多余的溶液。然后将预先准备好的硝酸纤维素纤维膜覆盖在视网膜组织上，使节细胞侧贴附于膜上。立即在膜上滴加一滴细胞外液，以使组织牢固地附着于膜上。将固定在膜上的视网膜组织转移至含有新鲜细胞外液的切片室中，然后将视网膜切成200微米厚的纵向切片。使用组织切片胶，将单个固定在膜上的切片粘附到预先涂有高真空油脂的玻璃盖玻片上。保持视网膜下方的玻璃表面清洁且无油脂。随后，在室温下向保存室中每个已安装的盖玻片切片上添加一滴细胞外溶液。通过向一个小的水储液池中通入碳合气（carbogen）气泡，将碳合气引入保存室，以维持保存室内的湿润气体环境。将切片在孵育室中静置10至15分钟，然后逐个转移至记录室。将切片从孵育室转移至记录室后，立即开始用碳酸化细胞外溶液灌注。维持灌注流速为每分钟2毫升，温度为37摄氏度。在记录浴槽中。使用20倍、数值孔径（NA）为0.95的水浸物镜，结合位于记录浴槽下方的红外LED和CCD相机。为定位视网膜切片，按照制造商说明启动双光子成像系统。接下来，打开激光器并将其设置为 860 纳米。开启两个检测通道，用于 ECFP 和柠檬黄荧光蛋白的荧光成像。随后，使用图像采集软件控制双光子显微镜进行扫描，并选择一排视锥细胞终末用于记录；将图像采集设置为 128 × 16 像素的图像或类似配置，限制扫描区域仅覆盖视锥细胞终末，以避免外段中感光色素的漂白。打开激光器。在施加光刺激或药理学试剂之前，让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光 20 至 30 秒。现在开始呈现任意刺激。通过使用由定制软件控制的微处理器板，随时间调节两个LED的强度来生成刺激。然后使用相应的图像采集软件同时开始记录两个荧光通道。记录聚焦于视网膜切片中视锥光感受器的突触终末。这是包含七个独立终末的记录区域示例。荧光使用两个通道记录，一个用于游离的Scepter Citrine，另一个用于FRET供体ECFP。此处显示的是在单个感兴趣区域内记录的Citrine和ECFP荧光的光诱发变化。此处显示的是视锥细胞终末在5秒间隔下对一系列持续1秒的强光闪光刺激所呈现的钙反应。该图展示了光诱发视锥细胞钙反应的典型定量分析结果。此处为单个视锥细胞终末的光诱发钙反应。该图展示了平均钙反应的确定方法。静息钙水平代表光刺激前的基线，反应幅度为 ra，即静息钙水平与峰值幅度之间、反应起始与终止动力学之间的面积。该方法可进一步扩展。例如，在多种药理学条件和强刺激条件下，光感受器的钙信号可能发挥重要作用，可用于深入研究光转导的不同步骤或适应机制。该技术可用于在正常生理条件下研究视锥光感受器中的钙动力学，这对于理解人类致盲疾病（如全色盲或视网膜色素变性）中的原发性和继发性视锥光感受器退化具有重要意义。

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