2015年4月7日
肺炎链球菌在心脏形成离散的非化脓性微小病变。概述的是心脏微病变形成的小鼠模型的方案。提供有关使用显微镜观察微病变、区分早期和晚期微病变以及检测恢复期动物心脏重塑的方法的指导。
以下实验的总体目标是证明感染小鼠心脏内 ESMO 心脏微病变形成的可重复方案。这是通过用 ESMO 感染小鼠并允许菌血症的发展来实现的,从而使细菌进入心脏脉管系统,在那里它们可以侵入心肌并形成微观病变。然后将心脏石蜡包埋并常规染色,或固定到 OCT 化合物中进行免疫荧光染色。
染色切片的评估可以显示心脏微病变随机分布在心肌胶原沉积和恢复期 my 心脏切片和心脏微病变内的肺炎球菌胶囊 演示程序。Armand Brown 是我实验室的研究生吗?尽管这种方法可以深入了解小鼠侵袭性肺炎球菌疾病期间肺炎链球菌对心脏的损害影响。
它也可以应用于来自其他系统的心脏样本,例如非人类灵长类动物或人类。首先在 Todd Hewitt 肉汤中将 ESMO 血清型 4 菌株 Tiger four 培养到 620 纳米处的光密度为 0.5。当达到正确的密度时,以 3, 500 G 的浓度沉淀培养物 10 分钟。
然后使用真空管线去除上清液,并用无菌 PBS 以每毫升 10, 000 个菌落形成单位重悬细菌。现在麻醉 10 至 12 周龄的瓣膜 C 小鼠,并用一对钝镊子轻轻捏住脚趾确认其麻醉状态,用带有细菌悬浮液的莲花注射器并连接 27 至 30 号针头。然后用一只手抓住麻醉的老鼠的骷髅头,同时用另一只手腹膜内注射 100 微升悬浮液,将每只老鼠放回笼子里。
小鼠通常在注射后 30 至 40 秒醒来。正确服用肺炎链球菌的剂量至关重要,否则小鼠可以从感染中恢复或过快地发展为侵袭性肺炎球菌疾病,从而无法形成病变。由于每种细菌菌株的耳晶状体水平不同,因此可能需要反复试验才能确定正确的剂量。
早期感染至少持续24 小时,晚期感染持续至少 30 小时。稍后对每只受感染的小鼠实施安乐死。首先,采集血液样本,用酒精棉签对尾巴进行消毒,然后剪掉两到三毫米的切片。
从剪断部位采集 2 微升血液。在含有肝素钠的 PBS 中以每毫升 1 单位的速度连续稀释血液 10 倍。将五级稀释液铺在三联大豆血琼脂平板上,并孵育过夜。
第二天进行菌落计数。按照下一节中的说明继续采集心脏。或者,感染后 30 小时。
尝试通过在 100 微升盐水中腹膜间注射氨苄西林来拯救小鼠。继续每 12 小时提供一次氨苄西林,持续 36 小时,并在所需的时间点收集心脏。首先,收获心脏。
将安乐死的小鼠固定在手术平台上的仰卧位,并用 70% 乙醇喷洒胸部并拍干。使用手术剪刀和镊子打开胸腔。取出胸腔并横切横膈膜以露出心脏和肺。
然后切开与心脏相连的血管,用镊子轻轻切除心脏,不要瘀伤。用 PBS 冲洗心脏,并将其放入组织标本采集盒中进行冠状切片。然后将包埋盒转移到 10% 缓冲的福尔马林溶液中,并在第二天送去进行石蜡包埋。
在早期阶段,可以通过颜色外观的变化来识别心脏病变,在某些情况下还可以通过免疫细胞的存在来识别。在晚期病变中,免疫细胞将不存在且很大。在它们的位置发现类似 VA 的病变。
在带正电荷的载玻片上使用 5 微米的心脏切片,首先冷冻切片,然后解冻并让它们风干。将玻片在 10% 中性缓冲福尔米蛋白中于 25 摄氏度下固定 10 分钟。然后用 3 次洗涤和 PBS 去除固定剂,每次洗涤 5 分钟。
然后用 0.2%tritton X 100 的 PBS 溶液渗透组织 15 分钟。在纯 PBS 中再洗涤 3 次,去除洗涤剂。然后在 PBS 中冲洗后,用 PBS 中的 10% 涂层血清封闭组织一小时,在 37 摄氏度下用抗血清覆盖切片两小时。
用幼稚兔抗血清处理阴性对照 由于心脏组织容易吸收 XI 免疫荧光染色,导致高背景水平,因此可能需要优化不同类型抗体的孵育时间浓度 两小时后,用 PBS 洗去抗血清。然后用二抗替换溶液,让玻片在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。现在以每毫升 5 毫克的浓度涂抹 DPI,并用 PBS 洗涤载玻片。
最后,将载玻片安装在地板上,保存并用共聚焦显微镜成像。首先去除石蜡并水合组织切片。使用二甲苯清洗,然后进行一系列分级的酒精清洗。
然后将切片浸泡在 0.2% 磷酸化美因酸中 5 分钟,然后用 0.1% 严重红和酸冲洗下一个染色剂 5 分钟,持续 2 小时。然后在 0.01 正常盐酸中洗涤切片 3 分钟,并用 70% 乙醇冲洗 1 分钟。现在通过反转分级酒精浴系列来脱水切片,然后使用光学显微镜支架进行二甲苯洗涤并评估载玻片。
小鼠在与老虎一起攻击后患上了侵袭性肺炎球菌病。在心室中观察到 4 个拉伤性心脏微病灶,感染后 24 至 30 小时观察到病灶大小和数量增加,以检查肺炎是否确实在病灶内。对 Tiger four 产生的血清型 4 荚膜多糖切片进行染色。
这证实了微病变部位内存在紧密堆积和致密的聚集体。对用氨苄青霉素和未感染对照挽救的小鼠的心脏切片进行 Piro 严重红色染色。在救援中。
染色的存在和强度急剧增加,条带从似乎是心室中以前的病变部位流出。在尝试此程序时,重要的是要记住在感染小鼠时充分使用肺炎链球菌,让感染持续至少 28 至 30 小时,以便菌血症和心脏微病变有足够的时间形成。
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本文概述了一种用于研究感染肺炎链球菌的小鼠心脏微损伤形成的协议。该方法包括可视化技术和早期与晚期微损伤的区分,以及评估心脏重塑的方法。
Visualization and quantification of Streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions provide a reproducible preclinical model for interrogating host-pathogen interactions and cardiac tissue remodeling. This workflow enables mechanistic de-risking of infection-driven cardiac injury, supporting predictive confidence in translational research and target validation for anti-infective or cardioprotective strategies. The protocol's reproducibility and adaptability across model systems position it as a foundational tool for portfolio triage and early discovery decision-making.
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker development for infection-driven cardiac injury.