Name: 神经活动的传播的展开海马准备具有穿透微电极阵列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习使用穿透式微电极阵列对小鼠海马体进行展开制备，实现全脑区神经活动的同步记录。该技术可监测横向与纵向的神经信号传播，为研究海马体神经动力学机制提供新方法。

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本研究由美国国立卫生研究院（国家神经疾病与卒中研究所）资助（项目编号：1R01NS060757-01），并得到多米尼克·M·杜兰德（Dominique M. Durand）所获E.L.林德斯特捐赠讲席的支持。我们感谢安德鲁·M·罗林斯（Andrew M. Rollins）博士实验室在OCT成像方面提供的帮助。

注意：动物实验方案已通过大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本研究使用出生后10至20天（P10至P20）的CD1小鼠，性别不限。
1. 手术与实验记录用溶液
<ol>
	<li>配制正常人工脑脊液（aCSF）缓冲液，其成分（mM）为：NaCl 124、KCl 3.75、KH2PO4 1.25、MgSO4 2、NaHCO3 26、Dextrose 10 和 CaCl2 2。该正常 aCSF 用于组织解剖后的恢复，以及实验开始前灌流系统的清洗。</li>
	<li>配制在海马体解剖过程中使用的小分子 aCSF，其成分（mM）为：Sucrose 220、KCl 2.95、NaH2PO4 1.3、MgSO4 2、NaHCO3 26、Dextrose 10 和 CaCl2 2。为了在完整的海马组织制备物中诱导癫痫样活动，需将 4-氨基吡啶（4-AP）以 100 µM 的浓度加入正常 aCSF 中。</li>
</ol>
2. 完整海马制备的手术步骤
<ol>
	<li>将异氟烷（1 ml）滴入干燥器玻璃罐底部的腔室中（见“特定材料与设备”中的编号1），并用普通纸巾覆盖底板表面，以防止动物接触液体。随后将CD1小鼠放入罐中并盖上盖子。将动物置于密闭罐中约1至2分钟，当呼吸频率约为每秒一次时，将小鼠从罐中取出。</li>
	<li>将小鼠置于手术台上，使用合适的剪刀进行断头。断头后立即把头部浸入冰浴（3–4 °C）、充氧的蔗糖人工脑脊液（aCSF）中约30秒。</li>
	<li>使用精细剪刀（见“特定材料与设备”中的编号5）去除颅骨顶部的皮肤，并沿头部中线以及靠近颞叶两端处剪开颅骨。用镊子（见“特定材料与设备”中的编号6）将切开的颅骨向头部两侧剥离，以暴露脑组织。</li>
	<li>将微型实验铲（见“特定材料与设备”中的编号8）插入大脑顶叶与颅骨之间的缝隙，小心地将脑组织从颅底剥离，然后将其放置在预先准备好的、覆盖有湿润滤纸（见“特定材料与设备”中的编号2）的冰浴（3–4 °C）手术台上。用冰冻的刀片切除小脑，并沿脑中线切割以分离两个半球。随后将分离的两个半球放入盛有冰浴蔗糖aCSF并持续通入95% O2/5% CO2混合气体的烧杯中。</li>
	<li>取其中一个脑半球，放置在冰浴滤纸台上。在脑组织周围放置普通纸巾或滤纸以吸除多余液体。使用两根火焰抛光的玻璃移液管工具（见“材料与设备”中的编号10）将大脑皮层与脑中央其他部分分离。</li>
	<li>当海马体从皮层内部暴露并置于冰浴台面后，在组织上滴加2至3滴冰浴蔗糖aCSF，然后吸除海马体周围的多余液体。切断海马体两端与皮层的连接。随后使用火焰抛光的玻璃工具将海马体从脑组织中解剖出来，并去除残留的脑组织。</li>
	<li>将完整的海马体放置，使其alveus面朝上、海马沟（hippocampal sulcus）朝下。再次快速滴加2至3滴冰浴蔗糖aCSF于组织上，并用纸巾吸除组织周围的多余液体。使用火焰抛光的玻璃工具将整个海马体翻转，以暴露海马沟（图1B、C）。</li>
	<li>在普通光学显微镜下，将自制玻璃针（见“特定材料与设备”中的编号11）插入海马沟一端，沿沟的方向切断从齿状回（DG）至下托（subiculum）或CA1区的纤维连接（图1C）。如有必要，使用冰浴刀片修剪海马体的 septal 和 temporal 两端。将自制金属丝环（见“特定材料与设备”中的编号12）插入切开的海马沟中，在用火焰抛光玻璃工具固定海马体下托/CA1端的同时，将齿状回从组织中拉出（图1D）。</li>
	<li>完成上述展开操作后，再向组织上滴加2至3滴冰浴蔗糖aCSF，并吸除组织周围的多余液体。随后用冰浴刀片修剪展开后海马体的边缘（图1E），并用铲子将制备好的组织转移至盛有正常aCSF、持续通入95% O2/5% CO2、室温（约25 °C）环境下的恢复室中。将展开的海马体组织在记录前静置恢复约1小时。</li>
	<li>取另一个脑半球，重复步骤2.5至2.9。通常完成单个海马体展开操作需1至2分钟，过程中应持续滴加冰浴蔗糖aCSF，以保持组织的氧合与水合状态。</li>
</ol>
3. 实验系统设置
<ol>
	<li>将定制加工的 PMEA 粘接到针栅阵列（PGA）封装上，并使用微细引线键合技术将单个微电极的每个焊盘与封装上的针脚焊盘相连（图 3B）。然后，将封装插入自制电路板上的插座中13。</li>
	<li>在自制电路板上13，将每个微电极分别连接至带通截止频率为 1 Hz 至 4 KHz 的滤波器，以及增益为 100 的放大器。通过模数转换系统对电路板输出的模拟信号进行数字化，并在计算机上采集和存储数据。</li>
	<li>在阵列周围粘接一个带有进液和出液管路的定制塑料记录室，用于溶液流动（图 4A）。使用至少两个瓶子在系统中保存不同溶液，并通过一个三通阀连接并控制各瓶的输出管路。将三通阀的输出端连接至带有静脉输液滴注室的管路系统，引导溶液流入记录室。</li>
	<li>在三通阀与记录室入口之间的管路中加入电加热器，以在溶液进入记录室前将其加热至设定温度（35 °C）。将记录室的出口连接至真空管，使溶液流入与真空管相连的收集瓶中。本研究中所有实验均不得重复使用任何溶液。</li>
</ol>
4. 将展开的海马体放置于 PMEA 上以记录神经活动
<ol>
	<li>准备实验装置时，将一个瓶子装入正常 aCSF，另一个瓶子装入含 4-AP 的 aCSF。从每次实验开始时，即对两个瓶子持续通入 95% O2/5% CO2 混合气体。使用三通阀连接器控制实验过程中选择的灌注液。在记录室出口连接真空管，将废液抽入废液容器中。在溶液进入记录室之前对其进行加热，并维持溶液在受控温度（35 °C）。</li>
	<li>当记录室的进液口和出液口关闭后，使用自制的玻璃移液管将展开的海马体转移并放置于记录室内。在显微镜下，当组织漂浮在溶液中时，使用普通的小号画笔小心调整展开海马体的位置。将海马体的alveus面朝下放置，CA3区朝远离研究者方向，CA1区朝向研究者。</li>
	<li>使用真空移液器从记录室边缘小心吸除室内溶液，降低液面直至记录室干燥，使组织自然沉降到电极阵列上。随后，小心地将自制的组织固定锚（图4）（详见“特定材料与设备”中的编号14）放置在组织上方，以固定展开的海马体。向记录室中滴加数滴溶液以重新充满腔室，然后逐渐打开进液口和出液口，调节流速至静脉输液室中约每秒两滴的水平。</li>
	<li>先用正常 aCSF 在记录室中孵育组织约 1 分钟，使其恢复，随后切换为含 4-AP 的 aCSF 溶液，并适当调节流速。在含 4-AP 的 aCSF 中继续孵育组织约 5 至 10 分钟，待出现自发性电活动后，研究者即可启动软件开始记录信号。</li>
</ol>
5. 实验结束后从PMEA上移除组织
<ol>
	<li>通过显微操作器控制组织锚定装置，逐渐将组织从记录室中提起。关闭进液口和出液口，以停止记录室内的液体流动。记录室应充满溶液；若未充满，则添加数滴溶液以填满记录室。</li>
	<li>使用小号画笔轻轻挑起组织的每个角落。如果组织未在溶液中漂浮，则使用真空管小心吸干记录室中的液体，同时保持组织仍位于阵列上。然后缓慢打开进液口，逐渐重新注满记录室，当记录室充满后关闭进液口以停止液体流动。再次使用小号画笔轻轻挑起组织的每个角落。</li>
	<li>重复步骤5.2，直至组织完全从阵列上脱离并在溶液中自由漂浮。一旦组织开始漂浮，即使用真空管将其吸除。打开进液口的液体流动，并打开出液口的真空装置。用蒸馏水冲洗系统，然后将其干燥。</li>
</ol>

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<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microelectrode+Array+Technology+and+Neural+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过结合穿透式微电极阵列制备展开的海马体标本，可同时保留海马体的纵向与横向轴向结构，为研究海马体内的解剖连接或神经信号传播提供了强有力的工具7。该展开方法同样适用于成年小鼠海马体的研究。近期利用此标本的研究表明，由4-AP诱导的癫痫样活动可在整个展开的海马体区域以对角线波前的形式传播（图6）7,8。这些研究证明，当需要在平坦的海马神经网络中研究神经信号传播时，完整的展开海马体标本相较于横切或纵切脑片具有显著优势（图6）。
穿透式微电极相较于现有的微电极阵列（MEA）具有显著优势，后者由多个位于平坦表面的电极接触点组成11,12,17。由于细胞层位于表面以下约250至300 µm处，平坦表面电极的MEA在用于未展开的海马体时存在使用困难（图2）。本文所述的穿透式微电极阵列（PMEA）设计了64个穿透式电极，电极高度为200 µm，可深入组织内部，适用于研究神经信号传播7,13。此外，PMEA也可应...

理解神经传导或神经信号的传播对于确定大脑在正常功能和病理状态下神经通讯机制至关重要1-3。海马是大脑中被研究最为广泛的结构之一，因其在记忆、空间追踪等多种脑功能中发挥着基本作用，同时也参与多种显著影响行为的病理改变1,6。尽管海马具有复杂的组织结构，但其结构的各个组成部分在脑片制备中可被清晰识别并易于接近4-6。在海马的横断方向上，神经活动已知通过三突触通路传播，该通路包括齿状回（DG）、CA3、CA1和下托4,5。人们认为，突触传递和轴突传导在此横断回路的通讯中起主要作用4,6。然而，神经信号的传播同时发生在横断和纵向上4,6。这意味着仅使用脑片制备难以全面研究海马，因为此类制备限制了对特定传播方向的观察4。纵向脑片的开发旨在研究沿纵轴的轴突通路5。研究人员分别观察到主要沿横断轴和纵轴出现的行为特异性伽马波和θ振荡6。&#160;这些行为以往被独立研究，但要理解这些行为，同时获取两个方向的信息至关重要。即使有了完整海马制备技术的发展，由于海马自身的折叠结构，仍难以在整个组织中监测信号传播过程4。展开的海马制备则以二维平面细胞层的形式暴露了密集排列的神经元，从而提供了研究便利7,8。
通过展开齿状回（DG）（图1），海马体呈现出扁平化的矩形结构，其中横行和纵行的神经连接保持完整，锥体细胞层以二维片层形式排列，包含CA3和CA1区域，从而获得一块平坦的神经组织，可用于研究神经信号的传播（图2）8。随后可使用单根玻璃微电极、微电极阵列、刺激电极以及电压敏感性染料（VSD）来监测神经活动3,7,8。此外，还可利用转基因小鼠表达的基因编码电压指示剂来追踪神经信号的传播模式9。
展开的海马网络呈扁平构型，非常适合光学方法记录，也适用于微电极阵列。大多数 commercially available 阵列采用扁平或低轮廓电极制造，可记录组织切片和培养神经元中的神经活动10-12。然而，当信号来自完整组织时，由于神经元的胞体位于组织更深层，信噪比（SNR）会降低。因此需要高长径比的微电极阵列以提高信噪比。
为此，我们实验室开发了一种穿透式微电极阵列（PMEA），可通过将64根直径为20 µm、高度为200 µm的微针插入展开的海马组织中，直接探测组织内部活动7,13。与电压敏感染料成像相比，该微电极阵列具有更高的信噪比，且在实验过程中信噪比保持稳定7,13。展开的海马组织制备技术与PMEA的结合，为研究神经信号在二维平面上的传播提供了一种新方法。利用该技术开展的实验已取得重要成果，揭示了海马中神经信号传播的机制，表明神经活动可在无突触或电突触参与的情况下独立传播7。

<table><tbody><tr><td>干燥器罐</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td><td>在用于动物麻醉的罐子底部放置普通纸巾。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于展开海马体的刀片和定制手术平台</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>将培养皿倒置（置于中央）放入冰中，并在培养皿上放置一张湿润的滤纸。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>定制组织回收室</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>塑料管底部用塑料网固定，并在aCSF中用95% O2 / 5% CO2混合气体持续通气。</td></tr><tr><td>直式操作&amp;nbsp;剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17336B&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Medco 仪器编号：81995&amp;nbsp;</td><td>该剪刀用于&amp;nbsp;&amp;nbsp; 将小鼠断头处死。</td></tr><tr><td>Integra Miltex Goldman-Fox&amp;nbsp;剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-517&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; MILTEX INC&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 编号：5-SC-320</td><td>该剪刀用于剪开小鼠的颅骨。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Miltex&lt;br/&gt; 子宫切除钳</td><td>Claflin 医疗设备</td><td>CESS-722033-00001</td><td>该镊子用于剥离切开的颅骨以暴露脑组织</td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>该微型刮铲用于将半球的整个脑组织转移至记录室。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Frey Scientific 不锈钢半微量刮勺</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>此半微型刮勺用于将展开的海马体转移至恢复室内的葡萄糖aCSF中。</td></tr><tr><td>小号画笔</td><td>Lowe's</td><td>tem #：&amp;nbsp;105657&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 型号：&amp;nbsp;90219</td><td>正常油漆刷套装中尺寸最小的一支</td></tr><tr><td>火焰抛光玻璃辅助工具</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>该工具由普通巴斯德玻璃吸管制成，并经过火焰抛光。</td></tr><tr><td>定制玻璃针</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>该工具由普通巴斯德玻璃吸管制成，并经过火焰抛光。</td></tr><tr><td>定制玻璃工具，带金属丝环</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>该工具由常规的巴斯德玻璃吸管和重塑的金属丝环制成，并经过火焰抛光。</td></tr><tr><td>定制玻璃溶液滴管</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>该工具&amp;nbsp; 由普通巴斯德玻璃移液管制成，将其尖端剪断，并在剪断端连接橡胶头。</td></tr><tr><td>定制组织固定锚</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>尼龙纤维网被粘附在绝缘铜丝环上。组织固定锚由显微操作器固定。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>定制微电极阵列</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>有关该阵列的更多细节，请参见&amp;nbsp; Kibler 等，2011&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>为阵列定制的滤波器和放大器电路</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>有关该阵列的更多细节，请参见&amp;nbsp; Kibler 等，2011&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数据采集处理器 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>这是一个带有模数转换器的完整数据采集系统。</td></tr></tbody></table>

利用穿透式微电极阵列在展开的海马体标本中研究神经活动传播

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

本方案描述了一种制备新型 体外 结合微加工阵列的扁平海马体制备技术用于绘制海马体内的神经活动。横向海马体切片制备是研究海马体电生理学最常用的组织制备方法。此外，还开发了纵向海马体切片以研究海马体内的纵向连接。完整的小鼠海马体也可被维持 体外 因为其厚度允许足够的氧气扩散。然而，这三种制备方法均无法直接观察神经信号的传播，因为部分组织缺失或折叠。展开的完整海马体以扁平构型保留了横向和纵向的神经连接，可直接接触组织，从而全面分析海马体内信号传播的范围 体外为了有效监测细胞层的神经活动，研究人员制备并应用了一种定制的穿透式微电极阵列（PMEA）于展开的海马体上。该PMEA包含64个电极，高度为200 µm，能够记录小鼠海马体深部的神经活动。展开的海马体制备方法与PMEA的独特结合，提供了一种新的 体外 一种用于研究海马体二维CA1-CA3区域中神经活动传播速度与方向的工具，具有高信噪比。

图中所示数据是在海马组织展开制备标本中记录的，记录时在室温（25 °C）下向孵育液中加入4-AP（100 µM）aCSF。通常情况下，神经活动在5分钟内开始，但在一些较老年动物的海马组织中可能需要更长时间。使用PMEA观察到的4-AP诱导的神经元放电与先前报道的结果一致14,15。由于电极高度为200 µm，电极尖端位于细胞层正下方（图3C），而细胞层通常位于海马裂（alveus）上方250至300 µm处（图2），因此在样本实验的64个通道中，有57个通道的记录信号主要表现为正向偏转。然而，若记录电极尖端足够接近细胞层，则部分正向信号也可能同时出现小的负向偏转（图5B）。当电极尖端恰好位于细胞层水平时，记录到的信号将表现为非常尖锐的负向尖峰，并伴有正向偏移，或仅表现为负向尖峰（图5C）16。在本示例数据中，57个有效记录中有5个通道出现负向尖峰。在获取全部64个通道的数据后，采用单个归一化方法（图6B）沿记录的时间轴将神经信...

我们已经开发出一种 体外 保留海马神经元CA1-CA3排列的展开海马组织。结合穿透式微电极阵列，可同时在纵向和横向方向上监测神经活动。与海马脑片制备方法相比，该技术的优势在于能够同步记录整个海马内的信号传导。

本方案描述了一种结合微加工阵列制备新型体外扁平海马体标本以绘制神经元活动图谱的方法……

本实验的总体目标是介绍展开啮齿类动物海马体并将其平铺组织样本放置于穿透式微电极阵列上的过程，以用于记录。该过程首先从半侧小鼠脑组织中分离出海马体。第二步是使用定制工具展开海马体的弯曲结构。接下来，将展开后的海马体转移至记录室，并放置到记录电极阵列上。最后一步是在实验结束后将海马体从阵列上移除。最终，在数据分析中采用个体归一化映射方法，以展示穿透式微电极阵列记录到的神经活动传播。该技术的主要优势在于，能够让我们同时记录神经活动在横向和纵向两个方向上的传播。为了观察神经活动的真实传播情况，需要保持海马体的完整性，将齿状回展开并平铺于记录室中，从而使神经活动能够在横向和纵向两个方向上均得以传播。随后，我们能够确定组织中信号传播的速度。我们观察了两个方向的活动，并研究了传播机制，特别是非突触机制。我们能够看到活动通过突触传递以及缝隙连接进行传播，而根据其传播速度，可以确定这种传播并非由扩散引起。目前我们正致力于研究这种传播的实际机制。通常，初次接触该技术的研究人员会面临困难，其原因在于展开海马体并将平整的脑片组织放置到穿透式微电极阵列上这一操作过程较为复杂，且需避免对组织或阵列造成损伤。开始该操作时，先将小鼠头部置于冰冷的含氧蔗糖溶液中。使用一对精细剪刀去除颅骨的皮肤。接着，沿中线以及靠近颞叶的两端剪开颅骨。然后将切开的颅骨向头部两侧剥离。为了暴露脑组织，使用解剖刀小心地将脑从颅骨中取出。随后，将脑组织置于覆盖有湿润滤纸的冰冷手术台上。用预冷的刀片切除小脑。随后通过沿脑中线切割将两个半球分开。然后将分离的两个半球放入盛有冰冷蔗糖溶液的烧杯中。用95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和的脑脊液。将一个半球转移至覆盖有滤纸的冰上冷台。在脑组织周围放置普通纸巾或滤纸以吸收多余的溶液。随后，使用两根火焰抛光的玻璃移液管将大脑皮层与脑中央部分分离，以暴露海马体。接着，向组织上滴加 2 至 3 滴冰冷的 suse A 脑脊液，去除多余液体。切断海马体两端与大脑皮层的连接。然后使用火焰抛光的玻璃工具将海马体从脑组织中分离出来。随后将整个海马组织分离，使其外侧面朝上，海马沟朝下。迅速在组织上再次滴加2至3滴冰冻的sase人工脑脊液，并吸除其周围的多余液体。然后使用火焰抛光的玻璃工具将整个海马翻转。为暴露海马沟，使用预冷的刀片修剪海马的隔端和颞端。如有必要，将自制的玻璃针插入裂沟，切断从齿状回（DG）到海马CA3区的纤维通路。然后使用金属丝环将齿状回（DG）拉起并展开海马体。整个手术过程通常持续约两分钟。再向组织上滴加两到三滴冰冷的蔗糖人工脑脊液（sucrose A CSF），并吸除周围的多余液体。然后用冰冷的刀片修剪未展开的海马体边缘。将制备好的组织转移至恢复室中，恢复室内盛有常温的正常人工脑脊液（normal A CSF），并持续通入95%氧气和5%二氧化碳的混合气体，孵育1小时后，再将其转移至记录室。在此步骤中，取一个瓶子装入正常人工脑脊液（A CSF），另一个瓶子装入含四个AP A CSF气泡的溶液。从实验开始起，用含有95%氧气和5%二氧化碳的混合气体对溶液进行饱和。使用三通阀连接器来控制实验过程中选择使用哪种溶液。接下来，将一根真空管连接到记录室的出口。为将溶液转移至防尘容器中，应在输送溶液进入记录室之前对管路进行预热，并使其保持在35摄氏度的恒温条件下。关闭记录室的进液口和出液口后，使用自制的玻璃移液滴管将展开的海马体转移至记录室中。在显微镜下，将展开的海马体放置妥当，使其alvia面朝下，ca3区指向远离研究者的方向，ca1区指向研究者。使用真空移液器从记录室边缘小心吸除室内的溶液，直至室腔干燥，组织平贴于阵列上。然后，小心地将定制的组织固定锚置于组织上方，以将展开的海马体固定在阵列上。再向记录室中重新加入数滴溶液。逐渐打开进液口和出液口，调节流速，使静脉输液滴室中的液滴速度约为每秒两滴。将组织在记录室中用正常人工脑脊液（aCSF）孵育约一分钟，然后更换溶液。将四份AP溶解的aCSF加入并适当调节流速。在记录前，将组织在四份AP溶解的aCSF中孵育约5至10分钟。从PMEA中取出组织时，通过显微操作器控制组织锚定装置，并从记录室中逐渐提起锚定装置。关闭进液口和出液口以停止液体流动。在记录室中，使用小号画笔轻轻提起组织的一角。如果组织未在溶液中漂浮，可使用真空管小心吸干腔室内的液体，同时保持组织仍置于阵列上。然后小心打开进液口，逐渐重新注满灌流 chamber，随后关闭进液口以停止液体流动。当记录 chamber 充满液体后，使用小号画笔轻轻提起组织的一角。如果组织漂浮在溶液中，再次使用真空管将组织吸走。打开入口的流体和出口的真空。用蒸馏水冲洗系统并将其干燥。这是从位于基底树突区域的微电极之一记录到的由100 µM 4-AP人工脑脊液诱导的自发活动示例，其信噪比为34.9分贝。红色矩形框内为放大后的活动信号。这是来自另一根微电极的原始数据，该电极位置更靠近胞体，其信噪比为27.2分贝。以下为从位于胞体层内的电极所记录到的另一个示例。在此示例中，信噪比为 18.53 分贝，此处为从微电极记录到的基线噪声。基线的峰峰值通常为 150 至 200 微伏，单个电极的阻抗约为 1 至 2 兆欧。该视频展示了使用电极阵列记录并经单个归一化方法处理后的神经传导信号。在数据分析中，按照此操作步骤，整个信号在全部组织中的传播持续时间约为100毫秒。此外，还可以采用其他方法，例如对展开的海马组织进行离体神经成像，以回答更多问题，如神经焦点的移动情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何原位展开海马体，以及如何将扁平化组织样本制备到微电极阵列上。

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神经活动的传播的展开海马准备具有穿透微电极阵列

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

本视频演示了使用穿透性微电极阵列（PMEA）建立记录装置以采集展开状态下海马体神经信号的实验步骤。该方法使我们能够研究神经活动在展开海马体内的传播速度与方向...

使用穿透式微电极阵列记录展开的海马组织中的神经活动

本方案涉及使用微电极阵列（MEA）记录暴露于致痫药物的脑片中的电活动。该操作包括将脑片置于MEA记录室中，施加电刺激以诱导人工癫痫发作，并分析所产生的信号。...

利用微电极阵列监测脑片中癫痫发作诱导的神经电活动

本视频演示了在浸没式记录舱中放置脑切片以记录突触活动的操作流程。该过程包括将切片固定在镜片纸上，持续灌注人工脑脊液（aCSF）以维持神经元的活性，以及将刺激电极和记录电极准确地定位在特定的目标脑区附近。该装置可实现对基础突触活动以及电刺激效应的精确监测。...

记录急性海马脑片中的神经元场兴奋性突触后电位

本视频展示了在小鼠模型的海马体中进行立体定位植入金属丝电极阵列和光学纤维的操作过程。...

将电极阵列和光纤植入小鼠海马体

植入有序排列的微丝阵列用于单细胞电生理记录面临诸多技术挑战。 本文描述了实施该技术的方法及所需设备。 此外，还讨论了利用有序微丝阵列以高空间选择性记录不同神经亚区活动的优势。...

一种用于在清醒行为动物中植入有序排列的微丝电极阵列以进行单细胞记录的操作流程

本视频文章介绍了利用啮齿类动物急性海马脑片研究CA1锥体神经元中长期可塑性及其相关联的突触标记、捕获和交叉标记等过程的实验方法。...

利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获

我们展示了如何利用微电极阵列在啮齿类动物脑片上记录并进行电调控由4-氨基吡啶诱导的癫痫样活动。定制的记录室可在长时间的实验过程中维持组织的活性。通过定制的图形用户界面实现电极的实时映射以及刺激电对的选择。...

使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

本方案描述了使用多叉线性硅探针记录局部场电位的方法。通过电流源密度分析对信号进行转换，可重建小鼠海马中的局部电活动。利用该技术，可在自由活动的小鼠中研究空间受限的脑节律振荡。...

记录行为小鼠海马中空间限制性振荡

本方案旨在演示如何结合 体外...

将微流控技术与微电极阵列结合用于研究神经元通讯及轴突信号传导

本方案描述了从小鼠中制备表现出自发尖波涟漪活动的水平海马-内嗅皮层（HEC）切片的方法。切片在简化的界面式孵育室中孵育，并在浸没条件下用快速流动的人工脑脊液进行记录，以促进组织供氧及网络水平自发活动的出现。...

急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动

学习使用穿透式微电极阵列对小鼠海马体进行展开制备，实现全脑区神经活动的同步记录。该技术可监测横向与纵向的神经信号传播，为研究海马体神经动力学机制提供新方法。

利用穿透式微电极阵列在展开的海马体标本中研究神经活动传播

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