Name: 原发灶和MEF细胞分离，研究肺转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 学习从小鼠乳腺肿瘤中分离原代细胞、提取肺组织观察转移灶以及制备胚胎成纤维细胞的方法。该技术利用多瘤病毒中T抗原转基因小鼠模型研究乳腺癌发生机制，为肿瘤生物学研究提供重要的实验手段。

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我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）、LACaTS 和奥希纳诊所基金会提供的经费支持。

所有小鼠实验均按照路易斯安那州立大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行。所有器械在解剖前必须经过高压灭菌。
1. 小鼠乳腺肿瘤原代细胞的制备
<ol>
	<li>使用经基因工程改造的小鼠模型，该模型携带小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT转基因小鼠），可如先前所述自发形成肿瘤 6.</li>
	<li>使用异氟烷（99.9%）处死小鼠，并喷洒75%乙醇以确保无菌环境（图1A).</li>
	<li>从尿道口区域开始，用剪刀向颈部方向剪开皮肤。将皮肤固定，以便于暴露和接触器官。图1B).</li>
	<li>分离乳腺肿瘤组织，用冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤图1C).</li>
	<li>将肿瘤转移至无菌的10 cm组织培养皿中，使用无菌剃刀片和剪刀将其切成约1 mm大小的组织块3 组织块。后续步骤应在无菌超净工作台中进行。</li>
	<li>将切碎的肿瘤组织与溶于无血清DMEM培养基的胶原酶在37 °C、摇床上孵育2小时，胶原酶终浓度为1 mg/ml。将肿瘤组织悬液在300 × g离心3分钟&#160;200 × g 
	注意：胶原酶孵育对于组织的酶解离至关重要。</li>
	<li>弃去上清液，用 PBS（pH 7.4）洗涤沉淀物 3 次，每次离心 3 分钟&#160;在200 × g条件下离心。最后一次洗涤后，倒出上清液。</li>
	<li>用2 ml重悬组织&#160;胰蛋白酶EDTA处理5分钟&#160;在37 °C下振荡孵育。将悬液离心3分钟&#160;在200 × g下重复洗涤步骤。</li>
	<li>将组织沉淀重悬于正常生长培养基（DMEM，10% FBS，2×青霉素/链霉素）中，接种至10 cm培养皿。接下来3天每天更换培养基。培养细胞至获得所需细胞数量。 
	注意：约 1x107 通过该操作可分离得到细胞。与其他小鼠乳腺肿瘤发生模型（如 MMTV-Neu）相比，MMTV-PyMT 模型获得的细胞数量更高。当使用产率较低的模型时，建议从较大的肿瘤组织开始，并延长细胞培养时间。</li>
</ol>
2. 小鼠肺组织提取以观察肺转移
<ol>
	<li>在取出肺脏之前，先移除肝脏和膈肌。操作时需避免扰动肺组织。</li>
	<li>使用精细剪刀，剪开靠近颈静脉的气管上段。</li>
	<li>通过气管插入导管，注入1 ml Z-fix或印度墨汁等灌注剂，使肺充分充盈（图2A）。将经Z-fix固定的肺组织包埋于石蜡中。</li>
	<li>将注入印度墨汁的肺组织置于Fekete溶液（100 ml&#160;70%乙醇，10 ml&#160;10%缓冲福尔马林，5 ml&#160;冰醋酸）中脱色5分钟。以直径≥0.5 mm为标准，界定继发部位的肿瘤结节，并判定为转移灶。 
	注：由于肿瘤阻塞支气管和细支气管，肿瘤结节无法吸收15%印度墨汁，因此正常肺组织呈黑色，肿瘤结节则呈白色7。此方法可清晰显示单个肿瘤结节（图2B）。</li>
</ol>
3. 从小鼠胚胎制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
<ol>
	<li>使用异氟烷（99.9%）处死怀孕小鼠，并喷洒75%乙醇以确保无菌环境。</li>
	<li>用剪刀从尿道口区域至颈部剪开皮肤，从子宫中分离出胚胎。</li>
	<li>剪开皮肤时需小心，避免扰动胚胎。</li>
	<li>取出子宫角，并在冰冷的无菌PBS（pH 7.4）中冲洗。</li>
	<li>非常小心地将胚胎与其胎盘分离，并将胚胎置于含有冰上预冷PBS（pH 7.4）的10 cm培养皿中。</li>
	<li>去除胚胎的头部、肝脏和肠道，将剩余部分放入含有PBS（pH 7.4）的12孔组织培养板中。</li>
	<li>将胚胎躯体转移至另一含有胰蛋白酶EDTA的12孔板中，使用无菌剃刀片和剪刀将其切成小块（约1 mm3）。加入5 ml胰蛋白酶EDTA，在37 °C孵育5 min&#160;。</li>
	<li>通过向切碎的胚胎中加入1 ml胎牛血清（FBS）以灭活胰蛋白酶。将悬液以200 × g离心10 min，小心吸去上清液，用1 ml温热的DMEM培养基重悬沉淀，并将全部内容物转移至含有10 ml&#160;DMEM（含20% FBS和2×青霉素/链霉素）的10 cm培养皿中。</li>
	<li>连续两天每天更换一次培养基。继续培养细胞直至达到所需细胞数量。</li>
</ol>

<ol><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li>
<li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li>
<li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
<li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioche%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Me%22%5BJournal%5D)">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Re%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li>
</ol>

作者无披露信息。

本方案用于从新鲜的小鼠肿瘤中分离原代细胞。通过该方法制备的裂解液可用于蛋白质、DNA和RNA分析。原发性乳腺肿瘤的癌细胞常转移至脑、肺和骨骼1。本文还包括一种用于检测转移的肺组织提取技术。使用墨水染色肺组织可使肿瘤结节可视化，如图2B所示。将肺组织固定于Z-fix溶液中，可制备肺组织切片，并使用适用于研究转移机制的抗体进行染色。此外，本文还提供了一种小鼠胚胎成纤维细胞的分离方案。该方法可用于在同一动物类型中比较原发性肿瘤细胞与胚胎成纤维细胞的基因表达。
在原代细胞和MEF的制备过程中，最关键的步骤是组织的切碎。如果未能充分切碎，将导致细胞数量偏低。若获得的细胞数较少，仍可继续按照方案操作，但需要延长细胞培养时间。在肺组织提取过程中，适当的染色与脱色至关重要，以便观察肿瘤结节。若要从肺组织中提取RNA/蛋白质，建议使用未经染色和固定的肺组织。然而，RNA也可从固定过的组织中提取8。
由于乳腺癌的转移阶段对患者构成最大威胁2，因此可...

转移是乳腺癌进展的最后一步1。该过程包括一系列步骤，恶性细胞从原发肿瘤中释放并扩散至其他器官2。这些细胞必须能够侵入血管、在循环中存活、迁移到远端器官并在此新器官系统中存活3。肿瘤发生过程中的每一步均由细胞通过多种遗传和表观遗传改变进行严密调控4。为了研究乳腺癌肿瘤发生的机制，研究人员已采用小鼠模型，因其寿命短、体型小且繁殖周期快。在癌症研究中使用小鼠模型的一些主要优势在于其与人类在分子和生理上的高度相似性5。
已建立的小鼠和人类细胞系在乳腺癌研究中被广泛使用。尽管利用这些细胞可以获得有关转移过程某些步骤的信息，但通过基因改造的动物模型（携带肿瘤抑制基因/癌基因）能够提供关于从胚胎阶段开始的肿瘤发生和转移的更为详尽的信息。因此，利用这些小鼠模型，我们可以获得肿瘤生长过程中的遗传和发育调控机制。此外，肿瘤微环境在肿瘤细胞基因表达中也起着重要作用，而使用已建立的细胞系进行研究时，往往难以模拟出相同的生物学情境。原代人乳腺肿瘤也可用于研究小鼠乳腺肿瘤的发生。使用分离的乳腺肿瘤的主要缺点在于，新植入的肿瘤缺乏小鼠自身的血管系统和淋巴组织。相比之下，用于研究乳腺肿瘤发生的遗传性小鼠模型系统则能够让我们监测转移的各个步骤，分析肿瘤微环境，并对整个机体进行系统性观察5。
本实验方案的总体目标是研究小鼠中的乳腺肿瘤发生。已知乳腺癌通常会转移至脑、肺和骨。本方案可用于分离原代乳腺肿瘤细胞，并研究乳腺癌向肺部的转移。此外，还包括一种从小鼠胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的实验方案。这些技术共同为研究小鼠乳腺肿瘤发生提供了有力工具。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life&amp;nbsp; technologies</td><td>25300-062</td><td>&amp;ndash;20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>&amp;ndash;20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>&amp;ndash;20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Life&amp;nbsp; technologies</td><td>15140-122</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>&amp;ndash;80 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td>ANATECH</td><td>#174</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>印度墨水</td><td>Yasutomo</td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td>AERRANE（异氟烷）</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>室温保存</td></tr></tbody></table>

原发性肿瘤和mef细胞分离用于肺转移研究

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

在乳腺肿瘤发生过程中，疾病的转移阶段对患者构成最大威胁。基因型发生改变的正常乳腺细胞现在具备了侵袭其他组织并在其中存活的能力。在本方案中，将切除小鼠乳腺肿瘤，并从肿瘤组织中制备原代细胞。通过该操作分离得到的细胞可用于基因表达谱分析实验。为了成功发生转移，这些细胞必须能够侵入血管、在循环系统中存活、穿出血管到达远端器官，并在新的器官环境中存活下来。肺是乳腺癌转移的典型靶器官。已发现一组基因可介导转移对肺组织的选择性。本文描述了一种利用基因工程小鼠模型研究肺转移的方法。此外，还包括一种从小鼠胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的实验方案。来自同种动物的MEF细胞为非癌细胞的基因表达提供了线索。综合而言，这些技术在研究小鼠乳腺肿瘤发生、相关信号机制以及胚胎发育异常的通路方面具有重要应用价值。

处死动物的时间点取决于具体研究设计和IACUC指南。在图1A中，一只携带小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT）的100日龄C57BL/6小鼠在三个月龄时被处死。用剪刀从尿道口区域向颈部剪开皮肤，并将皮肤固定，以便于暴露器官，如图1B所示。这使得可以方便地获取肿瘤，如图1C所示。从肿瘤中获得的原代细胞如图1D所示。由于多种基因介导乳腺癌向肺转移1，我们提取了肺组织（图2A）以研究转移过程。肺组织用Z-fix固定液灌注，并用印度墨水染色（图2B），以可视化肿瘤结节。图3展示了从小鼠FVB品系胚胎中分离得到的小鼠胚胎成纤维细胞。
<img alt="小鼠解剖示意图，标示出突出的解剖结构；生理结构研究。" src="/files/ftp_upl...

本实验方案的目的是研究乳腺肿瘤的发生。通过该技术，可切除小鼠乳腺肿瘤并从肿瘤组织中分离制备原代细胞。本方案还包括肺组织提取步骤，用于研究肺转移。此外，还提供了从小鼠胚胎中分离分析小鼠胚胎成纤维细胞的另一套实验方案。

原发性肿瘤和MEF细胞分离用于肺转移研究

在乳腺肿瘤发生过程中，疾病的转移阶段对患者构成最大威胁。具有异常改变的正常乳腺细胞……

本实验的总体目标是在小鼠中研究乳腺癌肿瘤的发生。首先，演示如何从小鼠乳腺肿瘤中制备原代细胞。接着，介绍如何提取小鼠肺组织以观察肺转移。最后，展示从小鼠胚胎制备小鼠胚胎成纤维细胞的方法，因为这些方法表明，携带小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原（mouse mammary tumor virus polyoma middle T antigen）的转基因小鼠可用于研究乳腺癌肿瘤的发生。尽管该方法可为乳腺癌研究提供见解，也可应用于其他实体瘤的研究。该方法的可视化演示至关重要，因为在肿瘤分离步骤中，必须仅分离肿瘤组织而避免其他组织。首先使用剪刀从小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原转基因小鼠的尿道口向颈部剪开皮肤。然后固定皮肤并分离乳腺肿瘤。用预冷的 PBS 原位清洗肿瘤，并将肿瘤置于无菌的 10 厘米组织培养皿中。接着，将培养皿转移至无菌的超净工作台，使用无菌剃刀片和剪刀将肿瘤切成每块 1 立方毫米的小块。将组织块与胶原酶在37摄氏度的摇床上孵育。两小时后，离心所得肿瘤组织悬液。用PBS重悬液再洗涤沉淀物三次，最后一次洗涤后，加入两毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度下振荡孵育五分钟。然后将细胞再洗涤三次，并重悬于正常生长培养基中。最后，将细胞接种于10厘米的组织培养皿中，在接下来的三天内每天更换培养基，直至获得所需细胞数量。在提取肺之前，先移除肝脏和膈肌，并松解肋骨。然后打开气管上部，靠近颈静脉处，使用导管经气管注入适当试剂以灌注肺部，取出肺组织。若使用Z fix固定液，将组织包埋于石蜡中；若使用印度墨汁，则将组织置于碘化乙醇溶液（ec solution）中固定五分钟，正常肺组织将呈黑色，而肿瘤结节则呈白色。将任何在继发部位观察到的直径大于或等于0.5毫米的肿瘤结节归类为转移灶，用于制备小鼠胚胎成纤维细胞。首先，从怀孕小鼠的尿道口向颈部切开皮肤，操作方式如前所示，注意不要扰动胚胎。接着，取出子宫角并在无菌 PBS 中冲洗。然后，小心地将胚胎与胎盘逐一分离。将每个胚胎置于含有冰冷 PBS 的 10 厘米培养皿中。去除头部、肝脏和肠道后，将胚胎剩余部分在含有 PBS 的 12 孔组织培养板的一个孔中冲洗，然后切成 1 立方毫米大小的组织块。转移至另一含有 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 的孔中，并于 37 °C 下孵育组织。孵育五分钟后，加入一毫升胎牛血清以终止消化反应。然后离心所得的细胞悬液，并重悬细胞沉淀。将细胞转移至含有 10 毫升添加了抗生素的温 DMEM 培养基的 10 厘米培养皿中，最终在 1 毫升温 DMEM 中重悬，继续培养细胞直至获得所需细胞数量。处死动物的时间点应依据具体研究需求以及I-A-C-U-C指南而定。例如，这只100天大的FVB小鼠携带小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原，在发现肿瘤后三个月处死，如刚才所示的小鼠乳腺肿瘤。已获得原发性肿瘤细胞。由于许多基因介导乳腺癌向肺部的转移，因此肺组织也被取出，以研究转移过程，方法如前所述。随后，肺组织用Z固定液灌注并用印度墨水染色，以观察肿瘤结节。此处展示的是从FVB品系小鼠胚胎中分离得到的小鼠胚胎成纤维细胞。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何分离原代小鼠肿瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞，并提取小鼠肺组织。请务必注意，使用异氟烷（ISO fluorine）可能存在极高危险性，因此必须采取充分的预防措施，例如在进行该操作时，始终应在化学通风橱内进行操作。

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