简化显微操作从法医“接触DNA”证据中回收单个人源生物微粒的增强型遗传分析

本实验的总体目标是从法医接触性 DNA 证据中回收单个或聚集的细胞（称为假定生物微粒），并获得供体的 DNA 谱型。在暴力犯罪发生过程中，少量细胞会从一个人转移到另一个人身上，例如袭击者抓住受害者手腕时。为了首先回收这些少量细胞，需使用附着在显微镜载玻片上的低吸附性凝胶膜对接触区域进行取样。

第二步是将转移的生物颗粒进行染色，以便在显微镜下更清晰地观察。接着，利用显微操作技术从凝胶膜上分离生物颗粒。在钨针尖端收集水溶性粘合剂，并用其从凝胶膜表面移取感兴趣的生物颗粒。

最后一步是将分别收集的生物微粒小心转移至PCR采集管底部的PCR扩增混合液中，最终通过增强的DNA分型方法获得微量DNA证据供体的DNA图谱。在我的实验室中，我们专注于研究在暴力人身犯罪过程中——无论是个体与个体之间，还是个体与物体之间——所转移的少量细胞的遗传学分析。传统方法通常难以从如此微量的细胞中成功获取DNA图谱。

本文介绍了一种简化的方法，用于从极少量细胞（包括单个细胞或细胞团）中进行物理回收及遗传分析，该方法可整合到任何法医实验室中。本实验操作将由本实验室的研究生 Katie Fairish 演示。开始该操作前，需准备用于收集生物微粒的凝胶膜。

将凝胶膜裁剪至适合用作固体支撑的玻璃载玻片所需的大小。例如，对于3英寸×1英寸的玻璃载玻片，使用2英寸×0.75英寸的凝胶膜。撕去凝胶膜的白色背衬，将凝胶膜贴附到载玻片上，并用力按压以确保完全贴合。

请注意，凝胶膜表面有一层明显的顶层保护层，不可去除，以便在施加压力时保护凝胶膜表面不受污染。带有保护层的制备好的凝胶膜载片可在室温下保存，直至使用。当准备使用凝胶膜时，用无菌镊子小心移除顶层透明保护膜。将凝胶膜表面直接接触目标物体或表面。

例如，从手腕处采集人体皮肤样本。施加轻微压力，以确保生物颗粒高效转移至凝胶膜上。切勿施加过大压力，以免玻璃载片破碎。对同一物体或表面的多次采样可按相同方式收集到同一片凝胶膜上。同样，也可从物体和衣物（如衬衫衣领）等物品上采集生物颗粒。

为了确认生物颗粒转移到凝胶膜上，使用透射或落射照明在体视显微镜下检查载玻片。约 20 × 的放大倍数最适合观察凝胶膜的较大区域，而约 200 × 的放大倍数最适合观察单个生物颗粒。将凝胶膜样品载玻片置于室温下，保存在带盖的载玻片盒中。

在准备染色或生物颗粒收集之前，可对生物颗粒进行染色以辅助观察。首先，将如前所述制备好的凝胶膜样品载玻片放置于水槽上方的载玻片染色架上。使用一次性移液管将台盼蓝染色液覆盖整个凝胶膜表面，在室温下孵育一至两分钟。

如有需要，可倾斜载玻片以去除多余的染料，使染料流入水槽。可使用一次性移液管轻轻用无菌水冲洗载玻片。待载玻片自然晾干后，使用体视显微镜观察载玻片，以确保染色适当。

染色后的玻片可置于带盖的玻片盒中，于室温下保存。开始本操作前，将适当数量的0.2毫升PCR管放入试管架中，并正确标记各管。根据所需样本数量，配制适量的STR扩增混合液。

涡旋并充分混匀，在小型离心机PI路径中短暂离心。将3.5微升扩增混合液加入每个0.2毫升管盖中，每管轻轻盖上管盖。

将一块双面胶带直接贴到玻璃块上。这将用于在样品采集过程中固定0.2毫升的离心管。再将另一块双面胶带贴到一块干净的玻璃显微镜载玻片上。

然后将一段水溶性波纹肩带贴在双面胶带上。通过沿胶带长度方向施加压力，固定胶带位置。随后可移除顶部的保护性白色层。

接下来，将第一个0.2毫升离心管放置在玻璃块上的双面胶带上。将此管放置一旁，待样本采集完成后使用。将水溶性波导胶带载玻片置于显微镜下，先用低倍镜观察。

使用舌片架针的尖端轻轻刮取胶带表面，以在针尖端收集少量或球状的粘合剂。粘合剂球的大小取决于需收集的生物颗粒数量。小心地移除舌片。

从显微镜下方将带有粘合剂的针头竖立起来，注意不要触碰针尖。如有需要，可将针头放置于支架中。该操作步骤中最关键的部分是生物颗粒的收集与转移。

为了确保成功，必须反复练习这些技术，直到分析人员熟练掌握为止。将一块预先制备好的凝胶薄膜样品置于显微镜载物台上，并使用玻璃块支撑载玻片。调节焦距和放大倍数，直至能够清晰观察到生物颗粒。

确定将要采集的生物颗粒。取出带有粘性小球的钨针，将其置于凝胶膜表面目标生物颗粒所在的位置。下压针尖，使其与生物颗粒接触。

抬起针头以确认已收集到生物颗粒。重复此过程，直至收集到所需数量的生物颗粒。将预先准备好的0.2毫升PCR管放置在显微镜载物台上。

调整放大倍数，使装有扩增混合液的试管底部处于焦点位置。在显微镜下观察的同时，小心地将钨针插入0.2毫升PCR管中，直至针尖进入扩增混合液。将针头保留在扩增混合液中，直至粘合剂溶解，并观察到生物颗粒释放到溶液中。

取下针头。将0.2毫升离心管直立放置并松开管盖。使用预先浸湿的酒精擦拭巾清洁钨针，并对其他样品重复此收集步骤。

为启动对所收集生物微粒的常染色体STR分型增强扩增流程，向每个含有扩增混合液和生物微粒的0.2毫升离心管中加入1.5微升裂解缓冲液，并 tightly 封闭管盖。将样本置于热循环仪中，按照本方案文本所述的循环条件进行扩增。扩增完成后，将扩增产物保存在4°C，待后续通过毛细管电泳进行检测。

未展示衬衫衣领样本中单个生物颗粒的代表性图像。所收集的生物颗粒已用圆圈标出。红色圆圈表示已成功获取其图谱。

包含等位基因回收率的百分比。黑色圆圈表示未获得图谱。类似地，这些图像显示的是衬衫衣领样本中聚集的生物微粒，此处展示的是从该衬衫衣领的一个单独生物微粒样本中获得的短串联重复序列（STR）图谱。

通过与参考图谱进行比较，确定其准确性。每个位点的每个峰下方均标示了等位基因编号。横轴表示片段大小，纵轴表示信号强度。

该图谱质量较高，各基因座间的峰高相对均衡，且无等位基因脱扣现象。下一个图谱是从衬衫领口聚集的生物微粒样本中获得的一个完整的STR图谱。最后，本图显示了单个生物微粒DNA分型失败的示例，其等位基因检出率为3%。

该方法应有助于从人身攻击案件的攻击者身上回收单一来源的DNA谱型。我们注意到，该方法还消除了与混合DNA谱型的解释和解卷积相关的一些问题。